■研究法	│遺伝子導入 transgenesis│

　←→　エピジェネティックス/遺伝子/タンパク/神経幹細胞/発生/細胞周期/顕微鏡/マウス　参考1

　→遺伝子改変動物（ES/iPS/キメラ）
　→遺伝子導入（ウイルスベクター/エレポ/マイクロインジェクション/トランスフェクション/レポーターアッセイ）
　→遺伝子組換え（Cre-loxPシステム/Tetシステム/Rosa26）　→Supernova法
　→ゲノム編集（ZFN/TALEN/CRISPR Cas9）
　→遺伝子サイレンシング（トランスポゾン/piggyBAC/RNA干渉）
　→解析法（ブロッティング/PCR/ELISA/IP/FISH/FACS/ChIP/マイクロアレイ/NGS/RNA-Seq/CAGE法）
　→オプトジェネティクス/ケモジェネティクス（DREADD）
　→遺伝子関連（構造遺伝子/調節遺伝子/ハウスキービング遺伝子/CpGアイランド/遺伝子重複/マーカー遺伝子/薬剤耐性遺伝子レポーター遺伝子
　　ゲノム/クロマチン/ヌクレオソーム/2本鎖DNA/ニック/
　　プロモーター /エンハンサー/メディエータ/サイレンサー/インデューサー/オペレーター/マルチクローニングサイト/IRES/キャップ/コザック配列/
　　プラスミド/プライマー/ベクター/マーカー遺伝子/インターカレーター /融合タンパク/タグ/形質転換/コンピテントセル/トランスフォーマント/トランス遺伝子/レポーター遺伝子
　→RNA（開始コドン/ シャイン・ダルガノ配列/ 終止コドン/ tRNA/ 単鎖RNA/ ノンコーディングRNA/ マイクロRNA/ リボソームRNA/ ステム・ループ構造/ 短鎖干渉RNA/ RNA干渉/ 短鎖ヘアピンRNA(shRNA)/ ポリA鎖/スプライシング/RNA編集/RNAscope/RNA結合タンパク/核内低分子リボペプチド） /完全長cDNA
　→クローニング/遺伝子関連酵素/培養細胞株/培地/継代/ATP assay
　→多型/SNP/
　→BSL



順遺伝学 forward genetics 従来の遺伝学の手法であり、「phenotype-driven」アプローチと呼ばれることもある。 変異マウスを用いて表現型からその原因となる遺伝子を探りあてる遺伝学 遺伝性がみられる形質（表現型）からその原因となる遺伝子を探り当てる研究を指す。

逆遺伝学 reverse-genetics　参考1 遺伝子を改変して表現型との関連を探るアプローチ 特定の遺伝子の配列情報や特定の遺伝子を破壊・欠損させることよって生物に生じる現象から、その遺伝子が関与する機能や生物の体内における働きを特定するという研究手法 リバースジェネティクスの研究分野が成立した背景には、フォワードジェネティクスを中心とした歴史ある従来の遺伝学的手法による多くの実験研究の蓄積、ヒトをはじめいろいろな生物で得られたゲノム解析の成果などがあった。 しかし、この研究が大きく発展した具体的な要因として特筆すべきは、ノックアウトマウスの作出である。 リバースジェネティクスの研究には、特定の遺伝子だけを選択的に破壊または欠損させた実験動物が必要だからである。 ノックアウトマウスとは、染色体上のある特定の遺伝子をほかの遺伝子と置き換えた実験動物であり、1989年に世界で初めて開発された。 このことは、リバースジェネティクス研究において画期的な出来事となり、ノックアウトマウスを開発したイギリスとアメリカの研究者3人（Mario R. Capecchi 、Oliver Smithies 、Sir Martin J. Evans）は、その業績により2007年にノーベル生理学医学賞を受賞した。




●gain of function解析 トランスジェニック、ノックイン レトロウイルスベクター、エレクトロポレーション法

○loss of function解析 ノックアウト、ノックダウン ゲノム編集、RNA干渉



• 遺伝病の発症のメカニズム　→SCN9A

  機能獲得型変異による障害　gain-of-function disorder 常染色体性優性遺伝病が比較的多い。 核内のRNA制御の異常やタンパク質の構造異常などにより、核内の封入体や細胞内の異常タンパク質の蓄積が生じて、疾患の発症につながる。

  機能喪失型変異による障害　loss-of-function mutation 遺伝子機能がなくなることによる障害

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●遺伝子改変動物　genetically modified animal

• 遺伝子工学を用いて人為的に個体の遺伝情報を変化させた動物

  遺伝子組換え生物 Genetically modified organism：GMO 遺伝子工学の技術を用いて遺伝子を操作された生物 組換えDNA 技術を用い、DNA 分子に別の種類の遺伝子を組み込み、新しい組み合わせのDNA 分子を導入した生物

  トランスジェニック動物 transgenic animal ←→遺伝子導入 分子生物学におけるトランス（Trans-）とは、「異なる分子の間で機能する」の意味である。 トランスジェニック動物とは外部から特定の遺伝子を人為的に導入した動物 トランス遺伝子を宿主のゲノムに人為的に組み込み、これが世代をこえて受け継がれる動物 宿主がもたないタンパク質を発現させたり、野生型あるいは変異型のタンパク質を過剰に発現させる目的で作製される。

  ノックイン動物 任意の遺伝子座に外来遺伝子を導入した動物 コンベンショナルノックイン ・点変異／・カセット挿入 コンディショナルノックイン ・ミニジーン手法／・ 逆位法／・ Rosa26 過剰遺伝子発現

  ノックアウト動物 遺伝子操作により1つ以上の遺伝子を欠損（無効化）させた動物 特定の遺伝子を破壊して欠失させた動物 内在性の遺伝子が破壊されたマウスの総称として使われていて、点変異によるフレームシフト、ナンセンス変異、ミスセンス変異による機能の欠失 ゲノム編集技術などにより遺伝子を破壊されたマウスを含む。 一般的には、内在性の遺伝子を破壊したES細胞からキメラマウスを介して生殖系列に変異した遺伝子を伝達するマウスをさすことが多い． 相同組換えを利用する。 導入したい遺伝子の前後にゲノム上の目的部分の前後と同じDNA配列をつなぐと、稀に外来遺伝子がゲノム上の目的部分を置換する形で挿入される。これを利用し、外来遺伝子をゲノム上の特定の遺伝子の必須な部分と置換させることで、その遺伝子を破壊する。 相同組換え DNAの塩基配列がよく似た領域（相同部位）で起こる組換え 二本鎖のDNAには、切断や変異が起こっても相補鎖を元に修復する機能が備わっていて、これらの性質を応用して目的の場所の遺伝情報を変える技術 コンベンショナルノックアウト 単純遺伝子破壊 conventional knockout 標的領域をネオマイシン選択カセットやレポーター遺伝子と置き換えることにより、遺伝子は全ての組織で常に不活化される。 コンベンショナルな遺伝子欠失は胚性致死の原因となるので、コンディショナルノックアウトが開発された。 コンディショナルノックアウト 条件付き遺伝子破壊 conditional knockout 特定遺伝子についての臓器・時期特異的な欠失 主に、遺伝子を欠損することで胎生致死や出産直後致死となる分子の機能解析や成体での遺伝子の機能解析を目的として作製される。 Floxed mouseと、特定の組織でCreやCRE-ERT2を発現するCreドライバーマウスとを掛け合わせる。 Cre-loxPシステムを用いることで特定の条件下でのみ遺伝子ノックアウトすることが可能になる。 Floxed mouse ←→Creドライバーマウス/R26rマウス 特定の遺伝子の前後にloxP配列を挿入したマウス loxP：DNA組換え酵素Creが認識する34塩基からなるDNA配列 flox ＝ flanked loxp あるDNA配列が両側からloxPとloxpに挟まれている。 flanked：遺伝子の上下流に隣接する floxed：loxPが導入された fl/fl：Creが発現すればKOとなる。 Δ（デルタ）：その遺伝子を持っていたが（遺伝子操作で）欠損させた。 Creドライバーマウス ←→レポーターマウス/Floxed mouse/nestin-Creマウス/Emx1-Creマウス 特定の細胞・組織でCreを発現させるトランスジェニックマウス Creは2つのloxP配列を認識すると、両者の間で高効率に相同組換えを起こす。 従って特定の遺伝子の前後にloxPを挿入することによって、Cre存在下でその遺伝子は切り出されて、破壊される。 レポーターマウス ←→レポーター遺伝子/Rosa26 reporter mice 蛍光タンパク質を発現させることで特定の細胞・組織を可視化したトランスジェニックマウス tdTomatoレポーターマウス ←→tdTomato 大塚正人先生（東海大学）のラボが開発したトランスジェニックマウスの1つ CAGプロモーター下に連結した赤色蛍光タンパクtdTomatoのcDNAをRosa26遺伝子座上に導入することにより作製されている。 tdTomatoレポーターマウスは、Cre存在下でtdTomatoを発現する。 CAG stop tdTomato Creドライバーマウスとを掛け合わせることで、部位特異的に蛍光を発するマウスが生まれる。 CAG tdTomato →tdTomatoレポーターラット

  ノックダウン 特定の遺伝子の転写量を減少させる操作を指すことが多いが、翻訳を阻害する操作についても用いられる。 ノックアウトは遺伝子そのものの破壊であるのに対し、ノックダウンは遺伝子の機能を大きく減弱させるものの、完全には失わせない。 問題点 ノックアウトとは異なり遺伝子の発現が残るため、ノックダウンした結果として調べた現象に対して効果がなくても、その遺伝子がその現象に対し関与していないとは結論できない。 利点 ノックダウンは実験的に容易にかつ短期間のうちに結果を得ることができることから、ノックアウト実験をするかどうかの指標にまず、ノックダウン実験が行われることが多い。 RNA干渉

  キメラマウス chimera mouse 2つ以上の異なった遺伝子型の細胞、あるいは異なった種の細胞から作られた1個の個体をキメラと言う。 同一個体内に遺伝的に異なる細胞が混ざること。ES細胞を初期胚に移椊すると、マウスES細胞が混じった個体が得られ、発生するとキメラマウスが誕生する。 培養したES細胞に外来遺伝子を導入する。その中から相同組換えが確認されたES細胞を選び、発生初期の胚盤胞期胚（blastocyst-stage embryo）に注入すると、全身の一部の細胞が注入したES細胞に由来するキメラマウスが得られる。 このキメラマウスの次世代で、全身の全ての細胞が外来遺伝子を含むマウスを得ることができる。

  
  

  一塩基バリアント　single nucleotide variants：SNVs　→SNPs（single nucleotide polymorphysms） 単塩基置換の変異

  Indel（insertion/deletion） 塩基の挿入または欠損による遺伝的変異 SNVs/SNPsは単塩基置換の変異であるのに対して、Indelは塩基の挿入または欠損による遺伝的変異のことをいう。 RNA-Seqなどで検出できる。

  コピー数多型 CNVs（copy number variations）：CNV 　←→遺伝子重複/一塩基多型 染色体の微小な欠損または重複によって引き起こされる。その領域にある遺伝子のコピー数が変化するような遺伝的変異のことをいう。 CNVが起こる領域は通常稀なリピート配列に挟まれていることが多い、 ある集団のなかで1細胞あたりのコピー数が個人間で異なるゲノムの領域のことを言う。 発見者のチャールズ・リーが命名した。 通常は1Kbp以上の長さの領域とされる。 ゲノムDNAの数の多型としては、他にindel、VNTR（Variable Number of Tandem Repeat）、マイクロサテライトなどが知られているが通常これらはすべて1Kbp以下のサイズである。 コピー数多型は、対象に比較して相対的にコピー数が多い場合と少ない場合がありそれぞれ重複、欠失と呼ばれる。特に集団のなかで1%以上の頻度を持つものをCNP、(Copy Number Polymorphism)と呼ぶ。

●多能性幹細胞 pluripotent stem 　←→幹細胞/多能性

• 分化能として多能性をもつ細胞を多能性幹細胞と呼ぶ。
• 胚性がん細胞：ECが歴史的にはじめて体外で培養された多能性幹細胞
• 多能性幹細胞は「ナイーブ型」と「プライム型」分類されている。

  ナイーブ型----マウスES細胞

  プライム型----ヒトES細胞：hESC、エピブラスト幹細胞

  
  

  ●人工多能性幹細胞 induced pluripotent stem cells：iPS細胞 体細胞に特定因子を導入することにより樹立される、ES細胞に類似した多能性幹細胞 山中伸弥博士（2012年にノーベル生理学医学賞を受賞）らは2006年にOct3/4遺伝子，Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、c-Myc遺伝子の4つの遺伝子を導入することで体細胞を初期化することにより、iPS細胞を作製した。 レトロウイルスベクターで4つの転写因子を線維芽細胞に導入してiPS細胞を作製していたが、がん原遺伝子c-Mycによる腫瘍発生が懸念されていた。 第二世代マウスでも、高率にがんの発症がみられ、患者に移椊した後にがん化するリスクが指摘された。 ヒトiPS細胞樹立の報告のわずか10日後、同じく京都大学の山中伸弥教授らのグループにより、c-Mycを除く、Oct3/4、Sox2、Klf4の３遺伝子を用いて、大人のマウスおよび成人皮膚細胞からiPS細胞が樹立できることが示された。 後に山中教授らは、c-Mycの代わりにGlis1を使う方法で、より安全かつ高効率での初期化を成功させた。　参考1

  胚性がん細胞、胚性癌腫細胞　embryonal carcinoma cell：EC cell 胚性がん細胞は歴史的にはじめて試験管内で培養が可能となった多能性幹細胞 1960年代、マウス悪性奇形腫：テラトカルチノーマの中に活発な増殖能をもつ未分化な細胞が存在することが知られていた。 Ralph L. Brinster（1932/3/10〜, 米国の遺伝学者）が1974年にテラトカルチノーマをマウス胚に導入して個体発生ができることを証明した。 奇形がん腫から樹立された胚性がん細胞は、三胚葉を含む奇形がん腫を形成することが示された。 1991年にマウス胚性がん細胞をニューロンに分化させた際に発現が著しく増加する新規タンパク質としてNecdin：NDNが発見された。 悪性奇形腫、奇形がん腫、テラトカルチノーマ　teratocarcinoma　←→テラトーマ 「terato」とは、「奇形」を意味する接頭語 いくつかのマウス系統では精巣や卵巣に悪性奇形腫が自然発生することが見つかり、この腫瘍細胞を培養することによって、いろいろな種類の細胞に分化するもとになる幹細胞の細胞株が樹立された。 Leroy Stevensがテラトカルチノーマ細胞系を確立した。 未分化F9テラトカルチノーマ細胞はレチノイン酸あるいはレチノイン酸 ･ジブチリルcAMP混和物を作用させることにより、近位内胚葉および遠位内胚葉に分化することが知られている。 胚性幹細胞、ES細胞 embryonic stem cell：ES cell マウスの着床前の胚から樹立 内部細胞塊から単離された初期胚由来の幹細胞で、未分化の状態を無限に維持できる能力を持ち、またすべての種類の細胞に分化できるという特徴がある。 内部細胞塊から樹立されるES細胞の維持にTet1が必要 EC細胞↑の知見に基づき、Martin John Evans（1941/1/1から イギリスの科学者、2007年ノーベル生理学医学賞受賞）は1981年に、マウスの胚盤胞の内部細胞塊からES細胞が樹立した。 マウスES細胞は、1981年の最初の樹立の報告においては、通常の血清含有培地を用い、マウス胎仔から採取した線維芽細胞の上で重層培養されていた。 マウスES細胞に対してLIFは分化抑制の効果示し、培地へのLIFの添加により、線維芽細胞との重層培養なしに、ゼラチン基質の上でマウスES細胞の多能性を維持することができた。 Klf4はLIF非存在下でマウスのES細胞の分化を抑制する。 ES細胞においては特にKlf2，Klf4およびKlf5が重複した機能を持つことにより自己複製能を維持している。 ES細胞の開発により、遺伝子操作を次世代の個体へと伝達する道が拓かれ、特定の遺伝子機能を喪失したノックアウトマウスの作製が可能になった。 マウスES細胞はナイーブ型であり、多能性維持にはLIF/STAT3シグナルに依存した転写因子の制御が必要 マウスのES細胞はLIFの存在下では未分化性を保ちながら自己複製するのは対して、LIF非存在下では神経、血球、脂肪細胞などの特定の細胞系譜に従って分化する。LIFを除いた培地でES細胞を浮遊培養すると、ES細胞の集合体である胚様体が形成され、胚様体中の細胞が徐々に胚体外内胚葉や原始外胚葉へと分化していく。 胚様体　Embryoid body；EB ES細胞やiPS細胞などを浮遊培養するとボール状の細胞塊を形成する。 この状態で2週間程度培養すると、様々な細胞種への分化が観察される。 細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の一つとして用いられている。 マウスES細胞の多能性を規定する分子機構　参考1 LIFシグナル伝達経路による多能性維持の機構 　LIFシグナルはJak-Stat経路、PI3キナーゼ-Akt経路、Grb2-MAPキナーゼ経路の3つのシグナル伝達機構を活性化し、異なる入力を転写因子ネットワークに与える。 FGFシグナル伝達経路による分化誘導の機構 Wntシグナル伝達経路による多能性維持の機構 多能性とエピジェネティクス ヒトでは、受精後　6〜7日目の胚盤胞から細胞を取り出し、それを培養することによって作製 Dr. James Thomson らによって樹立されたヒトES細胞は、細胞膜アルカリフォスファターゼや Oct4 などの内部細胞塊や生殖細胞の形成に欠かせない転写因子を高レベルで発現するが、マウスES細胞とは異なり、発生段階特異的胎児性抗原：SSEA-1 を発現しない。 ヒトES細胞は着床前の初期胚から作製されるにもかかわらず、マウスエピブラスト幹細胞に近いプライム型であり、LIFに反応しない。 作製には受精卵を破壊する必要があり、倫理的な問題がある。 患者自身の細胞から作製することができないため、細胞移椊に利用する際には、免疫拒絶の問題が指摘されている。

  エピブラスト幹細胞 Epiblast stem cell ：EpiSC　参考1 マウスの着床後の胚のエピブラストを単離培養することによって樹立された多能性幹細胞 プライム型多能性幹細胞 エピブラスト幹細胞はエピブラスト細胞に不可欠な特性を示し、原始外胚葉に由来するES細胞とは異なっている。 リアルタイムPCR解析により、1.FGF5とOtx2の増加、 2. Klf4、Rex1とNanogの減少、 3. Oct4の発現が変化しない 　の3点で判断 マウスEpiSCは、ヒトのES細胞と同様に、LIF/STAT3の依存性はなく、FGF2/ERKに依存する。 アクチビンとFGF2に依存して多能性を維持しているが、その転写因子ネットワークへの入力様式は明らかでない。 EpiSCではLIFシグナルおよび多能性幹細胞の性質を規定している可能性がある。 マウスEpiSCはEカドヘリンを一過性に発現させるだけで、その胚盤胞の注入はキメラ胚の形成に寄与した。

  ジャームライン・トランスミッション germline transmission　→生殖細胞系列 ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞が生殖細胞に分化でき、多能性幹細胞由来の遺伝子がキメラを介して次世代に伝わること これにより、全身がその多能性幹細胞に由来する個体が産まれる。 生殖細胞系列　germline 生殖細胞は発生に応じてさまざまな分化段階に分かれる。また雌雄で大きく異なる分化過程を経る。 生殖細胞系列は生殖細胞の源である始原生殖細胞から最終産物である卵子や精子に至るまでの生殖細胞の総称

●遺伝子導入 transgenesis　参考1

分類	方法	長所	短所
生物学的	ウイルスベクター Supernova法	高効率 比較的簡便	汚染の危険性 挿入変異 免疫による不活化
物理的	エレクトロポレーション マイクロインジェクション ソノポレーション レーザー照射	シンプルな原理 適所に導入可能 ベクター不要 導入サイズに制限なし	特殊な器具や装置が必要 核酸が傷つきやすい 経験が必要
化学的	トランスフェクション カチオンポリマー カチオン脂 リン酸カルシウム	比較的高効率 簡便 導入サイズに制限なし 豊富な市販品	化学毒性 細胞種や状態により導入効率が変動 特定細胞への選択的導入は困難



• 伝子導入技術は、遺伝子組換え作物等の作出においても不可欠な技術であるが、この遺伝子導入において問題となるのがそのポジション効果である。つまり、導入遺伝子が挿入された位置の染色体環境の影響により、導入遺伝子の安定した発現が得られないのである。例えば導入遺伝子が不活性クロマチン中に挿入されると、その不活性な環境により導入遺伝子の発現も不活性化されてしまう。

  位置効果 position effect 他の遺伝子との物理的位置の変化により、一つ以上の表現型の発現が変化すること。染色体構造の変化，あるいは交差に起因することもある。 遺伝子が染色体上のどの位置にあるかによって、表現型に生じてくる効果が異なること。遺伝学の原則的な考え方によれば，各遺伝子は独立して形質発現に寄与するが，実際には遺伝子の段階での相互配置により、各種の位置効果が生じる。 レンチウイルスベクターを受精卵に感染させる手法はゲノムの複数の個所に1コピーずつ組み込まれるため、位置効果を相殺することができる。

・ウイルスベクター　←→ベクター/抗ウイルス薬

• ウイルスが持つ病原性に関する遺伝子を取り除き、外来の目的遺伝子を組み込んだのがウイルスベクター
• 生物学的遺伝子導入法
• ウイルス由来のベクターは、遺伝子導入効率の高さから盛んに開発されてきた。
• ウイルスのゲノムに目的遺伝子を導入することで作製した組み換えウイルス
• 目的遺伝子を持つ組み換えウイルスを目的の細胞・組織に感染させることで、外部から効率よく遺伝子を導入することができる。遺伝子治療や、iPS細胞や遺伝子組み換え食品の作成などに応用される。
• 細胞レベルから動物個体レベルでの遺伝子機能解析や、ヒトの遺伝子治療への応用が期待されている。
• ウイルスベクターにはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが応用されている。
  
  

  アデノウイルスベクター Adenovirus Vectors, Adenoviral Vector：AV vector アデノウイルス Adenovirus　←→HEK293細胞 二重鎖直鎖状DNAウイルスで、カプシドは直径約80nmの正20面体の球形粒子をしていて、エンベロープを持たない。 アデノウイルスはライノウイルス等とともに、「風邪症候群」を起こす主要病原ウイルスの一つと考えられている。 アデノウイルスゲノム、AVゲノム アデノウイルスのゲノムは、単一の二重鎖直鎖状DNAからなる。 DNA両側の5'末端にTPタンパク質が共有結合していて、これがDNA複製の際にプライマーとして機能する点が特徴的である。 標準的には長さ26-46 kbpで23-46のタンパク質コード遺伝子を含んでいて、基本的な構造や機能は全てのアデノウイルスに共通している。 Adenovirus early region 1A、Adenovirus E1A　参考1 アデノウイルスゲノムにコードされるe1aは感染初期に宿主細胞内で発現するウイルス性タンパク質 試験管内では、e1aはがん抑制遺伝子産物であるRBを失活させ、細胞の形質転換をもたらす。これにはヒストンアセチル基転移酵素CBP/p300とe1aの結合が必須だが、どのような機能を担っているかは不明であった。 Horwitzらは、e1aが遺伝子活性化と関連するヒストンH3の18番目のリシン（Lys18）のアセチル化を減少させ、この現象がp300/CBPとの結合を必要とすることを見いだした。 さらにFerrariらは、e1aによって宿主細胞内のヒストンH3 Lys18のアセチル化の総量が減少し、また細胞周期や細胞増殖に必要な遺伝子領域では増加、アポトーシスや病原体応答などに関与する遺伝子領域では減少していることを明らかにした。 ヒストンのアセチル化やメチル化は、DNA配列の変化に依らず遺伝子の活性を制御する重要な反応であり、細胞記憶の一端を担うものである。e1aによる記憶書き換えのメカニズムを明らかにすることは、記憶に異常をもつがん細胞の研究にも繋がると期待される。わずか243アミノ酸からなるe1aが宿主細胞の記憶を操るという、ウイルスがもつ巧みな生存戦略の新たな一面が明らかにされた。 組換えアデノウイルスは、細胞側の受容体CARを介したエンドサイトーシスにより細胞内に侵入し、エピソームとして留まり、ゲノムに組み込まれずに目的遺伝子産物を一過性に大量に発現させることができる。 またヒトを含む広範囲の哺乳類細胞に感染する能力をもち、分裂細胞、非分裂細胞を問わず、株化細胞や初代培養細胞、動物個体にも感染させることが可能 である。 CARの発現レベルが低い血球細胞では感染が起こりにくい傾向がある。 コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体　Coxsackie-Adenovirus Receptor：CAR ヒトのアデノウイルスの主要なレセプターは、コクサッキーBウイルスの受容体と同一で、コクサッキー/アデノウイルスレセプターと呼ばれている。 アデノウイルス2型あるいは5型の感染は細胞表面のCARにウイルスのカプシドから飛び出しているファイバーの先端のノブが吸着することにより始まり、細胞表面のインテグリンとファイバーの根本のペントンベースが結合して細胞内に侵入する。

  アデノ随伴ウイルスベクター Adeno-associated Virus Vectors：AAV vector アデノ随伴ウイルス Adeno-associated Virus ：AAV　参考1 AAVはアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス存在下で増殖する非エンベロープウイルスである。 1965年にピッツバーグ大学のDr. Bob AtchisonとNIHのDr. Wallace Roweがアデノウイルス調製中の混入物として発見した。その後の研究により、彼らはアデノ随伴ウイル粒子の複製がアデノウイルス存在下でのみ可能であることに気づき、その名称分類をパルボウイルス科のディペンドウイルス属とした。 AAVはポリメラーゼをコードしておらず、自身のゲノム複製を細胞のポリメラーゼ活性に依存している。 アデノ随伴ウイルスベクターゲノム、AAVゲノム AAVゲノムは一本鎖DNA分子であり、鎖長は約4.7kbで2つの145塩基の末端逆位反復配列（ITR）をもっている。 ITRはそれ自身がワトソン-クリック塩基対を形成し、複製やパッケージングに必要なシス因子を含むT型のヘアピン構造を形成する。 AAVゲノム自体にはREPとCAPのわずか2つの遺伝子のみが存在し、これらは共に3種の構造タンパク質（VP1、VP2およびVP3）と複製に必要な4種の非構造タンパク質（Rep78、Rep68、Rep52およびRep40）をコードしている。 Repタンパク質は全てヘリカーゼ活性をもち、カプシド形成を引きおこすために必須であるとともに宿主細胞の染色体への組込みにも必要 AAVウイルスゲノムから3種のウイルスプロモーターが同定されていて、p5とp19はウイルス調節タンパク質合成を指示し、p40はCAP遺伝子の転写を促進する。 AAVベクターはP1レベルの施設で取扱い可能であり、取扱いが容易（文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16 年文部科学省・環境省令第1 号）にあるP1 レベルの施設で取り扱いが可能です。ただし、挿入断片によっては拡散防止措置を上げる必要がある。　参考1） AAVベクターは分裂細胞／非分裂細胞を問わず遺伝子導入ができ、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能である。 免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも適している。AAVは非常に安定なウイルスであり、精製操作も簡便に行うことができる。

  レトロウイルスベクター　参考1 レトロウイルス プラス鎖RNAをゲノムに持つウイルス RNAを遺伝情報としてもっており、かつ逆転写酵素をもっているタイプのウイルスの総称 このウイルスに目的の遺伝子を組み込むことで遺伝子の導入ができることから、遺伝子研究で広く使われている。 エンベロープを持つ一本鎖RNAウイルスであり、感染した細胞内で逆転写されて二本鎖DNAとなった後に宿主ゲノムにランダムに組み込まれる。 組み込まれたウイルスDNAは宿主染色体の一部とし子孫細胞に受け継がれる。 自らが作り出す逆転写酵素によりゲノムRNAをDNAに逆転写させ、細胞のDNAに挿入することでウイルスの複製を行う。 レトロウイルスは構造タンパク質をコードする遺伝子として，gagとenvを、酵素をコードする遺伝子としてpolとproをもつ。他に制御遺伝子（tat，revなど）やアクセサリー遺伝子（vifなど）をもつ。 iPS細胞を作るときにも使われていた。 プロウイルス provirus レトロウイルスのRNAゲノムは逆転写酵素によりDNAに変換された後、インテグラーゼによって、細胞のゲノムDNAに組込まれる。この状態のレトロウイルスをプロウイルスと呼ぶ。 レトロウイルスにおいて宿主ゲノムDNAに組み込まれた状態で、RNAに転写される前にあること。 プロウイルスDNAからはメッセンジャーRNAと、ビリオンを形成するウイルス・ゲノムRNAがともに転写される。 ウイルス由来のベクターは、遺伝子導入効率の高さから盛んに開発されてきた。 目的遺伝子をウイルスに組み込み、細胞に感染させることにより遺伝子を導入する。 レトロウイルスベクターは、宿主の細胞に感染したあと、宿主のDNAの中に入り込み、自らのウイルスを増殖させる性質を利用するものである。 レトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルスを基に開発されており、遺伝子治療での使用など豊富な実績を有している。 増殖期にある多くの細胞種への遺伝子導入が可能であり、導入遺伝子が染色体に組み込まれるため、長期間、安定に遺伝子の発現が可能である。 レトロウイルスベクターは両端にプロモーター活性を有するLTR（Long Terminal Repeat）に挟まれた gag、pol、envを目的遺伝子と置換して作られる。 group specific antigen：gag 構造タンパク質 p24 protein ウイルスの構造タンパク質をコードしている。 翻訳されたタンパク質は、ウイルスのa プロテアーゼによって6つのタンパク質とペプチドに切断される。 pol プロテアーゼで、逆転写酵素、インテグラーゼ gagの下流にある、ウイルス酵素群をコードしている遺伝子が結合した領域である。 polは開始コドンを持っておらず、リボソームがgagのmRNAを-1フレームシフトする事によって翻訳される。従って、翻訳産物はGag-Polの融合タンパク質となる。そしてフレームシフトした結果、プロテアーゼが翻訳され自己消化し、プロテアーゼを融合タンパク質から切り出す。そしてプロテアーゼは残りのPolタンパク質を消化して、各ウイルス酵素を切り出す。 env ウイルスを覆う殻となるタンパクをコードしている。 エンベロープは始めGp160として翻訳され、宿主細胞由来のプロテアーゼに切断されて、Gp120とGp41になる。宿主細胞表面のレセプターに結合し、宿主細胞へウイルスを侵入させる役割を持つ。 このベクターを恒常的もしくは外来的に発現する293 細胞に一緒に導入すれば、パッケージングシグナルを持つウイルスベクターRNA のみがウイルス粒子に取り込まれ、培養上清中に産生される。 ウイルスベクターの調製は比較的容易だが、P2レベルの施設での取扱いが必要 レトロウイルスなどを用いた細胞系譜追跡実験によっても、ニューロン新生は確認される。 ガンマレトロウイルス属　Genus Gammaretrovirus レトロウイルス科の1属 多くの種ががん遺伝子を有し、肉腫や白血病を引き起こす。 ガンマレトロウイルス属に属するウイルスには、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、鳥類の細網内皮症ウイルスがある。 多くの内在性レトロウイルス(endogenous retroviruses)は哺乳類（ヒトを含む）、鳥類、爬虫類、両生類のDNA内の外因性ガンマレトロウイルス属のウイルスに近縁である。 白血病ウイルス murine leukemia virus：MoMLV 参考1 レトロウイルスの中のガンマレトロウイルスに属する。 Moloney、Friendなどの白血病を誘導するウイルスが存在する。 5’末端から機能ドメインは、5' LTR、パッケージングシグナル、ゲノム二量体化シグナル、gag遺伝子、pol遺伝子、env遺伝子、3' LTRとなる。 宿主域により、エコトロピック、アンフォトロピッック、ポリトロピック、ジェノトロピックに分けられる。 エコトロピック マウスとラットなどのネズミ科ネズミ亜科に属する動物に感染する。 陽イオンアミノ酸トランスポーターを認識し、細胞に感染する。 白血病、免疫不全症、神経病原性を持つウイルスが存在する。 エコトロピックウイルスがマウス由来のウイルスで，マウス細胞にのみ感染するのに対して、アンフォトロピッックウイルスは同じくマウス由来のウイルスでありながら，ヒト細胞などを含むより広い宿主域を有するウイルスである。これらのウイルスはenvタンパク質に配列の違いがあるため宿主域が異なる。 エコトロピックウイルスの受容体は塩基性アミノ酸トランスポーターであるが、アンフォトロピックウイルスの受容体はクロライドチャンネルである。 アンフォトロピッック ほとんど全ての哺乳類動物に感染する。 リン酸トランスポーターを認識し、細胞に感染する。 ヒト遺伝子治療のための遺伝子の運び屋として、基礎研究において頻繁に使われている。 野生マウスから単離されることはまれである。病原性は確定していない。 ポリトロピック ほとんど全ての哺乳類動物に感染する。感染受容体は同定されたが、その生理的機能は上明である。 白血病、神経病原性を持つウイルスが存在する。内在性レトロウイルスとしてマウスゲノムに多く存在するが、増殖性を欠損したものがほとんどである。 マウスにエコトロピックウイルスを接種すると、内在性ポリトロピック配列と組み換えを起こし、増殖性のあるポリトロピックウイルスが出現する。 ジェノトロピック 実験用マウスを除く哺乳類動物に感染する。 野生マウスには感染する。ポリトロピックウイルスと同じ感染受容体を認識する。 内在性レトロウイルスとしてマウスゲノムに多く存在するが、増殖性を欠損したものがほとんどである。 病原性は確定していない。 モロニーマウス白血病ウイルス　Moloney murine leukemia virus：MoMLV 病原性のあるMoloneyマウス白血病ウイルスは複製可能で、宿主のがん遺伝子の近傍にインテグレーションし、そのがん遺伝子の発現を活性化することによって細胞をがん化する。 Moloneyマウス白血病ウイルスはT細胞をがん化し、胸腺腫を誘導する。 Moloneyマウス白血病ウイルスはアミノ酸トランスポーターを認識して感染し、T細胞リンパ腫を引き起こす。 フレンドウイルス　Friend virus：FV　←→フレンド白血病細胞　参考1 1957年にCharlotte Friendによって同定されたマウス白血病ウイルスの株である。 フレンドウイルスは、実際には単一のレトロウイルスではなく、複製能を有するガンマレトロウイルスであるフレンドMuLV（F-MuLV）と、複製欠損性であるが急性病原性を有する脾限局巣形成ウイルス（spleen focus-forming virus：SFFV）から構成される複合体である。 病原性のあるFriendマウス白血病ウイルスは複製欠損で、修飾されたEnv遺伝子をコードしている。その遺伝子産物はエリスロポエチン受容体に結合することによって細胞増殖を活性化する。 免疫抑制性レトロウイルスによる感染に対する遺伝的抵抗性を研究するための十分に確立されたモデルである。 Friendウイルスは、免疫療法とワクチンの両方に使用されている。これはレトロウイルス科のウイルスのメンバーであり、その核酸はssRNAである。 複製可能型ヘルパーウイルス成分 Friendマウス白血病ウイルスは赤芽球細胞をがん化し、脾腫を誘導する。 SIMマウスはFriendウイルスに感受性がある。 レンチウイルス lentivirus によるノックダウン レンチウイルスはレトロウイルスの一種であるが、潜伏期間が長いという特徴を持つ。 ヒト免疫不全ウイルス (Human Immunodeficiency Virus：HIV)はレンチウイルスの代表的なウイルスである。 gag、pol、envの 3つの必須遺伝子以外にも、多くの遺伝子をゲノム内に持っている。 レンチウイルスは増殖していない細胞のゲノムに遺伝子を挿入できる！ レトロウイルスのPICは核膜孔を通過できないため、核膜が消失する細胞分裂期でないと遺伝子が導入できないのに対し、レンチウイルスでは、レンチウイルスのPICは核膜孔を通過できるので、核膜の状態に依存せず遺伝子を導入できる。 レンチウイルスベクターを受精卵に感染させる手法はゲノムの複数の個所に1コピーずつ組み込まれるため、位置効果を相殺することができる。 レンチウイルスはインポーチンに伴われて核に移行する。 マイクロインジェクションに比べ作製効率が10億近く改善されることから、稀少な変異マウス系統を使うときや第1世代での発現解析などに威力を発揮する。 透明帯を除去した受精卵にレンチウイルスベクターを感染させると、約7割の胎仔および胎盤に遺伝子が導入される。ゲノムの複数の箇所に1コピーずつが組み込まれる。 透明帯を除去した胚盤胞期の胚にレンチウイルスベクターを感染させると、胎仔に遺伝子を導入することなく、ほぼすべての胎盤に遺伝子を導入できる。

  
  

  ウイルスゲノム　viral genome, virus genome ウイルスの全遺伝情報を持つDNAもしくはRNA ウイルスのゲノムは他の生物と比べてはるかにサイズが小さく、またコードしている遺伝子の数も極めて少ない。 ヒトの遺伝子が数万あるのに対して、ウイルスでは3〜100個ほどだと言われる。

  ウイルス粒子、ビリオン　virion　参考1 ビリオンは細胞外におけるウイルスの状態であり、完全な粒子構造を持ち、感染性を有するウイルス粒子のことをいう。 ビリオンはその種によって様々な大きさと形があり、その大きさは20~300nm程度である。 ビリオンにはその種により、核酸（DNAあるいはRNAの一方）とカプシドからなるものと、その外側がさらにエンベロープに覆われるものとがある。 エンベロープを持たないビリオンは、裸のウイルスと呼ばれる場合もあり、ヌクレオカプシドと同義である。エンベロープを持つビリオンはエンベロープ保有粒子あるいは被膜粒子と呼ばれる場合もある。 一般にエンベロープを持つビリオンは持たないビリオンに比べて消毒薬に対する抵抗力が弱い。 ウイルスの分類にはビリオンの性状が用いられることが多い。

  エンベロープ envelope　参考1 単純ヘルペスウイルスやインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなど一部のウイルス粒子にみられる膜状の構造のこと これらのウイルスにおいて、エンベロープはビリオンの最も外側に位置していて、ウイルスの基本構造となるウイルスゲノムおよびカプシドタンパク質を覆っている。 エンベロープの有無はウイルスの種類によって決まっており、分離されたウイルスがどの種類のものであるかを鑑別する際の指標の一つである。 エンベロープは、ウイルスが感染した細胞内で増殖し、そこから細胞外に出る際に細胞膜あるいは核膜などの生体膜を被ったまま出芽することによって獲得されるものである。このため、基本的には宿主細胞の脂質二重膜に由来するものであるが、この他にウイルス遺伝子にコードされている膜タンパク質の一部を細胞膜などに発現した後で膜と一緒にウイルス粒子に取り込み、エンベロープタンパク質としてビリオン表面に発現させている。 これらのエンベロープタンパク質には、そのウイルスが宿主細胞に吸着・侵入する際に細胞側が持つレセプターに結合したり、免疫などの生体防御機能を回避したりなど、さまざまな機能を持つものが知られており、ウイルスの感染に重要な役割を果たしている。

  カプシド capsid ウイルスゲノムを取り囲むタンパク質の殻のことを指し、カプソメアによって構成されている。 カプシドの構造はウイルスゲノムとカプシドとの立体配列により、立方対称性、ラセン対称性、非対称性のものがある。 カプシドの構成単位であるカプソメアは暗黒期に他のタンパク質とともに合成される。その数はウイルスによって一定である。ウイルスによってはカプシドの外側にエンベロープを持つものもある。カプシドはウイルスゲノムを核酸分解酵素などから保護し、細胞のレセプターへの吸着に関与している。 カプシドはウイルスが細胞に侵入後、細胞またはウイルス自身の酵素によって取り除かれる。この過程を脱殻と呼ぶ。 ウイルスゲノムとカプシドの複合体をヌクレオカプシドと呼ぶ。 カプソメア capsomere 正二十面体や桿状ウイルス粒子(ビリオン)のコアになっている核酸を被っているカプシド部分を構成しているタンパク質の微小単位 カプソメアの数はウイルスによって決まっている。 アデノウイルスでは252個、トガウイルスでは32個のカプソメアがある。 ヌクレオカプシド nucleocapsid ウイルスのゲノム（DNAあるいはRNA）とカプシドの総称 タンパク質とゲノムの複合体（核タンパク質　nucleoprotein）もヌクレオカプシドの一部とみなされる。 ポリオウイルスのような単純なウイルスではヌクレオカプシドはウイルスの構成成分全てを含むが、他の多くのウイルスではヌクレオカプシドは何らかの機能を有する他の構造物とともにエンベロープに包まれている。 暗黒期 eclipse phase ウイルスの増殖：吸着　→　侵入　→　viropexis（飲ウイルス作用）　→　エンベロープ融合　→　細胞内核酸放出　→　直接侵入　→　脱殻 脱殻終了からウイルス粒子が集合、成熟するまでの時期を暗黒期と呼ぶ。

  長い末端反復 Long terminal repeat：LTR　←→LTR型レトロトランスポゾン 同じ配列が数百から数千回繰り返すDNA配列で、レトロトランスポゾン、あるいはレトロウイルスRNAが逆転写されて生じるプロウイルスDNAの、両端にみられる。 ウイルスが自身の遺伝物質を宿主ゲノムに挿入するために用いる。 A.P. Czernilofsky と J. Shine が1977年および1980年に発見した。 LTRはRNA中間体に一部転写された後、相補的DNA (cDNA) に逆転写され、最終的に dsDNA (二本鎖DNA) へとフルLTRとして転写される。LTRはLTR特異的インテグラーゼを通じて、レトロウイルスの宿主染色体の別領域への組み込みを媒介する。 5' 端側と 3' 端側のLTRは挿入時には同一であるから、LTRペアの間の配列の違いを用いて太古に起こったレトロウイルス挿入の時期を推定することができる。 HIV-1 */* HIV-1のLTRは長さが634 bpで、他のレトロウイルスLTRと同様に U3, R, U5 領域に分節化されている。 LTR は、機能的に 5'端より U3、R、U5 の3 つの領域に区分される。 U3 領域にはエンハンサー/プロモーター活性があり、宿主細胞のRNAポリメラーゼIIによって、ウイルスゲノムは5'R 領域から 3'R 領域までが転写される。転写された 1 本鎖ウイルスゲノム RNA はウイルス粒子内に取り込まれる。 ウイルスが細胞に感染すると、ウイルスゲノム RNA から逆転写酵素により最終的に２本鎖ウイルスゲノム DNAが合成されるが、その過程で 3'LTR のU3が 5'LTR のU3にコピーされる。合成されたウイルスゲノム DNAは、宿主染色体に組み込まれプロウイルスとなる。 U3 および U5 領域は転写因子サイトとLTR活性およびウイルス遺伝子発現への影響に従ってさらに分けられる。逆転写の多段プロセスの結果として、二つのそれぞれ U3, R, U5 領域からなる同一LTRがプロウイルスDNAの両端に存在する。 LTRの端はプロウイルスの宿主ゲノムへの組み込みに関与する。ひとたびプロウイルスが組込まれると、 5′ 端のLTRはレトロウイルスゲノム全体のプロモーターとして働き、一方で 3′ 端のLTRは発生初期ウイルスRNAのポリアデニル化を助け、また HIV-1, HIV-2, SIV では補助タンパク質 Nefをコードしている。

  プレインテグレーション複合体 preintegration complex：PIC ウイルス感染直後の細胞質分画にある逆転写反応後のウイルスDNAを含む核酸―タンパク複合体 宿主由来DNA とウイルス由来DNAの相互作用でできる複合体 この複合体はウイルス DNA を外来性のプラスミド DNA に組み込む活性があることが示され、プレインテグレーション複合体と名づけられた。 PICの構成因子：ウイルスDNA（cDNA-flap）、マトリックス（MA）、インテグラーゼ（IN）、Vprなどのウイルスタンパク質と細胞内因子 PICがヒトのゲノムに到達するためには「核膜」を通過しなければならない。レトロウイルスのPICは核膜を突破できないが、レンチウイルスのPICは通過できる。 インポーチンは核局在シグナルを認識して、レンチウイルスのタンパク質を核内に連れ込む。

  パッケージングシグナル packaging signal：E/psi ウイルスゲノムが粒子に特異的に取り込まれるために持つゲノム上の構造 ウイルスゲノムのRNAにはウイルスタンパク質を作るための遺伝子以外に、「パッケージングシグナル」と呼ばれる配列も含まれていて、ウイルスタンパク質はその部分を認識してウイルスゲノムRNAに結合し、これを膜のところまで連れて行く。 レトロウイルスのゲノムは約 9000 塩基の一本鎖ポジティブ RNA であり、E/psi はその 5'末端の 500 塩基前後の領域から成っている。

  ヘルパーウイルス　helper virus 単独では増殖できないヘルパー依存ウイルス(helper dependent virus)の増殖を助けるウイルスの総称 ヘルパーウイルスはヘルパー依存ウイルスと重感染した場合にヘルパー依存ウイルスのゲノムの複製に必要な酵素を提供する 例えば、D型肝炎ウイルスは単独では増殖できないが、ヘルパーウイルスとしてB型肝炎ウイルスの存在下では増殖することができる。

・Supernova法　参考1

• 遺伝研岩里研究室のWenshu Luo（羅ブンジュ）研究員とHidenobu Mizuno（水野秀信）助教らが開発した、どの領域・細胞種の脳細胞でも高輝度標識し、任意の遺伝子を改変する新技術
• 哺乳類の脳は、無数のニューロンが複雑な神経回路を作ることで、様々な機能を生み出している。脳の中に高密度で存在するニューロンから一部だけをランダムに選んで標識し、その細胞のみで目的の遺伝子をノックアウトすることができれば、脳の神経回路が形成され、機能するしくみを細胞レベル、分子レベルで理解することにつながるので、まばらな細胞標識と遺伝子ノックアウトの両方を効率よくできるシステムを開発した。
• Supernova法では2種類または3種類のベクターを組み合わせて細胞に導入するだけで、少数の細胞のみを蛍光タンパクで可視化できるとともに、可視化された細胞だけで目的の遺伝子をノックアウトすることが可能となる。
• Supernova法は広範なモデル生物に使うことができる。
• 遺伝子改変による細胞の挙動などの変化を追跡することができる。
• 脳以外の組織にも用いることができる。

  Supernova法のしくみ 2種類のSupernovaベクター（ベクター１、ベクター２）を組み合わせて脳に導入することで、ベクター１とベクター２を取り込んだ細胞のうちの一部でのみ正のフィードバックにより蛍光タンパクの発現の増幅が起こり、強い蛍光を発する。 floxマウスを用いるとCre/loxP法で目的の遺伝子をノノックアウトできる。また、TALENやCRISPR/Cas9法を利用したベクター３を導入すれば、遺伝子組換動物を用いずに目的の遺伝子をックアウトすることもできる。 ベクターは子宮内電気穿孔法あるいはアデノ随伴ウイルスを用いて導入する。

・エレクトロポレーション、電気穿孔法

• 物理的遺伝子導入法
• 化学的なトランスフェクションでは核酸導入が困難な哺乳類細胞、幹細胞、初代細胞に対して、物理的な導入方法であるエレクトロポレーションの利用は、高い核酸導入効率を期待できる。
• 電気パルスで細胞膜の透過性を上げることにより、DNAなどの分子を真核生物や原核生物の細胞に導入する方法である。
  
  
• 高電圧パルスを細胞に直接かけ、細胞表面空いた小さな孔から核酸を取り込む方法
• 発現ベクターを脳室内に注入した後に、電極を胚の近傍に静置し電気パルスをかけることによってin vivoで効率良く遺伝子を導入する方法
• DNAは負電荷を持ち陽極側に向かって動くことから、導入時に陽極と陰極の電極の位置を調節することで、目的の限局した領域に導入することが可能である。
  
  
• ピンセット型の電極を用いることにより、子宮や卵黄囊の外側から電気パルスを与えることでマウス胎仔にも遺伝子導入できる。
• マウスなどの胎仔に利用できる生体内電気穿孔法が確立され、遺伝子の解析が個体レベルで飛躍的に進んでいる。

  生体内電気穿孔法 in vivo electroporation　参考1 生体内の細胞への電気穿孔は生体内電気穿孔法と呼ばれる。 培養細胞ではなく、胎仔内の細胞に核酸を導入する方法 マウス胎仔の生体内電気穿孔法では、子宮内電気穿孔法と子宮外電気穿孔法とがある。 子宮内エレクトロポレーション法、子宮内電気穿孔法　In Utero electroporation　参考1/2/3/ Tracy L. Young-Pearse v.s. Joseph LoTurco マウス胎仔の生体内電気穿孔法では、子宮の外からDNAなどを注入し、子宮の外側を電極で挟むことで電気穿孔する。 NEPA21とピンセット電極を組み合せることにより、マウス子宮内胎児の脳室に直接遺伝子導入が可能 胎生13.5日のマウス胎仔には40 V, 50 msecの矩形波パルスを1秒に1回ずつ5回与えるなどの条件が使われ、至適電圧は胎仔の発生のステージで異なる。 電極と遺伝子導入される細胞が近接している必要はなく、子宮の外側から電気パルスを与えても脳内などへの遺伝子導入が可能である。 子宮内電気穿孔法を行った胎仔は子宮とともに母体に戻せば生育でき、出産も可能である。 子宮外電気穿孔法 Exo Utero electroporation 胎生12.5日以前では子宮の外から胎仔が見えにくいなどの理由により、子宮壁を切開してDNAなどを注入し、胎仔の入った卵黄囊を電極で挟み電気穿孔する。 卵黄囊の外側から電気パルスを与える。 子宮外電気穿孔法を施した胎仔は子宮壁を縫わずに母体に戻すことで生育可能であるが、出産後の仔マウスが必要な場合、母マウスは自力で出産できないため出産期に帝王切開を要する。

・マイクロインジェクション　microinjection　参考1

• 物理的遺伝子導入法
• 先端の直径が約1μm程度のガラスマイクロピペットに、導入したい物質を入れ、直接細胞内に導入する方法
• トランスジェニックマウスでは、は受精卵の前核にガラス管を用いて直鎖状のDNAを直接注入する。
• 物質の大きさ・性質に関わらず導入できるが、技術が必要

・パーティクル・ガン法　particle gunn

• 物理的遺伝子導入法
• 金やタングステンなどの金属の微粒子にDNAをコーティングしたものを弾丸として、高速で射出して細胞内にDNAを導入する方法
• 金属の微粒子をDNA でコーティングし、細胞内に打ち込む。
• 形質導入：ウイルスを利用して遺伝子を細胞内に導入する。

・トランスフェクション　transfection

• 化学的遺伝子導入法
• 核酸を動物細胞内へ導入する過程を指す。
• 通常、動物細胞はウイルスによる導入以外は核酸の細胞内導入は滅多に起こらないが、人為的にある程度自由に核酸を導入することが可能になってきている。
  
  
• トランスフェクションの方法

  リポフェクション lipofection、リポソームトランスフェクション liposome transfection 細胞内に遺伝物質を導入するトランスフェクションの手法の一つである。 核酸を取り込ませたリポソームを細胞内に取り込ませる。 リポソーム：リン脂質二重膜の小胞の内部に遺伝物質を封入して細胞膜を通過させる。 リポフェクション法の原理：負の電荷を持つDNA の周りに正の電荷を持つ陽イオン性リポソームが結合し複合体を形成して、エンドサイトーシス現象により細胞表面から細胞内にDNA が取り込まれる。 この原理を利用したリポフェクション試薬は、導入したい核酸・タンパク質や細胞の性質によって、効率が大幅に変動するので、試薬の特性を見極めることが重要 リポソーム liposome　参考1 細胞膜や生体膜の構成成分であるリン脂質を使って、水中で作ることのできる人工膜小胞 細胞膜の脂質二重膜を模して、一つの分子上に親水性部分と疎水性部分とを持たせた分子から作られる複合体で、内部にDNAやタンパク質などを含ませることができ、細胞と融合させて内部の分子を細胞内に導入する実験に利用される。 Alec D Bangham（1921〜2010, 英国の血液内科医）がケンブリッジのBabraham Instituteで研究していた時に、1961年にリポソームについて最初に記述した。 Banghamと R. W. Horneは卵黄由来のホスファチジルコリンの懸濁液を電子顕微鏡で観察し、ラメラ構造を持つ二分子膜からなる小胞が形成されることを見出した。 Lipofectamine プラスミド導入用トランスフェクション試薬 タンパク質発現、遺伝子サイレンシングおよび機能解析のための、細胞へのDNAまたはsiRNA 導入用トランスフェクション試薬 ViaFect * トランスフェクション試薬

  
  
• トランスフェクションの種類　参考　1
  　DNAのトランスフェクションは一過性導入と安定的導入の違いがある。

  一過性導入　transient transfection 導入された核酸は細胞内に一過的に存在し、限られた期間のみ発現し、複製されない。 導入されたDNAはゲノムに組み込まれず、核に留まる。 導入された遺伝物質は次世代へと受け継がれず、遺伝子変異は恒久的ではない。 選択的スクリーニングは必要ない。 一過性トランスフェクションにはDNAベクターおよびRNAの両方を使用できる。 高コピー数で遺伝物質が導入されることは、高レベルのタンパク質発現につながる。 細胞は一般的にトランスフェクション後24〜96時間以内に回収される。 通常、誘導性プロモーターを持つベクターを用いる研究には適さない。 遺伝子または遺伝子産物の短期間発現の効果に関する研究、RNA干渉媒介遺伝子サイレンシングの実施、あるいは組換えタンパク質の迅速な小規模生産に用いられる。mRNAは核への移行および転写プロセスを必要とせずにサイトゾルで発現されるため、mRNAを用いる一過性トランスフェクションではさらに迅速に結果が得られる。一部のシステムでは、導入されたmRNAをトランスフェクション後数分以内に発現させることが可能

  安定的導入　stable transfection 培養細胞に遺伝子に発現ベクターを導入し、薬剤耐性マーカーによる選択圧をかけることで定常発現株を樹立できる。 発現プラスミドが薬剤耐性遺伝子を含有する場合、薬剤を培養培地に添加することによって安定遺伝子導入される細胞を選択することができる。 導入されたDNAはゲノムに組み込まれる。 導入された遺伝物質は世代から世代へと安定的に受け継がれ、遺伝子変異は恒久的 安定な形質転換体を単離するための選択的スクリーニングが必要 安定トランスフェクションにはDNAベクターのみを使用でき、RNAはそれだけで安定的に細胞に導入できない。 安定的にゲノムに組み込まれるDNAはシングルまたは低コピー数で、低レベルのタンパク質の発現につながる。 安定的に導入されたコロニーを単離するために2〜3週間の選別が必要とされる。 誘導性プロモーターを持つベクターを用いる研究に適す。 安定的導入にはゲノムに導入DNA を組み込み、薬剤で選択する方法が一般に行われている。またRNAの導入はsiRNAによる一過的な遺伝子のノックダウンに広く利用されている。 遺伝子組換え椊物を作製する場合、主に薬剤耐性遺伝子が使われる。例えば、カナマイシン耐性遺伝子をマーカーとして使用した場合、遺伝子導入処理をした細胞を、カナマイシン入りの培地で培養する時に、目的の遺伝子と一緒に、カナマイシン耐性遺伝子が組み込まれた細胞だけが成長できるため、組換えが起こった細胞を選抜することができる。 　→薬剤耐性遺伝子/薬剤耐性プラスミド

  
  
  

  プロモーターアッセイ　←→プロモーター =レポーターアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ　Gene expression assays　←→レポーター遺伝子/ATP assay　参考1 知りたい遺伝子がタンパク質として「どこで」「どのくらい」発現しているかを可視化するための、遺伝子工学的な手法です。 遺伝子の活性状態を目に見える形で“レポート”するアッセイをレポーターアッセイという。 プロモーターより下流の本来タンパク質情報があるところに、別のタンパク質を作る遺伝子を人工的に繋げてやることで、その遺伝子が発現する場所やタイミングを可視化する。 任意のDNA断片が有する転写調節因子（プロモーター、エンハンサーなど）としての機能を解析するための系である.当該DNA断片をレポーター遺伝子の上流に連結したレポータープラスミドを構築し、培養細胞等に導入してレポーター遺伝子発現量を測定する系である。 遺伝子発現の定量には、mRNAの定量とタンパク質の定量がある。現在、一般的に用いられているルシフェラーゼをレポーター遺伝子とする系では、ルシフェラーゼタンパク質の酵素活性を測定する方法が採用されている。 見たい遺伝子Aをルシフェラーゼの遺伝子で置き換えることによって、遺伝子Aの活性状態が蛍光強度として観測される。 多検体を同時に迅速に測定できる点(ハイスループット)や、実験が容易である点や再現性がよい点で優れている。ただしレポーター遺伝子の発現量は、導入された宿主細胞の状態に依存するので、実験条件を一定にする必要がある。そこで多くの場合、2種類のレポーター遺伝子を用いて一方を内部標準とするデュアルレポーターアッセイ系が用いられている。 応用として、レセプターの下流のシグナル伝達を利用して発現を促し任意のタンパク質がレセプターであるかの解析、シグナル伝達系の一員であるかの解析も可能である。 最近ではRNA干渉を利用した遺伝子発現制御のためのRNA配列スクリーニングにも用いられる. レポーター遺伝子の多くは、触媒的に非蛍光化合物を蛍光化合物に変換するので、非常に感度が高い。

  
  
  

  遺伝子トラップ法、ジーントラップ法 gene trap mutagenesis ランダムな遺伝子の破壊 遺伝子トラップ法は外来性の薬剤耐性遺伝子がゲノムにランダムに挿入される際に、偶然に内在性の遺伝子座に挿入されたものを薬剤により選択する。 プロモーターをもたないレポーター遺伝子をゲノム中に挿入することにより、ある遺伝子の発現パターンなどを調べる分子遺伝学的手法 すべての生物において、その遺伝子の発現はエンハンサーやプロモーター塩基配列によって制御されている。 エンハンサーやプロモーターを持たないレポーター遺伝子がゲノム上に存在する構造遺伝子の内部に侵入し、その遺伝子産物との融合たんぱく質として発現した場合、この進入したレポーター遺伝子の発現パターンは、挿入を受けた遺伝子のものを反映することが期待できる。 または、こうしたレポーター遺伝子が構造遺伝子のエクソンの5' 非翻訳領域に挿入されたときに融合たんぱく質を形成していなくとも、同じことが期待できる。 ジーントラップ法はこのようにレポーター遺伝子がゲノム遺伝子上に存在する構造遺伝子の内部に挿入される事を想定したものである。 同じベクターをくり返しES細胞に導入することによりランダムに遺伝子を破壊する。

  遺伝子ターゲティング法　gene targeting 標的とする遺伝子ごとにデザインされたベクターを作製してES細胞へ導入し、薬剤耐性遺伝子および薬剤感受性遺伝子（あるいは，自殺遺伝子）を組み合わせた正の選択および負の選択により相同組換えを起こしたES細胞を濃縮する。 遺伝子ターゲティング法は外来性の薬剤耐性遺伝子の両側にゲノムと相同性をもつ領域を付加し、相同組換えにより内在性の遺伝子を薬剤耐性遺伝子と置き換える方法であり、目的とする遺伝子の機能を個体レベルで解析する逆遺伝学の典型例とされる。

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☆遺伝子組換え recombination、遺伝的組換え Genetic recombination

• 生物が自ら制御して遺伝情報を再編成することを遺伝的組換えと言う。
• 遺伝的組換えは以下の4種類に分けられる。
  
  

  相同組換え　homologous recombination　=普遍的組換え general recombination

  部位特異的組換え　site-specific recombination 　[特定の部位で起こる組換え：酵母の性転換や抗体形成過程で行われる]

  →トランスポゾン　transposon　[DNA断片が染色体上を動き回るような組換え]

  非正統的組換え　illegitimate recombination）[上記以外の組換え]

○Cre-loxPシステム　←→コンディショナルノックアウト/nestin

• Cre-loxP部位特異的組換えは、1981年にバクテリオファージP1の研究で見出された部位特異的組換え反応
• 1996年にMITのKandel & Tonegawa LabでがCre-loxPシステムを使ったノックアウトマウスが作成された。　参考1
• Cre/loxPシステム：DNAのloxP配列に対し、DNA組換え酵素Creリコンビナーゼが働くことにより生じる部位特異的組換え反応を利用した遺伝子組換え実験系
• 本来、バクテリオファージP1が宿主である大腸菌内で複製される際に自身のゲノムを環状化するための組換えシステムである。遺伝子工学、発生工学に分野で主にloxP配列間に存在する遺伝子をCre発現により欠失させるために使用される。

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• 反応機構：まずCreの単量体2つがloxP配列両端の13 bpの配列をそれぞれ認識し、それが2組集合することで反応の場が形成される。Creの324番目のチロシンがloxPの切断部位を攻撃して鎖交換を触媒し、ホリデイ・ジャンクションの異性化を経て、再び同様の鎖交換が行われる。
  
  
• コンディショナルノックアウトを実施する目的などで広く使われている。
• Cre/loxP システムを利用したコンディショナルなgene-targeting はCreドライバーマウスにおいてloxPを切除することによって時間的・空間的に制御される。
  
  

  Cre組み替え酵素、Creリコンビナーゼ　Cre Recombinase 　→参考1 cre：causes recombination（タンパク質がCreであり、遺伝子はcre） cAMP Response ElementのCreとは別物 Creタンパク質：分子量：約38kDa、343残基からなる組換え酵素 チロシンリコンビナーゼファミリーに属していて、アミノ末端側の一部分を除けばラムダファージのインテグラーゼとよく似た構造をしている。 バクテリオファージP1に由来し、TypeIトポイソメラーゼに分類されるDNA組換え酵素 DNAのloxP配列を認識し組換えを起こす。 部位特異的組換え酵素：DNA分子の特定の配列（loxP配列）を認識し組換えを起こす。 Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスの細胞はX-gal染色で同定できる。 loxP配列　←→flox/Cre-loxPシステム loxP：DNA組換え酵素Creが認識する34塩基からなるDNA配列 バクテリオファージP1ゲノムに由来する34bp（塩基）のDNA配列の、両末端に存在するCre結合部位13bpは対称に、中心部は非対称な配列になっている。 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' CreER タモキシフェン依存性リコンビナーゼ CreERタンパク質は通常細胞質に存在するが、タモキシフェンと結合することにより核内に移行し、loxP配列に対して組換えを起こす。 これを利用してCre-loxPシステムの働く時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である。 細胞特異的プロモーターによってCreERTM遺伝子の発現を制御したトランスジェニックを用いると、マウス個体レベルで遺伝子変異の部位と時期と特定することができ、この系はコンディショナルノックアウトのスタンダードとなっている。 4-水酸化タモキシフェン（OHT）で処置すると、多数の遺伝子を導入・ノックアウトができる。 tamoxifen-inducible Cre recombinase-estrogen receptor fusion protein：CreERTM Creリコンビナーゼとヒトエストロゲン受容体リガンド結合領域の変異体との融合タンパク質 4-水酸化タモキシフェン（OHT）投与によって活性化される。 CreERT2 タモキシフェンが細胞質にあるエストロゲン受容体：ERに結合し、核内に移行する原理を利用する技術。しかも正常のエストロゲンには結合しないが、Tamoxifenとしか結合しないように、改変された。 Creを誘導可能にするために、エストロゲン受容体と融合タンパク質にしたものがCreERであるが、内在性のエストロゲンに反応するという欠点があった。Pierre Chambon (Universite Louis Pasteur) 1/2/3らのグループはエストロゲン受容体部分に点突然変異を複数導入し、内在性のエストロゲンに反応せず、タモキシフェンに反応する性質をもった変異体を得て、現在汎用されているのがCreERT2である。 tamoxifen-inducible estrogen receptor：ERT2 tamoxifen-inducible Cre-ERT2 fusion protein：Cre-ERT2 Nestin-CreERT2 Line5-1 ; B6-Nes-CreER#5-1 1＠RIKEN/2/3/4/5 今吉格先生が作成されたNestin-CreERT2トランスジェニックマウス 内在性のエストロゲンsに反応しないように改良された。 C57BL/6受精卵へトランスジーンのインジェクションにより作製 神経幹細胞/前駆細胞において、CreERT2を発現する。CreERT2の発現量は低レベルである。 タモキシフェンにより活性誘導可能な組み換え酵素であるCreERT2を、神経幹細胞において働くNestin・プロモーター／第2イントロンの制御下に発現するトランスジェニックマウス マウス成体において、タモキシフェン投与により神経幹細胞に効率の良いCre組み換え活性を誘導できるので、成体の神経幹細胞の解析研究のための貴重な動物モデルである。 嗅球においては、タモキシフェン投与12ヶ月後には約60%の顆粒細胞がレポータータンパク質を発現していて、神経幹細胞での組み換え効率が60〜70%であることから顆粒細胞の大部分は新生ニューロンに置き換わっていると考えられた。 た。 海馬歯状回においては、タモキシフェン投与12ヶ月後においても、レポータータンパク質を発現する細胞の割合は10%程度であり、新生ニューロンは顆粒細胞の一部を占めるにすぎないことが示された。 MerCreMer Cre recombinase protein fused to two mutant estrogen-receptor ligand-binding domains Dr. Michael Reth（Max-Plank Institute, Freiburg, Germany）が開発 MerCreMerはエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインとCreリコンビナーゼとの融合タンパク 通常は細胞質に存在し、リガンドであるタモキシフェンの投与により核内に移行し、ゲノム中に2つのloxP配列とがあれば組換えを起こす。 タモキシフェン調節性キメラCreレコンビナーゼMerCreMer Tamoxifen Regulated Chimeric Cre Recombinases MerCreMer

○Tet on/off システム Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems　 ←→Tet ファミリーとは無関係　参考1

• 1990年代にHermann BujardとManfred Gossenが開発した。
• 従来の遺伝子発現実験系では目的遺伝子の発現は「する」「しない」しか制御できなかったが、Tetシステムでは発現量を段階的にかつ容易に調節できるという特徴を持つ。
• 大腸菌テトラサイクリン耐性オペロン
• 大腸菌のもつTetリプレッサー、およびTetオペレーターを利用し、抗生物質テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリンを投与することで細胞あるいは動物個体において可逆的に目的遺伝子の発現を調節できる実験系
• 9-tert-Butyl Doxycycline：9TB-DoxはTetシステムに対して約10倍高い結合親和性を示す。
• ヘルペスウイルス由来のVP16 転写活性化ドメインをTetリプレッサータンパク質と融合させて転写活性化因子rtTAとして働かせる。そして培地中の薬剤（テトラサイクリン／ドキシサイクリン）の濃度を調節することによって、TREプロモーター下流に組み込んだ目的の遺伝子の発現レベルを定量的に調節することができるシステム
  

  Tetリプレッサータンパク質：TetR　←→リプレッサー テトラサイクリンorドキシサイクリン存在下でtetO配列に結合できなくなる。 reverse TetR：rTetR TetR のアミノ酸残基を一部改変して作製された。 ヘルペスウイルス由来のVP16転写活性ドメイン 　 transcription activation domain of a herpes simplex virus protein：VP16AD

  Tetオペレーター配列：tetO配列 大腸菌のTn10トランスポゾン上にあるテトラサイクリン耐性オペロンに存在するTetオペレーターDNA配列 テトラサイクリン応答因子 tetracycline responsive element :TRE tetO反復配列をもつ。

  テトラサイクリン調節性トランス活性化因子 tetracycline transactivator :tTA TetRとVP16ADとの融合タンパク質であり、tetO配列に結合すると下流のプロモーターを活性化する。 ドキシサイクリンと結合するとTetRがtetO配列に結合できなくなるため、tetO配列下流のプロモーターは活性化しない。 tTAマウス　→c-Fos-tTAマウス 特定の遺伝子のプロモーター部位にtTAの遺伝子を組み込んだマウス tTAマウスとtetO-ChR2マウスかけあわせることによって、目的の細胞種でのみChR2を安定かつ多量に発現させることができる。

  リバーステトラサイクリン調節性トランス活性化因子 reverse tetracycline transactivator:reverse tTAまたはrtTA reverse TetR（rTetR）とVP16ADとの融合タンパク質である。 tTAとは逆にドキシサイクリンと結合することでtetO配列に結合し、下流のプロモーターを活性化する。

  
  

  Tet-onシステム ドキシサイクリン：Dox存在下で目的の遺伝子を発現 目的の遺伝子を発現する組織、細胞に適したプロモーターの制御下で、リバーステトラサイクリン調節性トランス活性化因子：rtTAをを発現する制御ベクター（＝Tet-on調節プラスミド）、およびテトラサイクリン応答因子：TRE配列をもつ最小プロモーターの下流に目的遺伝子をつなげた応答ベクターの両者を細胞あるいは動物個体に導入する。 rtTAを発現するTet-On調節プラスミドと、tetOn反復配列をもつTREをコードする応答発現プラスミドを使用する。 rtTAは変異型Tetリプレッサータンパク質（tTetR）とVP16 転写活性化ドメインで構成される融合タンパク質で、培地中にDoxを添加するとTREと結合して下流の遺伝子発現を誘導する。 制御ベクター regular vector（＝Tet-on調節プラスミド） promoter rTetR VP16AD ↓ rTetR VP16AD rtTA ↓ 応答ベクター response vector Dox rTetR VP16AD 転写 TRE Minimal promotor - Gene A ↓ Protein A 発現したrtTAはドキシサイクリン非存在下 (Dox-)ではTREに結合しないが、ドキシサイクリンの培地への添加あるいは動物個体への投与 (Dox+)によりTREと結合するようになり、目的の遺伝子を発現するようになる。また、この発現制御はドキシサイクリン濃度依存的であるためドキシサイクリンの量で発現量を調節することが出来る。 Tet-offシステム ドキシサイクリン非存在下で目的の遺伝子を発現 細胞あるいは動物個体に導入するベクターのうち、制御ベクターが発現する。 Tet-Oneシステム 調節ベクターと発現応答ベクターをワンベクターにした”Tet-One”システム Tet-OneシステムはTet-On 3Gトランスアクチベーターとテトラサイクリン応答因子配列（PTRE3GS）を同一ベクターに搭載したAll-in-Oneベクターの遺伝子発現制御システム

  
  

  tetracycline transrepressor：tTR　→TrkA-TeNT/ChAT-tTRマウス　参考* 遺伝子導入により細胞特異的に発現させた遺伝子を、さらに細胞を絞り込んで発現抑制させるために開発した遺伝学ツール 細胞特異的な標的遺伝子の発現に用いる転写活性化因子tTAに対して、tTRはtTAを阻害するタンパク質（tTA repressor）としてデザインされたものである。tTA発現細胞のうち一部の細胞でtTAを同時発現させると、その細胞でのみ標的遺伝子の発現をキャンセル することができる。 tTAとtTRを用いたシステムは、ハエの遺伝学実験で用いられる転写因子Gal4と転写抑制因子Gal80に相当する。tTRはtTAの転写活性化部位を転写抑制因子KRABドメインに変更することで作製され、tTAのホモ二量体化の阻害とtetO配列（tTAが結合するDNA配列）の占有による転写抑制の二つを作用機序として持つと考えられる。

  
  

○R26rマウス　Rosa26 reporter mice　←→Fucci

• ROSA26 locusにノックインしたマウス、floxed mouse
• ubiquitousに外来性遺伝子発現を許すROSA26遺伝子座内に、転写をSTOPさせる配列をFloxedし、その下流にlacZレポーター遺伝子をノックインしたマウス
• ROSA26領域へ蛍光遺伝子を導入し、それをCre-loxPシステムで組織特異的に発現させれば、ライブイメージングに適した汎用性の高いレポーターマウスを作成できる。
• Creドライバーマウスの評価のため広く使用されているCreレポーターマウス

  Rosa26領域　Reverse Orientation with Splice Acceptor 遺伝子を安全に挿入可能なセーフハーバー遺伝子座 1991年にPhilippe Sorianoらが同定したマウス第6染色体に存在するゲノム領域 Gt(ROSA)26Sor：Phillip Soriano (Sor)の研究室でROSAベクターによってトラップされた 26番目の遺伝子 レトロウィルスによるジーントラップベクター　Gen-ROSAβgeo (bifunctional lacZ/neomycin phosphotransferase gene cassette) *をES細胞に感染させ、そのクローンから樹立したマウスの組織をX-gal染色する方法にて組織特異的遺伝子を探索していた。 Rosa26領域にβガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたマウスの系統は全身すべての細胞がX-gal染色陽性となるため，移植実験のコントロールとしてきわめて有用であった． βガラクトシダーゼ遺伝子を他のマーカー遺伝子と置換しても全身にマーカーを発現されることが可能で、レポーターコンストラクトの挿入に頻用されている。 Rosa26遺伝子の働きは解明されていないが、細工しても生存や妊娠には影響がないので、Rosa26のプロモーター下にYFPのタンパクが発現するように遺伝子を設計し、そのYFP遺伝子の上流にストップ配列を配置することで通常はYFPが発現しないようにしてある。ストップ配列を含むDNA配列はLoxPとLoxPに挟まれていて、Cre酵素が発現している細胞ではSTOP配列が取り除かれてYFPが発現し、蛍光を検出できる。

  ROSA-CAG-loxP-STOP-loxPのレポーターマウス CAG プロモーター

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◯ゲノム編集 genome editing　←→ゲノム/RNA編集

• 遺伝子コードを変更し、通常「ノックアウト」を誘導するか、または遺伝子機能を完全除去すること
• DNAの二本鎖を切断（DSBs）し、標的部位ノックアウトおよび選択マーカーノックインを行う。
• 部位特異的なヌクレアーゼ を利用して、思い通りに標的遺伝子を改変する技術
• 真の遺伝的Null対立遺伝子を構築する場合には、RNA干渉よりも、ゲノム編集を選択するほうがよい。
• 特異的部分変異を導入したり既存の変異を野生型に戻したい場合や、対象遺伝子の内在性座位において融合タグを付加し、遺伝子発現を行いたい場合には、ゲノム編集手法を利用する。
• 近年、高効率でDSB（DNA二本鎖切断）を作製するために、人工ヌクレアーゼ（ZFNs、TALEN）やCRISPR-Cas9などのツールが開発された。
  
  

  ジンクフィンガーヌクレアーゼ Zinc Finger Nucleases：ZFNs　←→ジンクフィンガー/ヌクレアーゼ 　参考1 ZFNsはジンクフィンガーDNA結合ドメインとDNA切断ドメインからなる人工制限酵素である。 ジンクフィンガードメインは任意のDNA塩基配列を認識するように改変可能で、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム中の単一の配列を標的とすることが可能となる。 内因性のDNA修復機構を利用することで、ZFNsはさまざまなモデル生物においてゲノム編集を可能にする。 DNA結合ドメイン　DNA-binding domain：DBD　←→転写因子の分類 ZFNのDNA結合ドメインは通常3から6個のジンクフィンガーを含んでいて、9から18塩基対の認識が可能である。 ジンクフィンガードメインが予定ターゲット配列を完全に認識するのであれば、3フィンガーZFNsセットであったとしてもトータル18塩基対認識となり、理論上哺乳類ゲノム中で単一の配列を認識可能である。 目的の配列を認識可能なCys2His2ジンクフィンガーを改変するために様々な手法が開発されてきた。これらには、"モジュールアセンブリ"や、ファージディスプレイや細胞を利用したセレクションシステムが含まれる。 新規ジンクフィンガードメインの作成に最も容易な手法は、既知の特異性を持つ個々のジンクフィンガー"モジュール"をつなぎ合わせるものである。最も一般的なモジュールアセンブリプロセスは、3塩基対のDNA配列を認識する個々のジンクフィンガーを3つ繋ぎあわせ、9塩基対ターゲット配列を認識可能な3フィンガーアレイを作成する。この他に、1フィンガーまたは2フィンガーモジュールを利用して6またはそれ以上のジンクフィンガーからなるジンクフィンガーアレイを作成することも可能である。この手法の主な欠点は、個々のジンクフィンガーの特異性が周囲のジンクフィンガードメインやDNAと重複している可能性があり、周囲の環境によって影響を受け得ることである。この"環境依存性" (context dependence) を説明できる手法はないが、スタンダードなモジュールアセンブリ法はターゲット配列が(GNN)Nではない場合はしばしば失敗する。 目的の配列を認識するジンクフィンガーアレイを作成するために複数のセレクション法が利用されてきた。初期のセレクション法では、部分的にランダマイズしたジンクフィンガーアレイのプールから特定のDNAターゲットに結合するタンパク質を選抜するファージディスプレイを利用していた。 最近では、酵母ワンハイブリッド法、細菌ワンハイブリッド法、細菌ツーハイブリッド法、または哺乳類細胞などが利用されている。新規のジンクフィンガーアレイを選抜する有望な新しい手法では細菌ツーハイブリッド法を利用しており、創案者たちから"OPEN"と呼ばれている。 このシステムでは、事前に選抜された特定の3塩基対に結合するジンクフィンガープールをつなげ、2度目のセレクションを行ない、目的の9塩基対に結合可能な3フィンガーアレイを選抜する。 このシステムは、商用のカスタムジンクフィンガーアレイに変わるものとしてジンクフィンガーコンソーシアムによって開発された。 DNA切断ドメイン DNA-cleavage domain：DCD II型制限酵素のFokⅠ由来の配列非依存的DNA切断ドメインがZFNsの切断ドメインとして利用されている。 この切断ドメインはDNAを切断するために二量体化する必要があり、非回文 (non-palindromic) 配列をターゲットとするには2種類で1セットのZFNが必要になる。標準的なZFNsではジンクフィンガードメインのC末端とDNA切断ドメインのN末端が融合している。 2つの切断ドメインが二量体化し且つDNAを切断するためには、個々のZFNがDNAの異なる鎖を認識し、各C末端が一定の間隔になるようにDNAに結合しなければならない。最もよく利用されているジンクフィンガードメインと切断ドメインを繋ぐリンカー配列では、各結合配列の5'端が5から7塩基対離れている必要がある。

  Transcription Activator-Like Effector Nucleases：TALEN、TALE Nuclease　←→ヌクレアーゼ Transcription Activator-Like Effector：TALエフェクター、TALE 椊物病原菌Xanthomonas由来のエフェクター 高度に保存されたaa 33〜35からなるDNA結合ドメインを有す。 TALEN：酵素 TALE-TF：転写因子 部位特異的ヌクレアーゼによるゲノム編集 TALEタンパク質のDNA結合ドメインと、制限酵素のFokⅠのヌクレアーゼドメインを融合したハイブリッド酵素 人工ヌクレアーゼは、DNAに特異的に結合するドメインと、FokⅠのDNA切断ドメインを連結させたキメラタンパク質 TALENはヘテロダイマーとなり、認識配列を有する2本鎖DNAを切断する。切断に続いて、細胞内の機構を利用した非相同末端再結合（Non-Homologous End Joining：NHEJ）による修復が起こり、これにより任意の遺伝子の挿入・欠失が行われる。 TALENと同様に人工ヌクレアーゼであるジンクフィンガーヌクレアーゼ：ZFNでは1つのDNA結合モジュールがDNA鎖中の3塩基対を認識し、DNA結合ユニット全体では通常12塩基対を認識するが、DNA結合モジュールの組み合わせによっては塩基認識がうまくいかないことがある。 TALENでは1つのDNA結合モジュールが1塩基対を認識し、DNA結合ユニット全体で17塩基対を認識するので、どの生物種ゲノムのどのような部位のDNA配列も標的とすることができ、ZFNを用いるよりも特異的な切断が可能となっている。 TALENはZFNよりもヌクレアーゼの結合部位が長いので、off-site cuttingのリスクがより低減されている。

  CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins）　参考1/2/3/4/5 2013年に報告されたZFN、TALENに続く第3世代のゲノム編集ツール Jennifer A. Doudna（1964〜、カリフォルニア大学バークレー校）とEmmanuelle Charpentier（1968年〜、感染症研究ヘルムホルツセンター）（ともに女性研究者）が開発した。 ★CRISPR-Casシステム　←→工学 「CRISPR-Casシステム：獲得免疫に似た細菌の防御システム：外来ゲノム排除機構」 CRISPR-Cas9 は、本来、外来性ウイルスやプラスミドへの獲得免疫を与える微生物の適応免疫システムとして、細菌や古細菌において発見された。 CRISPR-Casシステムを持つバクテリアは、ウイルス、ファージやプラスミドが侵入すると、ウイルスなどのDNAの一部を切り取り、バクテリアのゲノム上のCRISPR領域に組み込みむ。 Casタンパク質がウイルスなどのPAM配列を認識して、その上流数十bpを切り取り、リピート配列とともに自身のCRISPR領域の上流側にに組み込みむ。 CRISPR領域は一連のpre-crRNAとして転写された後、Casタンパク質複合体によってリピート配列が切断されてcrRNAとなる。 crRNAは別のCasタンパク質と複合体を形成し、スペーサー配列と相補的に進入したプラスミド（ファージ）の配列を認識し、切断除去する。 バクテリアが再び同じウイルスに感染しても、ウイルスのDNAやRNAと適合するcrRNAを持ったCasタンパク質複合体が反応し、そのウイルスを攻撃し、排除する。 バクテリアDNA領域 CRISPR-associated genes：cas遺伝子群 CRISPR領域の近傍：リーダー配列の上流にある遺伝子群 Casタンパク質をコードする遺伝子群 Daniel H. Haftらは2005年に、CRISPR/Casシステムをcas遺伝子群の構成の類似性から8種類のサブタイプに分類した。 CRISPR-associatedタンパク質群、Casタンパク質 ウイルスの防御システムに関わるバクテリアのタンパク質：CRISPR-Casによる免疫・防御システムに関与しているタンパク質 cas遺伝子群がコードするタンパク質 ヌクレアーゼ（Cas9ヌクレアーゼなど）やヘリカーゼを含む。 45種類のファミリーが見つかっている。数種類のサブユニットからなる巨大な分子複合体を形成しているものもある。 ファージやプラスミドが侵入してくると、Cas1タンパク質が侵入DNAのPAM配列を認識してその上流数十bpを切り取り、リピート配列とともに自身のCRISPR領域の上流に取り込む。 侵入した外来性DNAは、Cas9ヌクレアーゼによって切断された後、取り込まれ、保存されたリピート配列によって挟まれたスペーサー配列形態をとってCRISPR領域に取り込まれまる。　　：Adaptation phase 　↓ 　↓ crRNAを持ったCasタンパク質複合体は、ウイルスを攻撃し、排除する。 リーダー配列　leader sequence CRISPR領域の上流にある。 AT richな領域 プロモーターの位置する領域で、Expression phaseにおいて、CRISPR領域の転写に関わる。 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat：CRISPR 原核生物における一種の獲得免疫系として働く座位、塩基配列 細菌が外来性遺伝子の侵入を記憶して再感染時に抵抗する「細菌の獲得免疫機構」 ウイルス、ファージやプラスミドなどの外来の遺伝性因子に対する抵抗性に寄与している。 この配列は、バクテリアが自分の細胞内に入りこんできたウイルスを攻撃するときに使われ、入ってきたウイルスを記憶することで、外敵から身を守る。 ゲノム配列が明らかにされている約2万5千種類の真正細菌と約340種類の古細菌のうちの約50%の真正細菌と約90%の古細菌に見つかっている。 　[Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat：CRISPR] クラスター化された、等間隔にスペーサーが入った、短い回文型の、リピート配列 リピート配列 （Repeat） がゲノム上に限局的に密集し （Clustered）、隣接リピート間の間隔は規則的な長さで （Regularly Interspaced）、リピート配列自体は短く回文構造をもつ （Short Palindromic） ことを示している。 1987年 石野良純教授（阪大→九大）らがに大腸菌のDNAを調べている時に発見した、繰り返し配列（CGGTTTA……） アルカリフォスファターゼアイソザイム変換に重要な遺伝子iapの3′末端側に隣接する配列として紹介した。 2000年 類似の反復クラスターがその他の真正細菌や古細菌で見つけられ、この時はShort Regularly Spaced Repeats ：SRSRと名付けられた。 2002年 CRISPRと命名された。 2007年 CRISPRが細菌のファージ感染への抵抗性にかかわっていることが実験的に証明さた。次いでプラスミド転移 や自然形質転換の抑制機能に関しても報告された。 CRISPRはリピート配列とスペーサー配列という２種類のDNA配列の繰り返しによって構成されている。 CRISPRの上流にはリーダー配列が存在し、さらに上流にはcas遺伝子群が存在する。 CRISPR座位、CRISPR領域 典型的なCRISPRはパリンドローム（回文）様配列を含む25〜40 塩基の配列（リピート）が25〜40塩基（スペーサー）を介して数回〜20回繰り返している領域 CRISPR領域の数、リピートの数と塩基、配列、cas遺伝子の種類と数は細菌によって異なる。 反復数は多いもので249回に及ぶ。 CRISPR座位は、配列決定された細菌の40%、および配列決定された古細菌の90%にみられ、特定細菌では１ヶ所以上にその座位が存在する可能性がある。 Adaptation phase ：ウイルス（ファージ）由来のDNAなど、細胞へ侵入したDNAの一部が切り取られ、新たなスペーサーとしてCRISPR領域に取り込まれる。 　　↓ Expression phase：CRISPR領域は転写されてpre-crRNAが生じ、pre-crRNAは切断されてcrRNAが生じる。 リピート配列　←→逆向き反復配列 約25〜50 bpのパリンドローム（回文）様の繰り返し配列 リピート配列は同一のCRISPR内では共通した配列 Victor Kuninらは2007年に、CRISPRはリピート配列の相同性によって12種類に分類した。そのうち６種類のリピート配列はパリンドローム構造を保有していて、ステムループ構造をとる。 スペーサー配列　←→スペーサー 約25〜40 bp リピート配列の間に挟まれている配列 スペーサー配列はそれぞれ特異的な配列をしているという特徴がある。 スペーサーはcrRNAを産生する鋳型として機能する。 スペーサーがファージ由来のDNAやRNAあるいは小環状DNAであるプラスミドなどの外来DNAの塩基配列の1部分と同じ配列を持つ場合、それらの外来DNAやRNAはCRISPR-Casシステムによって異物と認識され除去される。 前駆crRNA　pre-CRISPR RNA：pre-crRNA CRISPR領域が転写されて生じる1本RNA pre-crRNAのリピート部分がCasタンパク質によって切断され、スペーサー単位の低分子RNAであるcrRNAが生成される。 　＠Expression phase 　　　↑ ウイルス、ファージDNA or プラスミド（外来ゲノム） プロトスペーサー　Proto-spacer 外部から細菌に侵入したDNAのうち、CRISPR領域に新たなスペーサーとして組み込まれる配列 Type I，-IIシステムではプロトスペーサーの5′末端あるいは3′末端にPAMがあり、それがプロトスペーサーの目印になっている。 プロトスペーサー隣接モチーフ　Proto-spacer Adjacent Motif：PAM PAMはsgRNA配列と同一の側鎖に存在する必要があり、またsgRNAの一部であってはならない。 3塩基のN-G-G配列 PAM配列は生物系統やCRISPR-Cas9タンパク質の種によって異なり、S. pyogenes Cas9に対応する配列は5'-NGGである。 ★CRISPR-Cas9 - ゲノム編集（工学）ツール　←→CRISPR-Casシステム　参考1 「CRISPR-Casシステム：獲得免疫に似た細菌の防御システム：外来ゲノム排除機構」の応用 CRISPRのメカニズムは、遺伝子のノックダウンへの応用で知られる真核生物のRNA干渉 （RNAi） に類似したものであることが知られている。 CRISPR-Cas9とRNA干渉の共通点 両者はともに、外来配列の細胞内侵入に応答して転写され、マイクロRNAとして標的配列と相補的結合し、標的配列を切断する機構をもつ。 CRISPRのみにみられる特徴 外来性の遺伝子断片をゲノム上に保存できる。 外来性遺伝子の再侵入時に獲得免疫系として機能する。 複数の外来性遺伝子断片が限局した領域内にリピート配列を介在して整列している。 転写後に1スペーサー単位でプロセッシングされる。 CRISPR-Casは、そのデザインの容易さ、効率の高さ、および比較的安価であることから、遺伝子疾患の原因となる変異修正への利用や、期待しない結果の要因となってしまう場合もある従来の無作為導入遺伝子組込みの代替法として期待されている。 CRISPR-Casシステムで標的となるのは細菌に感染するウイルスであるファージそのものではなく、そのDNAやRNAである。 DNA二本鎖を切断（Double Strand Breaks=DSBs）してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる新しい遺伝子改変技術 CRISPR-Cas9システムの発見により、いかなる遺伝子も、簡単に、迅速に、かつ高い効果でノックアウト、あるいはノックインすることが可能となった。 CRISPR-Cas9 技術を利用した標的ゲノム編集は、1）短鎖ガイドRNAと、2）Cas9ヌクレアーゼの2つの要素で構成される。 部位特異的な20塩基短鎖ガイドRNAを利用して、Cas9ヌクレアーゼをその標的座位に誘導する。 CRISPRという塩基配列とCas9というDNA切断酵素と、切断させたい場所へとCas9を誘導するガイドRNAを使うことで、任意の場所のDNAを切断するゲノム編集ツール 「CRISPR-Casシステム：獲得免疫に似たBacteriaの免疫システム：外来ゲノム排除機構」の応用 Bacterial immune system Targetted genome editting Invading genome Genomic DNA Matching invaded sequence Matching genome sequence crRNA sequence from previous sequence Genome specific crRNA sequence Host tracrRNA and Host crRNA Genome specific crRNA sequence tracrRNA-crRNA chimera 細菌のCRISPR/Casシステム ゲノム編集 外来侵入性DNA（Invading genome）が、宿主細菌のCRISPR RNA （Host crRNA）と相補的に結合する。 切断したいゲノムDNA（Genomic DNA）と相補的なcrRNAを合成する。 crRNAの相補的配列以外の部分(もとのCRISPRのリピート部分)とtrans-activating crRNA (Host tracrRNA)が相補的に結合する。 crRNAとtracrRNAを融合させて、tracrRNA-crRNAキメラを作る。これをガイドRNA と呼ぶ。 ヌクレアーゼ (RNA-guided nuclease; RGN)を呼び込み、目的の部位でゲノムDNAを切断する。 CRISPR-Casシステムには、主に3つの段階がある。 Adaptation phase→Expression phase→Interference phase Adaptation phase バクテリオファージやプラスミドなどに由来する外来性遺伝子断片のCRISPR内への獲得 外来性DNAはCas9ヌクレアーゼによって切断される。 PAM配列依存的もしくは非依存的に、CRISPRの始端側に獲得する。 切断されたDNAは捕捉され、保存された反復配列により挟まれたスペーサー配列形態をとってCRISPR座位に取り込まれる。 生じたスペーサーは、crRNAを産生する鋳型として機能する。 外部から侵入してきた異物を「記憶」するシステムであり、CRISPR-Cas システムが獲得免疫と呼ばれる所以である。 Expression phase 転 写・プロセッシングによるCRISPRの発現 転写はリーダー配列にあるプロモーター領域から始まる。 CRISPR領域は1本の前駆crRNA：pre-crRNAに転写される。 転写後のプロセッシングでは、スペーサーの両側に隣接するリピートが部分的に連結された形でpre-crRNAが切断され、外来配列を含む小さなRNA断片：crRNAとなる。 pre-crRNAのリピート部分がCasタンパク質によって切断され、スペーサー単位の低分子RNAであるcrRNAが生成される。 I 〜 III型のそれぞれに特異的なCasタンパク質群が、pre-crRNAのプロセッシングを行うとともに、crRNAとの複合体を形成する。 Interference phase 外来性遺伝子の切断 crRNAは外来侵入性DNAに相補的に結合し、これがガイダンス分子となりCas9タンパクを呼び込む。 Cas9はDNAを切断するヌクレアーゼであり、外来DNAに結合したcrRNAおよび一部相補的なtracrRNAと複合体を形成する。この複合体が外DNAを切断することよって、外から侵入したDNAの機能を抑制、排除する。 crRNAとtracrRNAは複合体を形成してガイド鎖として機能し、Cas9ヌクレアーゼを相補的な侵入DNAへと配向する。 crRNA-tracrRNA複合体はsgRNA（ガイドRNA、gRNA）としてゲノム編集を行う。 DNAに結合したCas9タンパク質は、「crRNA相補鎖」と反対鎖をそれぞれNHNおよびRuvC1様ヌクレアーゼドメインを介して切断する。 PAM配列は、Cas9/sgRNA複合体が切断部位を探索するときの目印である。 概念としては、真核生物のRNA干渉(RNAi)に近い機構であるが、異なる部分も多い。 外来侵入性DNA、ゲノムDNA 単鎖ガイドRNA single-guide RNA：sgRNA sgRNA は、CRISPR-Casにおける標的認識に利用される2つのRNA分子（crRNAとtracrRNA）のキメラであり、2012年にJinekらによって紹介された。 設計された単鎖キメラRNAであり、細菌性tracrRNAの足場機能と細菌性crRNAの特異性を併せ持っている。 さらに、S.pyogenes Cas9（野生型Cas9）では、DNA結合用にPAMとして知られる3塩基のN-G-G配列が特異的配列の直後に必要 標的部位特異性を担う20塩基の可変領域を持つ。 gRNAは、目印を付けたゲノムDNA配列にCas9タンパクを呼び込む。Cas9は、ゲノムDNA上のPAM配列を認識し、その上流をnuclease活性によって切断する。これにより、任意のゲノム部位でDNAが切断できることになる。 gRNAの5'末端側の最後の20塩基はホーミング装置として働き、PAMの直前に位置する特異的DNA標的部位へRNA-DNA塩基対形成を介してCas9／gRNA複合体を動員する。そのため、現在利用可能なCRISPR-Cas9システムは、いかなる5'-N20-NGG DNA配列へも配向し、精度の高い二本鎖切断を産生することができます 短鎖CRISPR RNA：crRNA S.pyogenesのcrRNA（native crRNA）は42塩基 外来配列を含む小さなRNA断片、スペーサー単位の低分子RNA CRISPR座位にあるスペーサーは、crRNAを産生する鋳型として機能する。 Expression phaseの転写後のプロセッシングで、スペーサーの両側に隣接するリピートが部分的に連結された形でpre-crRNAが切断され、crRNAとなる。 crRNAはtracrRNAと共に複合体を形成してガイド鎖として機能し、Cas9ヌクレアーゼを相補的な侵入DNAへと配向する。 crRNAには標的となるゲノムと相補的に結合している部分と、tracrRNAと相補的に結合している部分がある。 crRNAはRECローブ内の架橋ヘリックスに結合してCas9ヌクレアーゼと複合体を形成し、crRNA骨格をもつ複数の塩橋を形成する。 トランス活性化型crRNA、transactivating CRISPR RNA ：tracrRNA S.pyogenesのtracrRNA（native tracrRNA）は89塩基 ゲノム上のCRISPRとは別の領域から転写されたRNA Cas9ヌクレアーゼ Cas9 nuclease＠Casタンパク質 Cas9は原核生物のもつCRISPR-Casに関わるRNA依存性DNAヌクレアーゼとして発見された。 化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）由来Cas9ヌクレアーゼ 侵入した外来性DNAを切断するヌクレアーゼ エンドヌクレアーゼ II型CRISPRシステム Cas9ヌクレアーゼはRNA結合ドメイン、αヘリックス認識ローブ（REC）、DNA切断用RuvCとHNHを含むヌクレアーゼローブ、およびPAM相互作用部位を有す。 Cas9ヌクレアーゼは2二本鎖のDNAを切断して二本鎖切断（DSB）を誘導する。 Cas9 Nickase（Cas9（D10））　←→ニッカーゼ Cas9 の変異体D10A は，Nickase として機能することが報告されている。 Cas9（D10A）は，野生型Cas9 のようにDNA 二本鎖を切断せず，一本鎖のみを切断しニックを入れる。そのため相同組換えによるゲノム編集において、二本鎖切断により引き起こされるDNA 修復機構NHEJ（非相同末端再結合）が起こらず、望ましくない領域での遺伝子欠失・挿入やオフターゲット効果を抑制することができる。 また、最近では２種類のguide RNA を用いて２か所にニックを入れることで、二本鎖切断によるノックアウトで細胞株におけるオフターゲット効果を50 〜 1,500倍まで減少できた例が報告されている。 オフターゲット効果　off-target effects　←→分子標的薬 標的遺伝子以外（オフターゲット）の遺伝子に対して非特異的にRNAi効果を示してしまう現象 CRISPR-Cas 自身にはオフターゲット（作用）変異誘発性を生ずる傾向があることもわかってきた。 特定のDNA配列を切断するゲノム編集技術CRISPRで利用されている酵素Cas9は、標的外の部位も切断することが知られている。 特定のターゲット遺伝子以外の1個または2〜3個の遺伝子に生じる効果で、siRNAまたはd-siRNAプールの導入後に遺伝子機能の抑制がみられる。 siRNAによる非特異的な遺伝子の発現抑制効果．当初は，21塩基のうち1塩基でも異なればsiRNAによる目的遺伝子の発現抑制効果はかなり減少し、非常に特異性が高いと考えられていた。しかし、マイクロアレイを用いたいくつかのゲノムスケールの研究から、場合によっては予想以上に多くの遺伝子の発現に影響を与えていることが明らかとなってきている。 オフターゲット効果はsiRNAのセンス鎖によって媒介され、意図しない遺伝子の機能喪失を開始させる。標的とは無関係な遺伝子の発現がノックダウンされるのに十分な相同性がある場合は、オフターゲット効果が特定のsiRNAのアンチセンス鎖の二次的効果として生じることもある。 オフターゲット領域はsgRNA配列と相同なゲノム配列を検索することによって予測可能。さらにはエクソームシーケンスまたは全ゲノムシーケンスを行うことによって、ターゲット領域の変異確認だけでなくオフターゲット領域の変異の有無を確認することも可能。 Fuらは3種の内在性ヒト遺伝子に対するsgRNA（ガイドRNA、gRNA）を作製し、レポーターアッセイの結果をもとに各sgRNA（ガイドRNA、gRNA）がオフターゲット作用を示すであろう、他の部位を予測した。ほぼ全てのオフターゲット部位には標的RNAとの間に複数のミスマッチが存在した。さらにFuらは、T7エンドヌクレアーゼI アッセイにより挿入欠損の存在を検出し、これらの予測されたオフターゲット部位は、しばしば挿入欠損を保持し、さらにこの数は元来の標的部位に比べて同等またはそれ以上あることを見つけた。sgRNA（ガイドRNA、gRNA）と染色体配列間で、最大5つのミスマッチが存在する場合であっても、検出可能な挿入欠損を形成する場合があった。分析した染色体の標的や使用した細胞において、ミスマッチ寛容性の程度がsgRNA（ガイドRNA、gRNA）によって変わることが示された。

◯遺伝子サイレンシング gene silencing、ジーンサイレンシング

• 一般にクロマチンへの後天的な修飾により遺伝子を制御する、いわゆるエピジェネティクス的遺伝子制御のことを示す。
• 遺伝子サイレンシングという用語は通常、遺伝子組み換え以外の機序で遺伝子の「スイッチを切る」ことを記述するために用いられる。
• 正常な環境下で発現する（スイッチが入る）遺伝子のスイッチが細胞内の何らかの機構により切られることを意味する。
• 遺伝子サイレンシングは機構の違いにより、転写型遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングに分類される。

  転写型遺伝子サイレンシング Trascriptional Gene Silencing ゲノムインプリンティング パラミューテーション トランスポゾン抑制（Transposon silencing） トランスジーン抑制（Transgene silencing） 配置効果（position effect）

  転写後遺伝子サイレンシング post-Transcriptional Gene Silencing） RNA干渉：RNAi ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）

  
  
  

  ゲノム刷り込み、ゲノムインプリンティング　genomic imprinting：GI 哺乳類に特徴的なエピジェネティックな現象 一般に哺乳類は父親と母親から同じ遺伝子を二つ（性染色体の場合は一つ）受け継ぐが、いくつかの遺伝子については片方の親から受け継いだ遺伝子のみが発現することが知られている。このように遺伝子が両親のどちらからもらったか覚えていることをゲノムインプリンティングという。 遺伝子は通常、親由来にかかわらず同等に働くが、例外的に、父親由来のときのみ働く遺伝子（父性発現遺伝子：PEG）や母親由来のときのみ働く遺伝子（母性発現遺伝子：MEG）が存在する。 このPEG とMEGの片親由来発現遺伝子を総称してインプリンティング遺伝子（imprinted genes）と呼ぶ。 父性発現遺伝子　paternally expressed gene：PEG 父親由来のときのみ働く遺伝子 PEGは、母親由来の時に発現しないためにmaternally imprinted geneとも呼ばれる。 プラダー・ウィリー症候群：PWSでは染色体15q11-13領域のPEGが作用しなくなることで発症する。 母性発現遺伝子　maternally expressed gene：MEG 母親由来の時のみ働く遺伝子 MEGは父親由来のときに発現しないためにpaternally imprinted gene とも呼ばれる。 哺乳類の父親・母親由来の2つのアレルのうち特定の一方だけが発現するように、親の配偶子形成過程で遺伝子に何らかのマークづけを行なう現象。「インプリント」とは、遺伝子の発現を抑制するマーキングのことであり、ゲノム配列の変化ではなく、CpG配列 (CpG islands)のメチル化などの可変的な修飾によるものであり、このためにエピジェネティクスという用語が用いられる。 インプリンティングを受ける遺伝子の近傍にはメチル化可変領域と呼ばれる領域がある。 メチル化可変領域　differentially methylated region：DMR インプリンティングを受ける遺伝子の近傍にある、DNAメチル化の状態が対立遺伝子に特異的な発現を制御している領域 メチル化可変領域における両親に由来するDNAメチル化の違いは雌雄の生殖細胞において確立され、これが受精卵にもち込まれて維持される。 SNRPN遺伝子上流のDMRがインプリンティングセンターとして作用し、このDMRは父親由来の時非メチル化状態、母親由来の時メチル化状態で存在する。 このメチル化状態がインプリンティングの維持に必須であるため、DMRはインプリンティングセンターとも呼ばれる。 哺乳類では単為発生が致死であること、特定の染色体が片親に由来するダイソミーに異常がみられることからわかるように、正常発生には父親、母親由来の両方のゲノムが必須である。実際、哺乳類の常染色体には一方の対立遺伝子だけが発現する遺伝子座があり、これが父親、母親由来ゲノム間の機能的な差をもたらしている。 子が受け継いだ多くの遺伝子は、原則的に父親由来と母親由来の対立遺伝子が両方働く、もしくは働かないように制御されている。しかしインプリント遺伝子は、父親由来あるいは母親由来の片方の遺伝子がメチル化されており、遺伝子が発現しないように制御される。結果的に、一方の親から受け継いだ遺伝子のみ選択的に機能することになる。例えば、父親由来でのみ働くインプリント遺伝子の場合、母親由来の対立遺伝子にDNAメチル化が起こり発現されない仕組みになっている。 ゲノムインプリンティング受ける遺伝子の数は全遺伝子のほんの数%にすぎないが、これらの遺伝子の存在のため、哺乳類では単為発生は流産に終わる。またゲノムインプリンティング遺伝子を含む染色体領域が片親に由来するダイソミーマウスも、発生、成長、行動などに種々の異常を生じることが知られている。 ゲノムインプリンティングの異常は種々のヒト疾患や発がん過程にも関与する。 プラダー・ウィリー症候群：PWSは15番染色体q11-q13の父親由来が欠損するか、または母親染色体ゲノムインプリンティングダイソミーによっておきる遺伝子疾患である。 単為発生　parthenogenesis 単為生殖、処女生殖ともいう。卵が受精することなく単独に発生すること。ある種の動物では、単為発生することが知られていて、ミツバチ・アリマキ・ミジンコなどの無脊椎動物でよく知られているが、鳥や爬虫類を含む多くの脊椎動物で単為発生がみられる。 昆虫では例えば、ミツバチでは、卵が受精して発生するとメス（働きバチや女王バチ）になり、未受精で染色体が半数のまま発生するとオスになる。 ダイソミー　uniparental disomy マウスでは、核型は正常だが特定の染色体またはその一部が一対とも片親に由来する個体を作ることができる。これをダイソミーという。 片親性ダイソミー（uniparental disomy; UPD） 一対の相同染色体がどちらも片方の親から由来し、他方の親からは由来しない状態 片親性ダイソミーはtrisomy rescue、gamete complementation、monosomy rescue、postfertilization errorにより発症し、高齢出産は第一減数分裂の不分離に起因するtrisomy rescue発症リスクとなる。 父性ダイソミー（paternal disomy）：染色体領域が両方とも父親由来 母性ダイソミー（maternal disomy）：染色体領域が両方とも母親由来 ダイソミーも、インプリンティング遺伝子が異常発現してしまったことに起因する。

  トランスポゾン　transposons、転移因子　Transposable elements：TEs　参考1 広義には細胞内でゲノム上の位置を移動する（転移する）DNA配列を指す。 細胞内の染色体上をあちこち動く遺伝子 宿主生物のゲノム上を「動く（＝転移）」ことのできるDNA因子 時にJumping genes、移動するDNA：英語では"mobile DNA"とか表現されたりもする。 転移酵素の働きによってゲノム上の位置をランダムに移動する配列 Barbara McClintock（1902〜1992年、1983年に単独女性として初めてノーベル生理学医学賞を受賞）が発見した移動するDNA McClintockは1940年代にゲノムが動的で、遺伝子の場所が変化することを発見した。トウモロコシの研究において、美しく混ざり合った実の色は通常の遺伝法則に従っていないことを見つけた。細胞の内側を見ると、染色体が形を変えて隣接する染色体と一部分を交換していた。この研究から、色の変化は色を作り出している遺伝子全体からDNAの特有の断片を除去することによって起こっていることを見いだしたのである。彼女はDNA断片がある場所から切り出され他の場所に貼り付けられる過程を転移と呼んだ。 転移酵素、トランスポザーゼ　transposase トランスポザーゼはトランスポゾンをゲノムから切り出す働きと、切り出されたトランスポゾンをゲノムに挿入する働きの両方を持っている。 トランスポザーゼはトランスポゾンの両末端に位置する逆向き反復配列を認識してトランスポゾンを移動させるため、原則として2つの逆向き反復配列の間にどのような配列が挿入されていようともトランスポゾンは移動可能である。そのため、2つの逆向き反復配列間に目的遺伝子が挿入されたトランスポゾンを細胞内に導入し、トランスポザーゼにより染色体へと移動させることで目的遺伝子を染色体へ組込むことが可能である。 逆向き反復配列、逆位反復配列、逆方向反復配列　inverted repeat sequences　←→リピート配列 二本鎖DNAの特定の配列領域が2カ所あって、それが互いに逆向きになっている状態． 同一のDNA配列が逆向きに配置されている反復配列 多くの植物の葉緑体ゲノム上には5〜76 kbp の長い逆位反復配列が一対存在していて、逆位反復配列内にリボソームRNA遺伝子が存在している。 挿入配列　insertion sequence element, insertion element, IS element：IS　←→Class Iトランスポゾン 単純な転移因子として働く短いDNA配列 挿入配列は2つの大きな特徴を有する。挿入配列はその他の転移因子（一般的に長さおよそ700から2500 bp）と比較して小さく、転移活性に関わるタンパク質のみをコードしている。したがって挿入配列はその他のトランスポゾンとは異なる。 他のトランスポゾンは抗生物質耐性遺伝子といったアクセサリー遺伝子を持っている。 これらのタンパク質は、ISの移動を許す酵素反応を触媒するトランスポザーゼと、転移活性を刺激または阻害する一つの制御タンパク質である。挿入配列中のコード領域は大抵逆向き反復配列に守られている。 トランスポゾンは2つのclassに分けられる。 Class Iトランスポゾン　←→レトロトランスポゾン Class Iトランスポゾンはinsertion sequence ：ISを両端に持ち、その間に薬剤耐性遺伝子や細菌毒素遺伝子が挟まれているものである。 この遺伝子が動き回るのに必要な transposase は IS にコードされる。 Class Iトランスポゾンは transposition によりトランスポゾンのコピーが増えないので non replicative transposition と言われる。 Class IIトランスポゾン　←→DNA型トランスポゾン Class IIトランスポゾンは短い逆向き繰り返し構造 (IR) 両端に持ち、その間にトランスポザーゼ、薬剤耐性遺伝子を持つものである。 Class IIトランスポゾンは co-integrate構造を介し resolvase によって transposition が完成するが、Class Iトランスポゾンは介さない。 Class IIトランスポゾンはtransposition によりコピーが倍になるので、replicative transposition と言われる。 トランスポゾンはトランスポザーゼの作用により元の位置から切り出され、別の位置へと組込まれることで染色体上を移動する。 転移因子は、その転移様式の違いにより、DNA型トランスポゾンとレトロトランスポゾンの二種類に分類される。 DNA型トランスポゾン カット＆ペースト型の転移をするトランスポゾン、DNA断片が直接転移する。 トランスポゾンは、自身のDNA配列を切りだして、別の場所に再挿入することで転移する（カット&ペースト）。 トランスポゾンは自分で移動しているというよりは、トランスポザーゼによって移動させられる。 DNA型トランスポゾンはゲノムからDNAのまま切り出され、新たな位置に挿入転移する。DNA型トランスポゾンも転写されるが、それは自身の遺伝子（転移に必要な転移酵素遺伝子）を発現するためのmRNAとして働く。 単にDNAを切断したり繋ぎ直したりするだけの酵素では、トランスポゾン以外の部分のDNAも動かしてしまうが、トランスポゾンの両端には「ここからここまでがトランスポゾン」ということを示すためのDNA配列がある。この両端のDNA配列は逆向き反復配列と呼ばれる。 クラスIIトランスポゾンとも呼ばれ、トランスポザーゼをコードしている。このトランスポザーゼがトランスポゾンの両末端にある逆向き反復配列を認識してゲノムから切り出し、切り出されたトランスポゾンDNAをゲノム上の別の位置に再び挿入させる。DNAトランスポゾンの種類によって、挿入のターゲットとなるゲノム配列の選好性は異なる。 DNAトランスポゾンは自律性と非自律性の2種類に分けられる。 自律性トランスポゾン　autonomous transposable elements 自律性トランスポゾンは上記のように内部にコードするトランスポザーゼを用いて転移する。 非自律性のトランスポゾン 内部にタンパク質をコードしておらず、自律性因子と類似した逆向き配列を持つ数百塩基対程度の短い因子 非自律性因子は自律性因子がコードするトランスポザーゼを利用して転移する。 DNA型トランスポゾンは一般にRNAトランスポゾン型にくらべてコピー数は少ないが、DNA型トランスポゾンの中にもRNA型に匹敵するほど大量にコピーを増やしているものがある。その代表はMITEと呼ばれるクラスのトランスポゾン 短い非自律性トランスポゾン　miniature inverted-repeat transposable element：MITE MITEは様々な真核生物でみつかり、その配列は様々だが、次のような共通の特徴をもつ。 長さがたかだか数百bpと短い 両末端に逆向き配列（IR）をもつ。 その外側に短い同方向の反復配列（ダイレクト・リピート、TSD）をもつ。 内部に転移酵素遺伝子をコードしていない非自律的な転移因子 非常に均一性の高いコピーが非常に大量に（ときには数万コピー以上まで）増幅している。 RNA型トランスポゾン、レトロポゾン retroposon、レトロトランスポゾン　→piRNA レトロトランスポゾンは、クラスIの可動因子である。 転写と逆転写の過程を経るRNA型トランスポゾン ヒトゲノムの中で、タンパク質の情報を転写・翻訳する遺伝子は約2万個であるが、これはゲノム全体のわずか1.5%であり、ゲノムの約半分をレトロトランスポゾン由来のDNA配列が占めている。 レトロトランスポゾンは、自身のDNA配列から転写されたRNA配列を、逆転写反応でDNAにコピーし、このコピーをゲノムの別の場所に挿入することで転移する（コピー＆ペースト）。 レトロトランスポジション（またはレトロポジション）と呼ばれる転移機序を持つレトロトランスポゾンであり、いわゆるコピー＆ペースト型の転移をおこなう。 レトロポゾンはレトロウイルスの起源である可能性も示唆されている。 ヒトゲノムには、約45万コピー（ゲノムの8％）存在するが、現在も転移する能力を持つ配列は存在していない。 Class Iトランスポゾンとも呼ばれる。転移の際、まずレトロトランスポゾン配列が内部プロモーターによって転写され、自身がコードする逆転写酵素が翻訳される。逆転写酵素はレトロトランスポゾンRNAを鋳型としてcDNAを合成し、それをゲノム上の別の位置に挿入させる。したがってすべてのレトロポジションはレトロポゾン配列のコピー数の増加を伴い、ゲノムサイズに大きな影響を与えることが知られている。 レトロトランスポゾンは、主にLTR型レトロトランスポゾン（8%）、長鎖散在反復配列：LINE（20%）、短鎖散在反復配列：SINE（134%）の三種類に分類される。 long terminal repeat（LTR）型レトロトランスポゾン　←→LTR LTR型レトロトランスポゾンでは両末端に数百〜数千塩基対の反復配列を持ち、内部に逆転写酵素とインテグラーゼをコードしている。 レトロウイルスはLTRに加えて内部にenv遺伝子を持つが、分類上LTR型レトロトランスポゾンに含まれることが多い。 LTR型レトロトランスポゾンにもLTRのみを持つ非自律性因子が知られており、それらは長さに応じてLARDやTRIMと呼ばれることもある。 非LTR型レトロトランスポゾン 非LTR 型レトロトランスポゾンは長鎖散在反復配列：LINEを有するものと短鎖散在反復配列：SINEを有するものとの2種類に分けられる。 長鎖散在反復配列　long interspersed element：LINE LINEは内部に逆転写酵素とエンドヌクレアーゼをコードする。LINEタンパク質はLINE RNAの3’末端配列を認識して結合し、逆転写およびゲノムへの挿入をおこなう。 LINEには様々な種類が知られていて、生物群ごとにそれぞれ異なる種類のLINEがゲノムの大きな割合を占める。哺乳類ではL1と呼ばれるLINEが主要であり、ヒトゲノムの約17％はL1が占めている。一方、ニワトリゲノムではCR1、ゼブラフィッシュではL2がレトロトランスポゾンの中で最も大きな割合を占める。 L1レトロトランスポゾン　long interspersed nuclear element–1 retrotransposons：LINE-1、L1　参考1/2 ヒトゲノム内に最も豊富に存在する転移因子 LINE-1（L1）因子はヒトゲノムに最も豊富にある自律性のレトロトランスポゾンで、ヒトDNAの約17％に相当する。 LINE-1レトロトランスポゾンは、2種類のタンパク質すなわち、オープンリーディングフレーム（ORF）1とORF2というエンドヌクレアーゼ/逆転写酵素をコードしている。 LINE-1 RNAとORF2タンパク質は、哺乳類細胞では過剰発現系を使っても検出が難しい。 LINE-1は、プロモーターCpGがメチル化していない状態で発現し、メチル化すると発現がおこらなくなる。 転写産物にLINE-1配列を挿入すると、RNAの発現、ひいてはタンパク質の発現が顕著に低下する。このRNA濃度の減少は、転写開始頻度やRNAの安定性が大きく変化したことによるものではない。LINE-1の発現が少ないのは、転写伸長がうまく行かないことが主な原因である。LINE-1はゲノム中に豊富に存在し、しかも広範に分布する可動性因子なので、LINE-1による転写伸長の阻害がヒト固有の遺伝子の発現に大きく影響している可能性がある。バイオインフォマティクスのデータは、LINE-1が進化の過程でヒトトランスクリプトームの微調節を行う役割を果たしてきたとの仮説に、よく一致する。 LINE-1は胚細胞において活性化していて、発生初期に重要な役割を担っていると考えられている。LINE-1のゲノム上の挿入部位には個人差や種差が強いことから、個性や進化などの多様性の獲得に関わっていることが想定されている。体細胞の多くはLINE-1がメチル化により不活化していると考えられているが、神経系細胞においては神経幹細胞から神経細胞へ分化する過程でLINE-1が活性化し、LINE-1がレトロ転位することが明らかになっている。LINE-1がレトロ転位することによって神経細胞の分化に必要なmRNAやノンコーディングRNAが発現すると考えられている。 ヒト胎児の脳から単離された神経前駆細胞やヒト胚性幹細胞から誘導された神経前駆細胞でも、改変されたヒトLINE-1がin vitroでレトロ転位を起こせる。成人の海馬などの脳領域における内在性LINE-1のコピー数は、同一個人の心臓や肝臓のゲノムDNA中の内在性LINE-1のコピー数に比べて多くなっている。この結果は、LINE-1のレトロ転位が、個体の体細胞モザイク現象や脳での遺伝子発現の不均一性にかかわっている可能性を示唆している。　参考1 maternal careなどの生後直後の経験におけるLINE-1レトロトランスポゾンのコピー数が海馬のDNA配列に影響を及ぼす。　参考1/2 オープンリーディングフレーム　Open Reading Frame：ORF タンパク質へと転写・翻訳される可能性のあるDNA配列であり、終止コドンに中断されずにアミノ酸のコドンが続く配列 DNA またはRNA 配列をアミノ酸に翻訳した場合に終止コドンを含まない読み取り枠（Reading Frame）がオープンな（Open）状態にある（タンパク質に翻訳される可能性がある）塩基配列を指す。 あるDNA二重鎖が一連のコドン（連続した3塩基の組）によってタンパク質をコードする場合、一方向に3つ、逆方向に3つ、合計6つの読み枠（reading frame）がありうる。そのうち、実際に遺伝子としてタンパク質をコードしている読み枠のことをOpen Reading Frameと呼ぶ。 遺伝子予測アルゴリズムを用いてDNA の断片配列から遺伝子の場所を探索する場合、ORF の長さが長いと遺伝子が存在している良い指標となる。ただ長いORF が存在しても必ずタンパク質に翻訳されているとは限らないので、長いORF が遺伝子であるかは実際にそのタンパク質が合成されているかを調べる必要がある。 OR1とORF2 短鎖散在反復配列　short interspersed nuclear element：SINE LINEに関連する非自律性因子 多くのSINEはtRNAに起源を持ち、RNA polymerase IIIによって転写されたSINE RNAが、LINEタンパク質を利用して転移する。そのためSINEの3’末端配列がLINEの3’末端配列と類似している例が数多く報告されている。SINEは進化的に異なる系統で独立に生成する場合が多く見られる。 逆転写された RNA 分子を表現する短い DNA 配列であり、本来なら RNA ポリメラーゼ IIIにより tRNA、rRNA、その他の核内低分子 RNA に転写されるべきものである。 SINE は、有効な逆転写酵素タンパク質のコードを持たず、転移は他の可動因子に頼っている。最も良く見られる SINE は、Alu 配列 (Alu sequence) と呼ばれるものである。 Alu 配列は、約 300 塩基対の長さがあり、タンパク質コード配列を全く含まず、制限酵素 AluI で認識される（"Alu" と云う命名は、これによる）。ヒトゲノム中には 約 100万コピー存在し、その約 11% を占める。LINE 及び SINE は、双方とも、その目的が判明しておらず、「利己的な DNA」とかジャンクDNAとも呼ばれている。SINE は、ヒトゲノムの 13.5% を占める。 トランスポゾン全体が転写された後、RNAが逆転写酵素によりDNAに逆転写され、そのDNAが新たな位置に挿入されます。つまり元のコピーが作られ転移することから、コンピューターの操作にちなんでコピー＆ペースト型の転移などと言われます。 転移因子の中でも特にレトロポゾンはゲノム中で膨大なコピー数が存在し、例えばヒトゲノムの46％を占めるなど、ゲノム構造の多様性およびゲノムサイズに大きな影響を与えている。また、転移という特徴を利用し、遺伝学的ツールとして用いることができる。 piggyBAC イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni、キャベツ尺取り虫）という蛾由来のトランスポゾン キャベツ尺取り虫の幼虫の細胞培養の過程で見つかった。尺取り虫の細胞は、昆虫のバキュロウイルス（bacurovirus,Fraser et al 1985)に広範な突然変異をもたらした。 約 2.4 kb のDNA型のトランスポゾン 発見当時はIFP2と名付けられた。 エジンバラ大学の梶圭介先生らのグループおよびトロント大学のAndras Nagyらのグループにより、piggyBacを用いて効率的に遺伝子導入することで、ウイルスを使わずにマウスおよびヒトの細胞からiPS細胞を樹立した。 トランスポザーゼにより元の位置から切り出され、別の位置へと組み込まれる。 piggyBACにより効率的に目的遺伝子を導入でき、さらに痕跡を最小限にして目的遺伝子を除去する。 トランスポゾンは、色々な関係のない昆虫に遺伝子伝達ベクターとして広く使われている。 トランスポゾンはウイルスの一種であるがが、ビリオンと呼ばれるウイルスのカプセルに紊まらない性質がある。 ピギーバック・トランスポゾンは、DNAの両端に短い逆転反復配列があり、これが染色体のTTAA配列を目標にするトランスポザーゼと呼ばれる酵素の働きによって、染色体に再生上能の組み込みを開始する。遺伝子配列にトランスポゾンが入ると突然変異を起こしたり、トランスポゾンが再結合部となって染色体の中でＤＮＡの複製や欠失が起きる。 PiggyBac Transposon Vector System トランスポゾンを用いて非ウイルス的に、目的cDNA・miRNA・shRNA配列を宿主細胞のゲノムに組み込み、安定発現細胞株を樹立することができる発現システム 一旦ゲノムに組み込んだ目的配列を、PiggyBac Transposaseにより痕跡を残さずに除去することができる。 トランスポゾン発現システム PiggyBac の原理 目的cDNA配列などを挿入したPiggyBac Transposon Vectorと、Super PiggyBac Transposase Expression Vectorを宿主細胞にコトランスフェクションする。 Super PiggyBac Transposase Expression Vectorから発現したPiggyBac Transposaseにより，PiggyBac Transposon Vector中の両端に存在するトランスポゾン特異性末端逆位配列（PiggyBac Terminal Repeat）の部分で配列が切り出される。 切り出された配列が、宿主細胞ゲノム中のTTAA部位に組み込まれ、安定発現細胞株が樹立される。 安定発現細胞株にExcision only PiggyBac Transposase Expression Vectorのみを再度トランスフェクションすると、発現したTransposaseにより、組み込んだ目的配列が痕跡を残さずに除去される。

  RNA干渉 RNA interference：RNAi　参考1 21塩基から23塩基の小さな2本鎖RNAが特定の遺伝子の発現（タンパク質合成）を抑制する現象 細胞内で二本鎖RNAと相補的な配列を持つmRNAが分解される現象のこと。この現象を利用すると、遺伝子の配列がわかれば、その遺伝子の配列に相当する二本鎖RNAを合成し、細胞内に導入することで遺伝子の働きを阻害することができる。 真核細胞、植物、動物など広く種を超えて保存されているRNAにより介在される遺伝子発現制御機構 mRNAに対して相補的な配列をもつ1本鎖RNA（アンチセンス鎖）、その逆鎖である1本鎖RNA（センス鎖）からなる二本鎖RNAによって、遺伝子発現抑制効果を示す現象 RNA干渉関連分子の機能異常が発症原因となる疾患も見つかってきている。 遺伝コードを変化させることが望ましくない場合には、ゲノム編集よりもRNA干渉介在型ノックダウンの方が好ましい。 1993年 Victor Ambros博士らは、C. elegansのlin-4遺伝子産物がタンパク質をコードしないのにもかかわらず、lin-14遺伝子産物であるLIN-14タンパク質の発現を負に調節する因子であることを見出した。 この遺伝子産物は、ヘアピン型の小分子RNAであり、標的遺伝子と結合することにより機能すると考えられた。 その後、microRNAと呼ばれるようになり、現在までに単細胞生物から哺乳動物に至る様々な生物で内在性の小分子RNAがRNA干渉のメカニズムにより遺伝子制御に関わることが見いだされ、発生や代謝、ウイルス感染防御など生命維持に欠かせない多くの現象を制御し、生体の恒常性を維持する働きを有することが分かっている。 1998年 線虫の発生遺伝学者Craig MelloとAndrew Fire両博士ら（2006年にノーベル生理学・医学賞）は、発生に関わる遺伝子の機能解析を目的として、線虫体内に、標的mRNAに対して相補的な配列をもつ1本鎖RNA（アンチセンス鎖鎖）、その逆鎖である1本鎖RNA（センス鎖）、その両者からなる2本鎖RNAを別途投与することによって、2本鎖RNAが高い遺伝子発現抑制効果を示すことを見出した。この発見は、小分子RNAを外来性に投与することにより、任意の遺伝子の発現を調節する可能性を示唆した。 これらの発見をきっかけにRNA干渉の研究は飛躍的にすすみ、現在では2本鎖RNA がsiRNAに変換されて遺伝子発現を調節するプロセスが明らかとなっている。 siRNAもmiRNAもその生合成にDicerを必要とする。また遺伝子の発現を抑制するにはArgonauteタンパク質とRNA induced silencing complex (RISC）を形成する必要がある、などお互い類似したメカニズムで起こることなどが明らかにされている。 RNA干渉を用いて、任意の遺伝子の発現を抑制することが可能である。 ヘアピン状になったshRNAを用いることが多い。配列はSiDirect 2.0などでデザインするが、実際には複数個作成して効果を確認することが推奨される。shRNAはRNAとして合成して導入するほか、ウイルスベクターやプラスミドベクターとして導入することも可能である。 RNA干渉は遺伝子機能探索の技術として細胞や個体でも応用が可能で、創薬に繋がる大きな可能性を秘めているため、基礎・応用に限らず国内外の多くの研究者がRNAサイレンシングを研究対象としている。

◯アンチセンス法 antisense method　参考1

• アンチセンス法とは、標的遺伝子RNAに対して相補鎖の1本鎖RNA（アンチセンスRNA）を用いて遺伝子発現を抑制する方法である。
• 標的遺伝子RNAにハイブリダイズすることのできるアンチセンス核酸（RNAあるいはDNA）を用いて遺伝子機能発現を抑制する方法である。アンチセンス阻害 antisense inhibitionともいう。
• 標的とする遺伝子RNAの全長もしくは一部に対する1本鎖アンチセンス核酸を細胞内に導入することで効果を発揮する。標的遺伝子RNAにハイブリダイズしたアンチセンス核酸は、標的遺伝子RNAのスプライシング阻害、および翻訳阻害を引き起こす。
• 生物研究においては化学的に安定なモルフォリノアンチセンスオリゴを用いることが多い。第三世代のアンチセンス
• 近年、siRNAやshRNAなどのRNA干渉技術、CRISPR Cas9用いたゲノム編集技術が開発された後は使用頻度が落ちてきている。
  
  

  ハイブリダイゼーション hybridization　←→In situハイブリダイゼーション 2種類の1本鎖DNA（あるいはRNA）を付着して二本鎖にすること 　 ハイブリダイゼーションを利用して、目的の配列や物質自体を検出できる。

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解析方法　　　　　　　　　　　参考1/2

ELISA法 Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay 参考1 試料溶液中に含まれる目的の抗原あるいは抗体を、特異抗体あるいは抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法 酵素活性の検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、吸光度測定で数値化する。 抗原抗体反応の組合せによって直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などと呼ばれる方法がある。

セルベースアッセイ バイオアッセイの中でも特に細胞を用いた生物活性の測定法 薬効の対象となる細胞株と、所定の濃度に段階希釈した医薬品を共存させて一定時間経過後に細胞への影響を評価するというものである。 従来、特に抗体医薬品においては対象となる抗原との結合活性評価としてELISA法による測定が一般的に行われてきた。しかしながら、ICH Q6Bに規定されているように、ELISA法は免疫化学的性質を確認する測定法であり、あくまでも結合特性の評価を主眼としている。 セルベースアッセイはICH Q6Bにおいては生物活性を確認する測定法と規定されており、医薬品の薬効、すなわち機能的特性の評価を行うことになる。結合能と薬効は概ね正の相関があるとされるが、より正確を期するため、最近では薬効を直接測定することのできるセルベースアッセイによる測定が行われるようになりつつある。

ブロッティング　＝　転写 （DNA配列情報をもとにRNAが合成される反応である「転写」はtranscription） ウェスタンブロッティング Western blotting： WB、ウェスタンブロット法 Western blot analysis 　＝免疫ブロット法、イムノブロット法、immunoblotting 電気泳動によって分離したタンパク質を膜に転写し、任意のタンパク質に対する抗体でそのタンパク質の存在を検出する手法 変性したタンパク質はSDS-PAGEにより分離され、メンブレンに転写され、そこで抗体により検出される。 相対的な強度やブロットされたタンパク質の位置から、目的タンパク質の同定や定量性を調べることができる。 RIPA buffer、RIPA (Radioimmunoprecipitation) Lysis Buffer 細胞や組織の溶解に使用される溶解バッファー 界面活性剤を含んだタンパク質抽出用の緩衝液で、タンパク質の可溶化・抽出に使用されます。抽出されたタンパク質は、ウェスタンブロッティングや免疫沈降などのアプリケーションに使用でされる。 NP-40 や Triton X-100 よりも強い変性能力を有しているため、特に核抽出物調製における核膜の破壊に有用 バッファーの組成は50 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA RIPA Bufferには0.1% SDSが含まれ、細胞からの水溶性タンパク質の抽出のほか一部の膜タンパク質などの疎水的なタンパク質も可溶化できる。 SDSは免疫沈降における抗原抗体反応に影響を与えることがあり、免疫沈降ではRIPA BufferからSDSを抜いた組成で使用する。 サザンブロッティング Southern blotting 特定のDNA配列を膜上で検出する手法 制限酵素で切断したDNA断片を電気泳動で分離した後に、膜にブロッティングし、標識したDNA（プローブ）と結合させ、目的のDNA断片を検出する。 目的の塩基配列を増幅させたり、制限酵素によって切断しプラスミドに導入して発現させたりなど、様々な方法でDNAを扱う。 何らかの制限酵素で処理したDNA断片をアガロースゲル（あるいはアクリルアミド）で電気泳動した後に、ニトロセルロースやナイロンの膜（メンブレン）へ、拡散もしくは吸引によってブロットする。 転写後の膜に、検出したいDNA配列と相補的な塩基配列をもつプローブ配列を結合（ハイブリダイズ）させ、目的のDNA配列のみを検出します。使用するプローブは通常、放射性同位体標識もしくは発色酵素標識されており、それぞれの標識に応じた検出方法がある。 開発者のEdwin M. Southern（1938〜、英国の分子生物学者）にちなんで名づけられた。 サザン（南）ブロッティングから派生して、ノーザン（北）ブロッティングやウェスタン（西）ブロッティングが名づけられた。 ノーザンブロッティング Northern blotting 特定のRNA配列を膜上で検出する手法 抽出したRNAを電気泳動によって展開し、メンブレンに転写したのち、標識した核酸プローブを用いて検出を行う。一般に転写産物の量やサイズを調べるために行う。 細胞からフェノール試薬などを用いて核酸を抽出した後、RNaseフリーのDNaseによってDNAのみを消化し、アガロース電気泳動などによってゲル上に展開する。このゲルを拡散もしくは吸引によってメンブレンにブロットし、さらに検出したいRNA配列に相補的な核酸を標識した核酸プローブをハイブリダイゼーションさせることで標的RNAの量、サイズを検出する。 標識にはRIを用いた方法があるが、最近はポリクローナル抗体を用いたnonRI法が一般的 In situハイブリダイゼーション法　in situ hybridization: ISH　←→FISH In situとは”原位置で”という意味で、in situハイブリダイゼーションとは原位置でのハイブリダイゼーション 組織や細胞において、特定のDNAやmRNAの分布や量を検出する方法。ウイルス感染、腫瘍など診断に用いられるほか、分子生物学でも細胞や組織中の遺伝子発現を研究する上で重要な方法。遺伝子発現を調べる場合に、免疫染色は主にタンパク質の検出を目的とするが、ISH では mRNA の検出を目的とする。 サザンブロッティングやノーザンブロッティングとは異なり、DNA や RNA を抽出せずに、in situ（それらが存在する本来の場所で、すなわち細胞中もしくは組織中で）ハイブリダイゼーションによって検出する。原理はサザンやノーザンと同様で、相補的塩基配列による一本鎖核酸分子間の特異的結合を利用している。検出に用いられる核酸分子をプローブと呼び、従来はDNAやRNAが用いられてきたが、最近ではペプチド核酸（PNA）やLNAといったDNA類似の構造をもつ化合物が用いられる場合がある。 合成核酸 artificial nucleic acid Locked Nucleic Acid (LNA)とPeptide Nucleic Acid (PNA)は、DNAと似た構造をもつ人工核酸 プローブの感度と特異度は目的のDNAやmRNAとプローブとの結合力の影響を受ける。通常、ハイブリダイゼーションはプローブのTm値よりやや低めの温度で行うが、温度が低ければ感度は上がるものの特異度が低くなり、逆に温度を高くしTm値に近づけると特異度があがる一方で感度が下がる。そこで、Tm値の高いプローブを作る必要があるが、Tm値を上げる方法としてプローブの長さを長くするもしくは、プローブに用いる核酸分子を変える方法がとられる。DNAプローブよりもRNAプローブの方が同じ配列でTm値の高いプローブを設計出来る。 ISH法には、染色体ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。 染色体ISH法 染色体における目的遺伝子の遺伝子座を明らかにし、染色体異常を検出することができる。 組織ISH法 組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階であるmRNAの局在を細胞レベルで明らかにする。 病理組織からウイルスゲノムを検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。 ホールマウントISH（WISH） 胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法 ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。 RNAscope ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、凍結組織、培養細胞等のサンプル中の mRNA を、RNA ISH法により検出・視覚化する新しいテクノロジー 内在性コントロール、内部標準　endogenous control　←→ERCC 内在性コントロールは、正確な実験には不可欠であり、特にウェスタンブロット法で異なる実験条件下のタンパク質量を半定量（比較定量）するためには、このようなコントロールが必須 内在性コントロールは、ウェスタンブロットの結果が妥当であることを示すために必要であり、コントロール量が増加／減少した場合は、実験操作に問題があることを確認できる。 ウェスタンブロットにおけるローディングコントロールの候補となるのは、通常、高いレベルで恒常的に発現しているタンパク質であり、使用する組織や細胞の種類、また、それをどのように扱うかに関わらず、実験を通して発現量が一定であることが必要 内部標準タンパク質 タイプ 分子量 β-Actin 全細胞／細胞質 〜42kDa COX-4 ミトコンドリア 17kDa GAPDH 全細胞／細胞質 36kDa ラミンB1 核 66kDa PCNA（増殖細胞核抗原） 核 36kDa チューブリン 全細胞／細胞質 50-55kDa TBP（TATA 結合タンパク質） 核 38kDa VDCA1/Porin（電位依存性アニオンチャネルタンパク質1） ミトコンドリア 31kDa グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ：GAPDH 解糖系にかかわる酵素（タンパク質）であり、遺伝子ではない。 高度に保存されたハウスキーピングな酵素 多くの組織で高い発現がみられるため、ウェスタンブロッティング法の内在性コントロールとして広く用いられる。 mRNAの発現量などの内在性コントロールとして利用される。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 　 sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis： SDS-PAGE タンパク質の分子量の差を利用して分離するタンパク質分析法 ゲル中のタンパク質を電気泳動させると、小さなタンパク質ほどゲルの網目にひっかからずに早く移動するので、分子量の順にタンパク質を分離することができます。ゲルの編み目を通り抜ける速さは、個々のタンパク質の分子量だけでなく、高次構造や電荷などの影響を受ける。 タンパク質の高次構造や電荷などの影響をできるだけ排除し、ペプチド鎖長のみが反映された泳動結果を得るために、SDSとポリアクリルアミドゲルを利用した電気泳動系がSDS-PAGE SDS：sodium dodecylsulfate：ドデシル硫酸ナトリウム　←→アルカリ-SDS法（ミニプレップ） 　＝ラウリル硫酸ナトリウム　sodium lauryl sulfate：SLS　 陰イオン性界面活性剤 SDSはタンパク質の主ペプチド鎖部分に一定の割合で結合する性質があり、タンパク質変性作用が強い界面活性剤 そのため、タンパク質はSDSの存在（かつタンパク質の立体構造形成上重要なジスルフィド結合を切断するような還元条件）下では、ペプチド鎖長に応じた負電荷を持ち、一様に直鎖状に近い構造を取ることになる。 RIPA buffer ポリアクリルアミド 重合したアクリルアミド（ポリアクリルアミド）は一般的な分子量のタンパク質を分離するのに適切な大きさの網目構造を持ち、硬度も取扱いしやすい。 SDSを作用させたタンパク質試料をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動することで、容易・安価・比較的正確にペプチド鎖長に応じてタンパク質を分離することができる。

アガロースゲル電気泳動 agarose-gel electrophoresis　→アガロース/定量PCR アガロース（寒天の主成分）ゲルを使用した電気泳動により、核酸をその大きさに応じて分離する手法 DNA、RNAなどの核酸分子はそれぞれ固有の大きさ（長さ）と荷電を持っている。核酸の場合は荷電の個数は分子の大きさに比例するため、泳動距離は分子量の大きいものほど流れにくく、小さいものほど流れやすいという性質を利用 site分離する手法 固まったゲル片をTAE バッファー（40 mM Tris-acetate （トリスバッファーの pH を酢酸で約 8 に調整したもの）と 1 mM EDTA を含むバッファー）の入った水槽に入れ、核酸溶液を注入した後、一方から電圧をかける。一定時間後、ゲル片を取り出し、臭化エチジウムなどの核酸染色溶液に浸漬する。 染色された核酸は紫外線を照射すると蛍光を発するので、その存在が確認できる。また染色に使われた臭化エチジウムの量はDNAの分子の長さと量に比例するため、蛍光の強さによってDNA量を確認することができる。 TAEバッファーは低電界強度（1-2 V/cm）なので、大きなDNA（12-15 kbp）を分離するのに使用するのがよいです。TAEバッファーに溶かされたアガロースゲルは、低い電気浸透、より大きな見かけの孔サイズ、及び低い電界強度を持つため、大きなDNAがスメアになりにくくなる。 電気泳動の電圧：推奨される電圧は、4~10 V/cm（ゲルの長さではなく+極から-極の長さ）です。電圧が低すぎると移動度が低下し、DNAの拡散によってバンドが広がってしまいます。電圧が高すぎると、ゲルの過熱によりバンドの解像度が低下する恐れがある。 はっきりと明確なバンドにするために必要なDNAの最大量は約100ng 500 bp から 4 kb 程度のサイズの核酸を分離できる。 アガロース濃度(w/v) 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 分離可能なDNA(bp) 800 ~10000 500 ~ 70000 400 ~ 60000 200 ~40000 100 ~20000 臭化エチジウム ethidium bromide：EtBr 化学式：C21H20BrN3 水にはわずかに溶ける（溶解度 5g/100g） DNAの二本鎖間に挿入されるインターカレーターで、核酸染色剤（DNA染色蛍光色素）として分子生物学の分野で頻繁に使われる。 インターカレーター：PCR反応によって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発する薬剤 紫外線を当てると赤橙色の蛍光を発するが、その強度はDNAに結合することで約20倍になる。 臭化エチジウムは発がん物質なのでゲルを素手で扱わないように！





タンパク定量　←→Q-PCR/タンパク 紫外吸収法 BCA法　参考1 ビシンコニン酸： Bicinchoninic Acid：BCA 1985年にPierce Chemical社のPaul K. Smithらによって紹介されたタンパク定量法 Bradford （Coomassie）ベースの方法では困難であった界面活性剤を含む溶液の測定についても可能 アルカリ条件下でタンパク質によって2価の銅イオン（Cu2+）が1価の銅イオン（Cu+）に還元される原理（ビューレット反応）と、1価の銅イオンが2分子のビシンコニン酸と配位結合して紫色に呈色する原理を組み合わせた二段階の反応 第一段階 ビューレット反応：有機化合物のビューレット（NH2-CO-NH-CO-NH2）が銅イオンとキレート錯体を形成すること 最初のステップのタンパク質と2価の銅イオン（Cu2+）がキレート錯体を形成する反応はビューレット反応であり、ビューレット反応では酒石酸カリウムナトリウムを含むアルカリ条件下で3アミノ酸以上のペプチドが銅イオンとキレート錯体を形成する。 ビューレット化合物は尿素とともに加熱すると銅と反応して青色の四座配位複合体を形成する。アミノ酸の数が1つや2つの場合にはビューレット反応は起こらないが、3アミノ酸以上のペプチドやタンパク質ではビューレット反応が起こり、540 nm付近に吸収のある薄い青色から紫色の複合体を形成する。銅イオン（Cu2+） 1分子あたり4つから6つのペプチド結合と複合体を形成する。 第二段階 ビューレット反応で生じたCu+は2分子のBCA試薬と紫色の錯体を形成する。ビューレット反応で形成されるタンパク質と銅イオンの複合体はタンパク質のペプチド結合の数に比例する。 銅イオンの還元反応は主にペプチド結合との反応で行われる（ただしシステインまたはシスチン残基、チロシン残基、トリプトファン残基が存在すると還元反応が起こりやすくなる）。 タンパク質の単位質量あたりに存在するペプチド結合の数はほぼ一定であるため、BCA/Cu+複合体の発色はタンパク質濃度に比例する。 BCA法では直線性の高い検量線（r2>0.95）が得られる。 BCA/Cu+複合体は水溶性で562 nmに吸収をもち、この発色強度を測定することによってタンパク質濃度を見積もることができる。 BCAによるタンパク質定量は、タンパク質の種類の違いによる変化が比較的少なく、0.02〜2 mg/mlの広い範囲で直線性を示し、界面活性剤による影響を受けにくいという特長を持っている。 還元剤やキレート剤は反応を阻害するので、これらが含まれる溶液の定量には適さない。 Bradford (Coomassie)法 Lowry法　Lowry method, Lowry protein assay ビウレット反応（2価銅イオンとペプチド結合の反応）とアミノ酸側鎖の酸化反応とを組み合わせたものである。 タンパク質濃度が0.01から1.0mg/mlの範囲に適している。 ビウレット法単独より感度が100倍ほど高い。





ポリメラーゼ連鎖反応　Polymerase Chain Reaction：PCR DNAを増幅するための原理またはそれを用いた手法 PCR法では鋳型となる DNA にプライマー付着させ、DNAポリメラーゼによって目的のプライマー配列にはさまれるDNAを特異的に検出する。 特定のDNA領域を挟む2種類のプライマー（相補的な短いDNA断片）と耐熱性DNAポリメラーゼと用いて、微量のDNAから特定のDNA領域を増幅する反応 鋳型2本鎖DNAを93〜95°Cの熱変性で一本鎖とし、その後プライマーのTm値付近（約55〜65°C）まで冷却することにより、フォワードプライマーは鋳型アンチセンス鎖に、リバースプライマーは鋳型センス鎖にアニーリングする。その後、DNAポリメラーゼの最適温度域の72°Cまで温度を上げ、鋳型1本鎖DNAをプライマーを起点に伸長複製する。 PCR法では、増幅対象（テンプレート ：鋳型）のDNA、DNAポリメラーゼ、および大量のプライマー（オリゴヌクレオチド）を予め混合し、変性・アニーリングを行う。アニーリングの結果、長い対象1本鎖DNAの一部にプライマーが結合した形ができる。 プライマーがDNAよりも圧倒的に多い状況にしておくことで、DNA-プライマーの結合がDNA-DNAの結合より、さらに優先的になる。 PCRで、熱変性前のDNAは鋳型DNAセンス鎖（5’–––––––3’）とアンチセンス鎖（3'–––––––5’）が相補的に2本鎖を形成しているが、熱変性を受けると1本鎖となる。 PCRサイクル　denaturation：94°C（30〜60sec）→annealing：55°C（30sec）→elongation：72°Cという温度サイクルを繰り返し、希望するDNA断片を増幅 サーマルサイクラーを使って、3温度域（変性、アニーリング、伸長反応）を素早く加熱・冷却し、既定温度を保持し、さらに規定数までの反復を繰り返す。 ①DNA鎖の熱変性 denaturation：高温でDNAを変性させて、2本鎖DNAを1本鎖にする。 DNAを入れた反応液を94°C程度に加熱し、30秒から1分間温度を保つと、DNAは1本鎖2本に分かれる。 2本鎖DNAは高温では変性し、1本鎖DNAに分かれる。 変性が起こる温度は、DNAの塩基構成および長さ（塩基数）によって異なり、長いDNAほど高い温度が必要になる。 基本30秒、通常30〜60秒であるが、ゲノムDNAのような長いDNAを鋳型としてPCRを行う場合は、鋳型DNAの変性を完全にするために、最初に5分程度の熱変性を行ってから通常のサイクルに入るように設定することもある。 ②プライマーのアニーリング annealing 約55〜60°Cに急速冷却して、1本鎖とプライマーをアニーリングさせる。 アニーリング annealing プライマーをDNAに結合させること DNA分子は塩基間の水素結合で結ばれた二重らせん構造を有するが、これを溶液中で加熱していくと、ある温度で塩基間の水素結合が切れて1本ずつのポリヌクレオチド鎖に分かれる。 この溶液を、ゆっくり温度を下げて融解温度により少し低めに長く保つと、一本鎖のDNAは再結合して生物活性をもつ二重らせん構造を形成する。これをDNAのアニーリングという。 1本鎖DNAとなった溶液を冷却していくと、相補的なDNAが互いに結合し再び2本鎖となるが、急速に冷却すると、長いDNA同士は再結合しにくいが、短いDNA断片（オリゴヌクレオチド）は結合できる。 熱処理して1本鎖になった鋳型DNAとプライマーが2本鎖を形成してプライミング反応が起こるためには、アニーリングの温度をプライマーのTm以下に設定する必要がある。しかし、アニーリング温度を下げすぎるとプライマーの非特異的なアニーリングが起こりやすくなり、非特異的増幅により標的配列の増幅が阻害されてしまうので、アニーリング温度はできるだけ高いほうがよい。 Tm値は解離する温度なので、解離するぎりぎりの温度にするため、アニーリング温度はをTm値よりちょっと低めにする。すると、目的の配列へのプライマーのアニーリングはぎりぎり起こるが、他の非特異的な部分へのアニーリングは起こらないという条件になり、PCRがかかる。 アニーリング温度を上げると、プライマーと鋳型DNAのミスマッチが減少し反応の特異性が高くなる。目的とする標的配列以外の非特異的増幅も怒っている場合は、2°C間隔で温度を上げる。逆に何も増幅されない場合は、2°C間隔で温度を下げてみる。 melting temperature：Tm値 DNAは水溶液中では温度を上げると2本鎖から1本鎖へと分かれるが、溶液中の全てのDNAのうち、半分が解離する温度をTm値という。 2本鎖DNAの50％が1本鎖DNAに分かれるときの温度で、塩基配列の構成と塩基数および反応液の塩濃度などにより決まる。 プライマーの設計にはTm値の計算が上可欠である。 プライマーのTm値の計算には、「Nearest Neighbor法」を用いるのが良い。 Tm値をもとにしてアニーリングする時の温度を決める。 通常は、プライマーに用いるオリゴヌクレオチドのTmを推定し、このTmをアニーリング温度としてPCRを行う。温度は55°C、時間は30秒間が標準である。 塩基の結合力が強い場合、より高い温度にしなければ塩基は解離しないためTm値は高くなり、塩基の結合力が弱い場合、低い温度で塩基は解離するためTm値は低くなる。 DNAの結合力はその配列中にG（グアニン）とC（シトシン）がどれくらいの割合で含まれているかによって変化する。A（アデニン）とT（チミン）の結合力に比べ、G（グアニン）とC（シトシン）の結合力のほうが強いため、GC含量が多いDNA配列のほうがTm値は高くなる。 ③DNAの伸長:elongation ポリメラーゼによる相補鎖の合成：DNAポリメラーゼを反応させ、DNAを伸長させる。 プライマーの分離がおきず、耐熱性DNAポリメラーゼの活性に至適な温度帯：（60〜72°C°C、40秒/kb）まで再加熱し、1分から2分保持する。 DNAが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常1分から2分、この温度を保つ。 アニーリングされた状態でDNAポリメラーゼが働くと、プライマーが結合した部分を起点として1本鎖部分と相補的なDNAが合成される。 DNAが合成された後、再び高温にしてDNA変性から繰り返す。PCRの工程を続ければ続けるほど目的のPCR産物を得ることができる。 PCR法では1サイクル目で2分子、2サイクル目で4分子、3サイクル目で8分子のDNA断片ができる。 3サイクル目で初めて目的の長さのPCR産物を生成することができる。 PCR法は、DNA鎖長の違いによる変性とアニーリングの違いを利用して、温度の上下を繰り返すだけでDNA合成を繰り返し、DNAを増幅する技術である。 サイクル数は25〜40サイクルに設定する。酵素反応であるからサイクル数が多過ぎるとDNAポリメラーゼ活性の低下、基質成分の減少、反応副産物の蓄積による伸長反応阻害および増幅DNA同士の再会合によるプライミング効率低下などを原因とした反応低下が生じるため、必要以上にサイクル数を増やすことは避ける。

定量PCR　Quantitative polymerase chain reaction：Q-PCR　参考1 遺伝子産物を迅速に定量できるポリメラーゼ連鎖反応 の改良型 DNA、cDNA または RNA の増幅が行われる前の総量を間接的に測る方法 通常は目的の遺伝子配列が存在するかどうか、何コピー存在するのかを確かめる目的で利用される。 3種類の方法がある。 →アガロースゲル電気泳動 最も単純な方法であるが、結果が出るのは遅く、感度も低い上、アガロースゲルの状態に左右されるので、リアルタイムPCR法には用いられない。 　[方法] 未知の試料と既知の試料を濃度の判明している近いサイズの DNA断片と共に用意する。 それぞれの試料の反応を同じ条件で同じ時間だけ（できれば同じプライマーを用い、または少なくとも同じ位のアニーリング温度で）行う。 アガロースゲル電気泳動で PCR産物を分離する。 既知と未知試料の相対的な量を測る事で未知試料を定量する。 アガロースゲル電気泳動は一般的にプローブの標的配列が存在するか否かを単純にみるために使われ、「真の」定量PCR と言える場合は稀である。これは他のリアルタイムな方法に取って代わられてしまった方法であり、せいぜい半定量法である。 SYBRグリーンアッセイ SYBR Green PCR 定量PCR、リアルタイムPCR法には用いられる。 二本鎖DNAに結合することで蛍光を発するインターカレーター（SYBR Green）を反応系に加え、増幅に伴う蛍光を検出する方法 SYBRグリーンの利用はアガロースゲル電気泳動ゲル法よりも正確で、リアルタイムに結果が出る。 サイバーグリーン　SYBR Green：SG 二本鎖DNAのマイナーグルーブに結合する蛍光DNA結合色素 核酸の染色に用いられる非対称のシアニン系色素である。化学式：C32H37N4S+ 二重らせんを組んでいるDNAと特異的に結合する。DNAと結合することで青色光 (λ = 488 nm) を吸収し、緑色光 (λ = 522 nm) の蛍光を発するようになる。このため核酸染色色素として用いられ、強い発がん性物質として知られる臭化エチジウムの代替物質とすることができる。 DNAに結合したSYBR Green 色素が励起すると、非結合性の色素よりもはるかに強い蛍光シグナルを発生する。 DNA結合色素は新たに合成された二重鎖DNA へ結合し、緑の蛍光を増加させる。これを測ることで最初の濃度を計測する。 増幅がターゲット、非ターゲットまたはそれらの混合物からなる場合のいずれにおいても、プロットは同じパターンを示すので、SYBRグリーンアッセイにより増幅産物が生成しても、そのシグナルのほとんどがターゲット由来であるかどうかは不明である。 SYBR Green色素を使用するアッセイは通常2種類のPCRプライマーを用いる。 理想的な条件下では、SYBR Green色素アッセイは、TaqManプローブと同様の増幅パターンを示す。 　[方法] 二重鎖DNA結合蛍光色素を加えてPCRを行う。 PCRの初期のサイクルにおいては水平なベースラインが観察される。試料中にターゲットが存在すると、ある時点で十分な量のPCR産物が蓄積され、増幅シグナルが出現する。 PCRを行うと同時に蛍光の強さを計測する。色素は二重鎖DNA と結合した際にのみ蛍光を発する。標準の試料と比較することで二重鎖DNA の濃度が定量される。 蛍光プローブ法　fluorescence probe TaqMan®プローブ 定量PCR、リアルタイムPCR法に用いられる。 定量PCRの中で最も正確で信頼できる方法である。 蛍光プローブ法では、増幅領域両端の2種類のプライマーに加えて、増幅領域内に相補的に結合する蛍光プローブを用いる。増幅されるDNAに特異的なプローブを用いるので、目的の配列のみを定量できる。 SYBRグリーン法のようにすべての二重鎖DNA に反応することはない。 通常はプローブはRNAを基にし、蛍光レポーターとその隣りにクエンチャーを入れる。クエンチャーの近くのレポーターは蛍光が抑制される。従って蛍光がみられるのはプローブが分解した時のみである。この過程は使用する DNAポリメラーゼの 5' → 3' エキソヌクレアーゼ活性による。：5′ヌクレアーゼアッセイ 蛍光プローブ　fluorescence probe 標的とする生体分子との化学反応によって、励起波長・蛍光波長・蛍光強度などの蛍光特性が変化する機能性分子 観測標的分子と結合・反応して蛍光特性（波長・蛍光強度）が変化する機能性分子のことで、大きく分けて蛍光タンパク質ベースのもの、小分子ベースのものが開発され、生物学的研究ツールとして幅広く利用されている。 蛍光プローブを用いることで、標的分子の生成する場所やタイミングを生きた細胞でリアルタイムに検出することができる。 単に分子を蛍光ラベル化する蛍光標識試薬とは異なる。 TaqMan probe法　←→耐熱性DNAポリメラーゼ 5'末端を蛍光物質、3'末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴDNA（TaqMan®プローブ）をPCR反応系に加える方法 アニーリング時、TaqMan®プローブはテンプレートDNAへ特異的にハイブリダイズする。その際プローブにはクエンチャーが存在するため、蛍光発生しない。 伸長反応時、Taq DNA ポリメラーゼのもつ5'→ 3'エキソヌクレアーゼ活性により、テンプレートDNAにハイブリダイズしたTaqMan® プローブが分解される。 それに伴い蛍光色素がプローブから遊離、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光を発します。 増幅用のプライマー、およびTaqMan®プローブによって検出する遺伝子の特異性を高める。 クエンチャー　quencher 励起エネルギー吸収剤 微量な分子によってある現象が抑制されるとき、その現象をクエンチングといい、その分子をクエンチャーという。 PCRで使われるのは蛍光のクエンチャーであるが、活性酸素のクエンチャーなどもある。 　[方法] プローブを加えて PCR を行う。 反応を開始して DNA が一本鎖化するとプローブがその相補配列（すなわちその鋳型DNA）へ結合する。 ポリメラーゼが働く温度になると、それはプライマーの結合した一本鎖DNAに相補鎖を作る。DNA の合成がプローブの位置に達すると、プローブはエキソヌクレアーゼ活性によって「上書き」される。結果、元あったプローブはバラバラになり個々のヌクレオチドとなる。すると蛍光レポーターはクエンチャーと分離するので、蛍光を発する。 PCR が進むごとに蛍光レポーターはクエンチャーから分離するので、蛍光ははっきりと幾何級数的に増加していく。これによりDNAの最初の量を正確に計測することが可能である。 5′ヌクレアーゼアッセイ　5 'nuclease assay　参考1 リアルタイムPCRに広く使用されるアッセイ SYBRグリーンアッセイやTaqMan Assayが代表的 5′ヌクレアーゼアッセイは、Taq DNAポリメラーゼの持つ5′ヌクレアーゼ活性から命名された。 5′ヌクレアーゼドメインはDNA合成の下流に存在する、テンプレートに結合したDNAを分解することが可能で5′ヌクレアーゼアッセイの第二の重要な要素は、FRETにおいて蛍光色素の発光は、近傍に存在するもう一つの色素、クエンチャーによって、大きく低減される。 DNA分子量マーカー、DNAサイズマーカー　DNA molecular marker　→DNAの簡易定量 分光光度計が無くてもLambda-HindIII digest などと電気泳動セットとUVイルミネータがあれば、簡易的にDNAの定量ができる。 λDNA digestはバクテリオファージλcI857 Sam 7のDNAを制限酵素EcoT14 I、Bst P I、Hind IIIでそれぞれ分解したものである。

リアルタイムPCR法 Real-time PCR 定量PCRのひとつ PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし、解析する技術 DNAやRNAの正確な定量ができる。 電気泳動が不要なので迅速かつ簡便に解析でき、コンタミネーションの危険性も小さいことなどの利点がある。 リアルタイムPCRにはサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムPCR専用の装置が必要 SYBRグリーン法（二重鎖DNA染色）や蛍光プローブ法が利用される。 プライマーとプローブは、配列依存的にDNA配列に相補結合する。 この状態ではプローブは分解されていないため、蛍光色素とクエンチャーは接近して存在している。 蛍光色素から発せられる蛍光は、、クエンチャーに吸収されている。 ポリメラーゼがプライマーから伸長し、DNA合成が開始される。 ポリメラーゼがプローブのところに来ると、エキソヌクレアーゼ活性により、相補結合しているプローブを分解する。 プローブが分解されると、蛍光色素はクエンチャーから離れる。 クエンチャーとの距離が大きくなるため、クエンチャーによる吸光が制限され、蛍光がリアルタイムPCR装置によって検出されるようになる。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応　Reverse transcription-polymerase chainreaction：RT-PCR Reverse Transcription：RT 逆転写とは、RNAを鋳型としてDNAを合成することで、逆転写により合成されたDNAをcDNA （cは「相補的」を意味する「complementary」の頭文字） cDNAを用いてPCRを行う方法 PCR法はDNAの検出に用いることは可能であるが、RNAの検出をすることができない。そこで、RNAを逆転写によってcDNAに変換し、そのcDNA に対してPCR法を行う。 PCRの反応の前に、mRNAを型にして、逆転写酵素により一本鎖DNAを合成しておき、PCRにより増幅する。 レトロウイルスなどの一部のウイルスは、RNA しかもっていない。このようなウイルスの感染を証明する場合、RT-PCR法を用いることになる。細胞内に存在する mRNA は DNA と比較すると非常に上安定な物質であり、−80℃で凍結保存しても半減期が約半年と言われている。そのため、半永久的に mRNA 配列を保存する目的で RT-PCR を用いる場合もある。 Quantitative Reverse Transcription PCR：qRT-PCR 定量的RT-PCR

フローサイトメトリー flow cytometry →細胞周期解析 流動細胞計測法 細胞を懸濁させた液体を細胞が一列になるように流れている状態にし、それにレーザー光を当てて反射する光を測定し、光の強さを電気信号に置き換えて定量化し、細胞一つ一つの情報を自動的にサンプリングする方法 レーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、水流の中を通過する単一細胞の大きさ、DNA量など、細胞の生物学的特徴を解析することができる。 微細な粒子を流体中に分散させ、その流体を細く流して、個々の粒子を光学的に分析する手法 細胞1個1個の相対的大きさや形状、内部構造の違い、細胞の同定や細胞群を構成する種々の細胞の存在比を短時間で解析することができる。 蛍光抗体で染色した細胞を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面にある抗原量を定量的に測定する。 微粒子を選択的に回収することもできる。 フローサイトメトリー用蛍光試薬　* フローサイトメーター flow cytometers：フローサイトメトリーに用いられる装置 fluorescence activated cell sorting：FACS （ベクトン･ディッキンソン社のフローサイトメトリー装置の登録商標） FACSは、蛍光抗体で染色した細胞を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面にある抗原量を定量的に測定することのできる機器 FACSは大別して、各パラメータの解析のみ可能な機器（アナライザー）と、分取機能を兼ね備えた機器（セルソーター）に分けられる。 データ処理 ヒストグラム ゲーティング アナリシス ソーティン　sorting FACSは細胞を解析するだけでなく、その結果にもとづいて特定の細胞だけを無菌的に分取（ソーティング）することができる。 ソーティングの機構には液滴荷電方式およびセルキャプチャー方式がある。 フローサイトメーターには、細胞を分取する機能（ソーティング系）を有したセルソーター（Cell　Sorter）があります。セルソーターは、MoFloが採用するジェットインエア方式と、FACSAriaが採用するキュベットフローセル方式に分けられる。

免疫沈降法 Immunoprecipitation：IP 微量なタンパク質の検出やタンパク質の相互作用、翻訳後修飾されたタンパク質の翻訳後修飾：PTMsを検出する方法 セルライセート（細胞を溶かしたもの　cell lysate）のような上均一なタンパク質サンプルから、特定のタンパク質やタンパク質修飾またはタンパク質のモチーフを濃縮する方法 抗原と抗体の親和性を利用して、溶液中から抗原を特異的に分離させる方法 免疫沈降で分離した抗原はSDS-PAGEやウェスタンブロッティングなどの方法で解析する。 バッチ法による免疫沈降　Batch processing、batch method　参考 バッチ法は、抗体を吸着するためのProtein A担体やProtein G担体のスラリーをマイクロチューブに加えて処理を行う。抗原抗体反応を終えたサンプル溶液を担体スラリーと混合して吸着させて目的タンパク質の複合体を回収する。担体さえ準備できれば、手軽に免疫沈降を始めることができる。 プレパックカラムタイプと異なる点として、サンプル溶液量や目的タンパク質の回収量に応じて担体量を調整できるため条件検討にも適している。 スラリー　slurry スラリーとは、液体の中に固体を混ぜ合わせたもの 大量の液体の中に、徐々に少量ずつ固体を入れかき混ぜると、どろっとした液体のような固体のような状態となる。この液体と固体との懸濁液がスラリー液 タンク等の底に沈んで堆積する濃厚なスラリーをスラッジあるいは汚泥と呼んで区別することもある。 磁気ビーズによる免疫沈降　←→レトロビーズ バッチ法の一種；抗体に対するアフィニティーリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。 Protein AやProtein Gを磁気ビーズに固定化することで、溶液の除去操作の効率が非常に高まる。遠心操作も必要なく、紹介する手法の中では最も操作が簡単でデッドボリュームを抑えられる方法である。 アフィニティーリガンド affinity ligand 親和性をもつ分子 アフィニティーリガンドとは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から標的（目的）の分子を選択的に捕集（結合）する物質 特定の生体分子に対して親和性をもつ分子、すなわち特定の生体分子に特異的かつ可逆的に結合する分子のこと。このような分子を利用することにより、特定の生体分子の精製や検出を容易に行うことができる。 単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同義である。 アフィニティ精製 affinity purification アフィニティ精製とは、ターゲット分子と特異的かつ可逆的に結合する分子（リガンド）の反応を利用して、ターゲット･タンパク質あるいはその複合体を分離・精製する手法 免疫沈降、クロマチン免疫沈降、プルダウン・アッセイプなどの実験で用いられている精製法が、アフィニティ精製 アフィニティークロマトグラフィー affinity chromatography クロマトグラフィーの一種で、主として生体高分子（たんぱく質や核酸）同士または低分子物質とのアフィニティー（親和性）によって物質を分離する方法 磁気ビーズ Magnetic beads、Mag Sepharose　←→磁気ビーズによる疫沈降/レトロビーズ 磁石の性質をもったセファロース担体（ビーズ） Protein G セファロースのようなゲル担体を用いたバッチ精製では、洗浄時に溶液が残ったり、逆にゲル担体を吸い上げてしまったりするリスクがあるが、磁気ビーズは、磁力を利用してビーズを壁面に集積させることができるため、サンプルロスを抑えて溶液交換ができる。また、遠心操作の必要がないことも操作を手軽に行えことなどが利点である。 プロトコールは、セファロース担体でのバッチ法とほとんど同じ アガロース担体　agarose carrier　＝セファロース担体　sepharose↓ system carrier　←→アガロースゲル電気泳動 寒天生産性を有する海藻から抽出された画分 Hysteresis（融解温度とゲル化温度の差）が大きく、分子生物学および生化学の分野で、電気泳動やクロマトグラフィーのような分離作業に最適 とりわけアガロースはゲル化の温度範囲が32 - 45℃で、融解温度は通常80 - 95℃ですが、特定の用途に向けて製品を調整する場合にはこうした温度を変更することができる。 アガロースは、不活性マトリックスを形成する天然物で、電気泳動、クロマトグラフィーおよび他の分子生物学および生化学技術に使用される。加えて、アガロースは中性かつ容易に誘導体化されるため、酵素、抗原、抗体のようなタンパク質に容易に結合する。 1956年に荒木長次（京都工芸繊維大学元教授）が寒天はアガロースとアガロペクチンからなり、アガロースは電荷をもたないと報告した。 ウプサラ大学のStellan Hjertén（シュテラン・ヤティーン　1928〜　ウプサラの生化学者）がこの報告に目をつけ、寒天の中からアガロースだけを精製できれば電気泳動ゲルに適していると考えた。 1962年にヤティーンが新しい精製法で得たアガロースをゲル電気泳動に使い、1964年にはアガロースでビーズ状の担体をつくる方法が開発された。 アガロース担体は、ファルマシアによって製品化され、Sepharoseとして1967年に発売された。 アガロース担体はデキストランやポリアクリルアミドよりも剛性が高く、流速を上げることができた。 ポアサイズも大きいので、タンパク質だけでなく、ウイルスのような粒子の精製もできた。 アガロースは化学的に不活性であり、pH安定性にも優れている上に、 誘導体をつくったり架橋させたりするのが容易であることから、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの担体に最もよく使われるマトリックスとなった。 セファロース　Sepharose　←→アガロース GE Healthcar（元Pharmacia）の登録商標 海藻から抽出された多糖ポリマー材料の架橋されたビーズ形態の商品名である。 Separation- Pharmacia-Agaroseに由来している。 スピンカラム　SpinColumnsによる免疫沈降　Spin cup or spin tube processing カラム内にProtein AやProtein Gがあらかじめ分注されていて、遠心分離で処理する。 スピンカラムの構造上、一度に添加できる液量は最大で600 µl 標的タンパク質に対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を、細胞溶解物などのサンプル中の標的タンパク質と複合体を形成させる。 　　　　　↓ 複合体をビーズ上に捕捉または沈殿回収する。ビーズには抗体結合タンパク質（プロテインAまたはGなど）が固定化されていて、ビーズ上補足されないタンパク質は全て除去される。 　　　　　↓ 抗原を支持体から溶出する（抗体がビーズに共有結合されていない場合は、あるいは変性バッファーを使用した場合は抗体も一緒に溶出されることがある）。 　　　　　↓ さらにドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動：SDS-PAGEでこの抗原を解析する。 　　　　　↓ また通常ウエスタンブロット解析により抗原の検証を行う。 共免疫沈降法　Co-immunoprecipitation：Co-IP 免疫沈降法：IPを発展させた手法 関連タンパク質間の生理的な相互作用を同定するための一般的技法 免疫沈降法によって、目的のタンパク質と相互作用する（特異的に複合体を形成する）別のタンパク質との複合体を回収する方法 標的タンパク質に結合したタンパク質を間接的に取得するために、標的タンパク質特異的抗体を用いる。取得されたタンパク質複合体を解析して、標的タンパク質の新たな結合パートナー、結合親和性、結合様式および機能の同定が行える。 IPと同様にサンプル溶液中で生理的相互作用により標的へ結合する巨大分子を抗原と共に捕捉・精製するが、IPはターゲットが一次標的（抗原）であり、Co-IPはターゲットが一二次標的（相互作用タンパク質）である。 免疫沈降抗体と反応する抗原をbaitタンパク質として利用し、baitタンパク質と共沈降する、すなわちbaitタンパク質と相互作用するpreyタンパク質を精製・解析する方法 bait 釣りの餌 prey タンパク質と相互作用するタンパク質 prey おとり、餌食、獲物 baitタンパク質によって釣られる側のタンパク 検出するタンパク質 ツーハイブリッド　Two-hybrid法 タンパク質間相互作用やタンパク質-DNA間相互作用を調べる手法の一つ 出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae を用いた yeast two-hybrid (Y2H) system が最初に構築された。 生物種を酵母から大腸菌に変えたり、GAL4の代わりにLexAを用いる、Rasシグナル経路を用いる、など様々な改変型手法がある。 in vitroで純粋に2種のタンパク質のみ存在する条件化で相互作用を検討する場合に比べ、真核生物の細胞を用いることはより生体内に近い条件と考えられる。しかし擬陽性も多くみられ、免疫沈降法やプルダウンアッセイなど他の手法も用いて検討する必要がある。一方で、一度に多数の検定を行うことができるため、スクリーニングに用いられることが多い。 Two hybridスクリーニングでは、タンパク質Bのソースとして発現ライブラリーを用いる。つまり興味ある遺伝子産物をAとし、その相方を求めてライブラリーをスクリーニングし新規のタンパク質を探索することが広く行われた。さらに規模を拡大して、ある生物種におけるある一群のタンパク質あるいは全タンパク質をAとし、タンパク質間相互作用のネットワークを描き出すような試みも成されている。このような作業はポストゲノムシークエンスと呼ばれる20世紀末から21世紀前半にかけての時代に、プロテオーム解析などと呼ばれる。 ファージディスプレイ phage display　→悪性神経膠腫分子標的ペプチド タンパク質間相互作用あるいはタンパク質とその他標的物質との相互作用を検出する方法の一つである。バクテリオファージに遺伝子を組み込んでその表面に発現させ、標的との結合を指標として相互作用を検出する。トゥーハイブリッド法に似た点もあるが、よりスクリーニングに適している。 ファージの殻タンパク質をコードする遺伝子に、発現させたい（外来の）遺伝子を連結させると、ファージが宿主大腸菌内で構成される時に一緒に発現され、ファージの殻タンパク質との融合タンパク質として外部に出てくる（「提示される」と表現する）。この提示された融合タンパク質はファージの表面に存在するため、様々な分子と相互作用することができる。この基本原理を活用し、様々な融合タンパク質を提示したファージを調製し、その集合をライブラリー化したものをファージライブラリーという。この手法を開発したのはミズーリ大学のG.P.Smithらのグループで、1985年に基本原理を、1990年には標的分子に結合するペプチド（のちにタンパク質や抗体でも可能であることが報告される）をライブラリーから効率よく同定できることを示した。 ディスプレイされたタンパク質とそれをコードする遺伝子とがファージ粒子という形で一対一に対応し、目的の遺伝子が容易に得られ増やせるのが特長である。 親和性選択法（アフィニティーセレクション）：バイオパニング ファージライブラリーを用いて、標的物質に結合するペプチドおよびタンパク質を得るためには、親和性選択操作を行うことが必要である。 in vitroスクリーニング法 ターゲット分子に結合親和性のあるペプチドを提示するファージ粒子を簡単に選別することができる。 ファージ粒子表面に提示されているペプチドの遺伝子はファージ粒子内に存在するため、ペプチドをコードするDNAを簡単に同定することができる パニングでは、まずターゲット分子が固定されたプレートやビーズとファージペプチド・ライブラリーをインキュベートし、未結合のファージを洗浄した後に、特異的に結合したファージを溶出する。さらに溶出したファージを増幅し、結合・洗浄・増幅を繰り返すことによって、ターゲット分子に結合するリガンド分子を提示するファージを濃縮することができる。パニングを3〜4回繰り返した後に、DNAシーケンシングやELISA法によりリガンド分子の解析を行う。 Ph.D.C7C ヘプタペプチド プルダウン法 Pull-down assay タグ付きタンパク質を使った相互作用タンパク質解析で最も一般的な方法です。担体に固定化したタグ付きタンパク質（ベイト）に任意のサンプルをインキュベートした後に溶出させ、ベイトと相互作用する（結合する）タンパク質との複合体を単離する方法 インキュベートするサンプル溶液には、細胞抽出液や培養上清、またはベイトとの相互作用が予想される精製タンパク質などを用いる。 Co-IPを応用して、あらかじめ目的タンパク質にタグを付けておき、タグとの結合を利用してこのような複合体を回収する。 ただしタグ認識のために、抗体に限らずその他の特異的結合　例えばHisタグとニッケルキレート、GSTタグとグルタチオン、アビジンとビオチン等を用いる方法もある。 クロマチン免疫沈降 Chromatin immunoprecipitation：ChIP タンパク質に対する抗体を用いてDNAとタンパク質との相互作用（結合）を研究する方法の一つで、特定のタンパク質（転写因子など）が結合するDNA上の部位とその配列を明らかにする方法 現在ではさらにDNAチップによる標的DNA配列の同定を組み合わせた ChIP on chip や、DNAシーケンシングによるChIP-seqがよく用いられる。 従来行われている似た方法にはゲルシフトアッセイがあるが、これは無細胞系（in vitro）を用いて、特定のDNAに結合するタンパク質を探す方法であるのにに対し、ChIPは生きた細胞（in vivo）を用いて、タンパク質の側からDNA配列を探すのが特徴である。 ゲルシフトアッセイ　gel shift assay, gel mobility shift assay, band shift assay, or gel retardation assay ゲルシフトアッセイとは特定の塩基配列をもつ核酸断片とタンパク質の結合を調べる実験系。転写因子の結合配列の解析に広く用いられる。EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay) とも呼ばれる。 原理は核酸断片にタンパク質が結合すると核酸断片のみの場合よりも総体として分子量が大きくなるということで、この結果電気泳動で遅く流れること（移動度 mobility の違い）を利用して可視化する。 具体的な例としては、リンの放射性同位体でDNA断片を標識し、タンパク質と混合したのち、ポリアクリルアミドゲルで展開し、オートラジオグラフィーによって分析する。遊離しているDNA断片は早く流れるため下部にくるが、タンパク質が結合した断片はゆっくり流れるために上部にバンドとしてあらわれる。 ChIPシーケンス Chromatin Immunoprecipitation Sequencing：ChIP-Seq クロマチン免疫沈降アッセイとシーケンシングを組み合わせていて、転写因子および他のタンパク質のためのゲノム全体のDNA結合部位を同定する優れた方法 特異抗体を用いてDNA結合タンパクを免疫沈殿させた後、結合したDNAを共沈殿、洗浄し、シーケンスを行う。 マイクロアレイを利用した従来のChIP-on-chip法と比べ、１回のランで全ゲノムを対象とした膨大な量の解析が行えるため効率がよく、さらに感度，解像度ともに優れている。 ChIPの次世代シーケンスのアプリケーションは、発現やがん進行などの種々の疾患および生物学的経路で役割を果たす遺伝子制御イベントに関する洞察をもたらす。 ChIP-Seqにより、ゲノム全体規模でのタンパク質と核酸との間の相互作用について十分検査することができる。 in vitro転写・翻訳　in vitro translation、無細胞タンパク質発現システム タンパク質の機能を研究する上で、対象タンパク質の合成は必須の技術 無細胞タンパク質合成系 RRLウサギ網状赤血球　rabbit reticulocytes：RRL 1964年に最初に報告された歴史のある系 TnT® Quick Coupled Transcription/Translation System＠Promega* RRLは、ニュージーランド白ウサギの網状赤血球を溶解したあとに不必要な細胞成分を除去することで、最終抽出液が翻訳特性を持つようなっている。 RRLには、ヌクレアーゼ処理とヌクレアーゼ未処理の2種類がある。ヌクレアーゼで処理したRRLは、内在性mRNAをmicrococcal nucleaseで処理しているため、非特異的な翻訳反応（バックグランド）少なくなる。 大腸菌 コムギ胚芽

Fluorescent in situ hybridization： FISH method、FISH法　←→In situハイブリダイゼーション法 目的とするDNA／RNAプローブを蛍光色素により検出可能な標識を行い、観察試料上に分子雑種を形成させて可視化する技術 蛍光色素で標識した抗体やオリゴヌクレオチドなどをプローブに用い、組織切片や染色体の構造が保たれた状態のままでハイブリッド形成させてプローブ結合部位を蛍光で検出し、目的とするタンパクやmRNA、DNAの存在部位を特定する実験法 観察試料として，組織から細胞核，染色体，クロマチン線維に至るまで，様々なスケールの標本が対象とされる。 一般にFISH法では，スライドグラス上に二次元展開した染色体標本を対象とする。 Immuno-FISH解析 免疫染色とFISHの同時検出 タンパク質とDNA断片の相互作用を、組織切片において同時に可視化できる手法 3D-FISH法　three-dimensinal fluorescence in situ hybridization マルチカラーFISH 法 核型解析の一つの方法 すべての染色体を別々の色に染色することで、転座や異数性の解析が容易にできる。 cellular compartment analysis of temporal activity by fluorescent in situ hybridization法：catFISH法 蛍光を利用し、mRNAの局在を調べるFISH法を利用して、神経細胞の活性化したタイミングを同定する技術 神経活動で発現誘導するArc mRNAは、神経活動5〜10分後までは細胞の核内に留まるが、約30分後には細胞質に局在する。これを利用し、30分間隔で2回のイベントを行った直後の脳サンプルで調べた場合、細胞質arcシグナルを持つ細胞は最初のイベント時に、核内arcシグナルを持つ細胞は、2回目のイベント時に、両方のシグナルを持つ細胞は2回のイベント両方で活性化したと確認できる。　参考1

DNAメチル化解析 DNA Methylation Analysis, DNA methylation detection　←→DNAメチル化　参考1/2/3/4 実験目的による分類 特定ゲノム領域のDNAメチル化解析 バイサルファイトシーケンス、COBRA（Combined Bisulfite Restriction Analysis）、qAMP（quantitative analysis of DNA methylation using real-time PCR）など ゲノムワイドな網羅的DNAメチル化解析、メチル化DNA免疫沈降法、MIAMI （Microarray-based Integrated Analysis of Methylation by　Isoschizomers）法など メチル化DNA検出原理による分類 バイサルファイト処理による塩基置換 メチル化感受性制限酵素による切断 抗メチル化シトシン抗体、またはメチル化DNA結合タンパクによる濃縮 バイサルファイトシーケンス法　bisulfite sequence, Bisulfite conversion バイサルファイト　bisulfite：重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素塩 一本鎖DNA上のシトシンはバイサルファイトによりスルホン化、加水脱アミノ化反応し、引き続き脱スルホン化することでウラシル（U）に変換される。メチル化シトシン：mCはメチル化シトシンのまま変換されない。そのためバイサルファイト処理したDNAを鋳型に用いてPCR増幅し塩基配列を読むと、メチル化シトシン部位はC，非メチル化シトシン部位はTとして区別して読まれる。 処理後、非メチル化DNAとメチル化DNAは異なる塩基配列を持つことになり、PCR増幅後にシーケンス解析や制限酵素処理などの方法でDNAメチル化解析を行うことができる。 reduced representation bisulfite sequencing：RRBS 　参考1 全ゲノム網羅的DNAメチル化解析 CpG-rich領域を中心に、メチル化を1塩基の解像度で検出し、大量のサンプルをより少量のデータで解析する。 制限酵素でカットしたプロモーターとCpGアイランドを集めてBisulfiteシーケンシングを行い、DNAメチル化程度の高解像度検出とシーケンシングデータの高利用率を実現できるDNAメチル化解析ソリューション CCGGを認識するMspIをはじめとした制限酵素処理とサイズ分画を行い、CpG配列の濃縮を図る工夫がされている。制限酵素処理に由来する解析対象領域の制限や、CpG配列が多い部分は濃縮バイアスがかかりやすい問題点があげられるものの、プロモーター領域の70%以上、CpGアイランドの80%以上を網羅することが可能。 RRBSを使ったメチル化解析は、単一細胞やレーザーマイクロダイセクションサンプルでも報告されている。

DNAシーケンシング DNA sequencing　←→DNAシーケンサー/DNAマイクロアレイ/RNA-seq DNAを構成するヌクレオチドの結合順序（塩基配列）を決定することである。DNAは生物の遺伝情報のほとんどすべてを担う分子であり、基本的には塩基配列の形で符号化されているため、世代型シークエンサーは遺伝情報を解析するための基本手段となっている。 手法としては1977年に開発されたサンガー法が改良を加えながら用いられているが、新しい方法も開発され、実用化された。 DNAの塩基配列には生命体に必要な情報が符号化されているので、配列決定はミクロなレベルの生物学の基盤となっていて、分類学や生態学のようなマクロな生物学でも盛んに応用されている。 医学面でも遺伝病や感染症の診断や治療法の開発などに役立っている。Walter GilbertとFrederick Sangerは、DNAシーケンシングの手法を開発した功績により1980年のノーベル化学賞を受賞している。 サンガー法 Sanger method、ジデオキシ法　Dideoxy method、鎖停止法法 Frederick Sanger（1918/8/13日〜2013/11/19　ノーベル化学賞を2度受賞した唯一の生化学者　1958年/1989年）とWalter Gilbert（1932/3/21日〜　アメリカの物理学者・生化学者であり、分子生物学）らが1977年にDNAシーケンシングを改良した。 世代型シークエンサーは同時並行で一気に複数のDNA 配列を決定できるが、サンガー法は一つひとつDNA 配列を決めていく。 DNAポリメラーゼを用いて、塩基配列を調べるDNA（テンプレートDNA）の相補鎖DNAを合成し、その塩基配列を調べることにより、元のDNAの塩基配列を知る方法 現在使われているDNA構造決定法の原形で、3'5ージデオキシヌクレオチドをDNA伸張反応の停止に用いる手法 目的の1本鎖DNAを鋳型としてクレノウフラグメントと4種のデオキシリボヌクレオチドを用いて相補DNAを合成する際、4種のうち1種のジデオキシリボヌクレオチドを加えてDNA合成を阻害させ、様々な長さのフラグメントを合成する。この反応をそれぞれ上記の4種類について行い、1塩基の差で分けられる分解能をもった：ポリアクリルアミド電気泳動装置にかけて分離してDNA配列を明らかにする。 4つの通常のDNA合成系を用意し、そこに低濃度の鎖停止ヌクレオチド（ターミネーター）を加えて反応させるようにしたものである。 ターミネーターは4種のジデオキシヌクレオチド (ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP) のうちそれぞれ1種類だけを用いる。DNAポリメラーゼは鋳型配列に対応するデオキシリボヌクレオチドを取り込みながらDNAを合成していくが、ときどき対応するターミネーターを取り込んで反応がそこで止まってしまうことが起きる。結果的に使ったターミネーターの塩基に対応する様々な長さのDNA断片が生じることになる。例えばターミネーターとしてddATPを加えた系では、生じたDNA断片の3'末端の塩基はアデニンになるという具合である。これならば最初に単なるDNA合成をする必要がないし、4つの反応系だけできちんと配列が確定できる。 次世代シーケンス next-generation sequencing：NGS 数千から数百万ものDNA分子を同時に配列決定可能な強力な基盤技術 次世代シーケンシングでは、複数個体を同時に配列決定できるなど高度かつ高速な処理が可能であることから、個の医療、遺伝性疾患、および臨床診断学といった分野に変革をもたらしている。 DNAシーケンサー　←→DNAシーケンシング DNAの塩基配列を自動的に読み取るための装置 サンガー法は一つひとつDNA 配列を決めていくが、世代型シークエンサーは同時並行で一気に複数のDNA配列を決定できる。 蛍光標識されたプロモーターや、蛍光標識された特異的競合阻害剤を用い、サンガー法で反応させたサンプルを電気泳動を用いて分子量の大きさに従って分離し、それをレーザー光で励起し、その蛍光を検出することにより塩基配列を順次読み取る。 イルミナ社のHiSeqやMiSeq、ライフテクノロジーズ社のIon PGMやIon Proton、パシフィック・バイオサイエンシズ社のPacBio RSIIなど

マイクロアレイ microarray 検査・実験の対象物を多数（たとえば千個以上）固定化しておき、これに対して一度に検査・実験を行うための材料または技術を指す総称である。 特に生物学・医学・薬学の方面で、20世紀末から核酸を対象とするDNAマイクロアレイを中心として開発が進み、利用されるようになってきた。 アレイ（Array）とは整列・並べたものの意味であり、数が少ない場合（数百個以下）にはマクロアレイ（Macroarray）と呼ぶこともある。 DNAマイクロアレイ DNA microarray　←→DNAシーケンシング DNAチップ（DNA chip or biochip）とも呼ばれる。 細胞内の遺伝子発現量を測定するために、多数のDNA断片をプラスチックやガラス等の基板上に高密度に配置した分析器具 塩基配列が既知の多種類の遺伝子のDNAをプローブとして、プレート上に規則正しく貼付けておく。調べたい細胞からmRNAを採取し、蛍光標識する。これをプレート上に貼付けられたDNAと反応させ、蛍光強度を読み取ることにより、mRNAの発現量を網羅的かつ定量的に調べることができる。 あらかじめ塩基配列の明らかな1本鎖のDNAを多種、基板上に配置しておき、これに検体を反応させれば、検体のDNA配列と相補的な塩基配列の部分にのみ検体のDNA鎖が結合する。結合位置を蛍光や電流によって検出し、最初の配置から検体に含まれるDNA配列を知ることができる。検体の塩基配列が予測できる場合には、効率的にその配列が特定できる。 マイクロアレイ解析に期待するのは、どれが発現変動遺伝子なのかということ：「どの遺伝子の発現が上がっていて、どの遺伝子の発現が下がっているのか」 遺伝子発現差解析ならば、RNAseqよりマイクロアレイの方がいろんな点で優れている。 マイクロアレイはダイナミックレンジが広いので有利。次世代シーケンサーでは膨大なリード数が必要となる。次世代シーケンサーでは、遺伝子長の長い遺伝子ほどより検出されやすい。 アレイインフォマティクス　Array of informatics DNAチップやDNAマイクロアレイ等で得られる大量の発現プロファイル情報（個々の遺伝子の発現量）を統計学的手法等により解析し、遺伝子の機能解析や遺伝子ネットワークの解析を行うための情報処理技術 データの正規化 クラスター解析 ネットワーク解析

遺伝子オントロジー解析：GO解析、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析 Gene Ontology analysis, GO analysis, GO enrichment analysis 　→バイオインフォマティクス/遺伝子オントロジー/発現変動遺伝子 ヒトやマウスを含むさまざまな種の遺伝子関連情報はデータベース化されている。これを基に得られた網羅的遺伝子発現データを特定の遺伝子に注目して解析するのではなく、生物学的プロセス、細胞の構成要素、分子機能の3つのカテゴリーに分け、各遺伝子群ごとに解析する手法を遺伝子オントロジー解析という。 生命科学における最初で最大のオントロジーは、遺伝子の機能注釈（アノテーション）に必要な、生物学的プロセス（biological process）、細胞の構成要素（cellular component）、分子機能（molecular function）の３つの概念に属する用語を分野横断的に収集し、それらの詳細な分類と相互関係を提供した。この成功を受けて、生命科学分野では、様々な種類のオントロジーが作成されるようになり、オントロジー間の相互運用も課題となっている。 RNA-seqを利用して発現変動遺伝子を同定する場合、データセットによっては数百から数千個もの遺伝子が発現変動していると同定される。このような大量な遺伝子に対して、GO 解析を一つの解釈方法として用いることが多い。 さまざまなフリーのツールがある。 統計解析用フリーソフトウェア R 上で利用できる GO 解析のパッケージは Bioconductorで多数提供されている。　参考 g:Profiler:a web server for functional enrichment analysis　参考1/2 インフォマティクス　informatics　→バイオインフォマティクス/アレイインフォマティクス 情報学・情報処理・情報システム・情報科学といった分野の周辺ないし関連分野 自然物または人工物としての情報の管理、構築、蓄積などを研究対象とし、概念的あるいは理論的な基盤の発達を目的とする。 コンピュータの発達により、個人的にも組織的にも情報をコンピュータで扱うようになり、現在では主に社会的認知の側面を対象とした情報技術の影響を研究が行なわれている。 バイオインフォマティクスなど、インフォマティクスという用語は特殊化された情報の管理やデータ処理、情報知識の統合、概念的または理論的な情報の統合といった事柄を示す。 情報の数理的性質を扱う情報理論が根底にあり、あるいはその応用と考えられる分野とも言える。社会に存在する情報の集合や分類、操作、蓄積、検索あるいは拡張性を範囲内に収め、さらに人工知能（artificial intelligence）－コンピュータの知能、学習、適応性を研究する分野－やコンピュータ科学－コンピュータを扱った情報処理、コミュニケーション、計算装置の設計を扱う分野とも深く関係している。 情報理論　information theory 情報・通信を数学的に論じる学問である。応用数学の中でもデータの定量化に関する分野であり、可能な限り多くのデータを媒体に格納したり通信路で送ったりすることを目的としている。 情報エントロピーとして知られるデータの尺度は、データの格納や通信に必要とされる平均ビット数で表現される。例えば、日々の天気が3ビットのエントロピーで表されるなら、十分な日数の観測を経て、日々の天気を表現するには「平均で」約3ビット/日（各ビットの値は 0 か 1）と言うことができる。 生命情報科学、バイオインフォマティクス　bioinformatics 生命科学と情報科学の融合分野のひとつで、DNAやRNA、タンパク質の構造などの生命が持っている「情報」といえるものを情報科学や統計学などのアルゴリズムを用いて分析することで生命について解き明かしていく学問である。 機械学習よる遺伝子領域予測や、タンパク質構造予測、次世代シーケンサーを利用したゲノム解析など、大きな計算能力を要求される課題が多く存在するため、スーパーコンピュータの重要な応用領域の一つとして認識されている。 主な研究対象分野に、遺伝子予測、遺伝子機能予測、遺伝子分類、配列アラインメント、ゲノムアセンブリ、タンパク質構造アラインメント、タンパク質構造予測、遺伝子発現解析、タンパク質間相互作用の予測、進化のモデリングなどがある。 オントロジー　ontology 哲学用語で存在論のこと。ものの存在自身に関する探究、あるいはシステムや理論の背後にある存在に関する仮定という意味である。 遺伝子オントロジー　gene ontology：GO　←→GO解析 生物学的概念を記述するための、共通の語彙を策定しようとするプロジェクト 1990年代後半から、生物学における実験手法の革新（次世代シーケンサーやDNAマイクロアレイなど）や、次世代シーケンサー的手法の発達により、様々な種の遺伝子関連情報がデータベース化されている。 これらに蓄積された情報を有効に活用するためには、統一された語彙を用いて、機能情報などを記述する必要がある。統一された語彙を用いることで、異なった機関によって作成されたデータベース、更に異なった生物種のデータベース間で、データの結合や、横断比較を行うことが可能になる。データベースは無料で公開されている。 機能注釈、アノテーショ　annotation ゲノム分野における「アノテーション」とは、塩基配列データに遺伝子構造や遺伝子機能の情報、また文献情報などを注釈付けすること また、人が目で確認を行う場合を「マニュアルアノテーション(manual annotation)」、コンピュータが自動で行う場合を「自動アノテーション（automatic annotation）」と分類している。

RNA sequencing：RNA-Seq　←→DNAシーケンシング whole transcriptome shotgun sequencing：WTSS　参考1/2 細胞などの遺伝子発現量を転写レベルで網羅的に解析する手法 元々は　RNAの配列情報を決定するという意味で使われていた。 次世代シーケンサーによるRNA-seq解析では、転写産物の発現定量化だけではなく、配列から新規転写産物や新規スプライスジャンクションを網羅的に探索することや、微量転写産物を検知することが期待されている。 細胞中で発現している全転写物（トランスクリプトーム）の解析技術はマイクロアレイから次世代シーケンサー（RNA-seq）に移行しつつある。 マイクロアレイでは検出できない新規転写産物、遺伝子融合、一塩基バリアント、indel、およびその他未知のバリアントを検出することができる。 全転写物の発現量を定量するには、まずサンプルから転写物であるRNAを抽出する。次に、これらの RNA を短かく切断する。続いて、このようにできた断片RNAからcDNAライブラリーを作成する。最後に、高速シーケンサーを利用して、cDNAの両端から 1 塩基ずつ読み取る。 塩基配列はリード（read）と呼び、一方を forward read、他方を reversed read と呼ぶ。 RNA-seqを利用して発現変動遺伝子を同定する場合、データセットによっては数百から数千個もの遺伝子が発現変動していると同定される。このような大量な遺伝子に対して、遺伝子オントロジー解析：GO解析を一つの解釈方法として用いることが多い。 遺伝子発現解析、遺伝子発現プロファイルリング　gene expression profiling　参考1/2/3 マイクロアレイやシーケンシングにより、ある個体の器官、組織、細胞ごとに調べられた遺伝子発現の全体的な様子で、理想的には全遺伝子の発現量として表現される。 RNA-seqのリードデータをリファレンスゲノムに対してマッピングを行うと、結果としてどの遺伝子にどれぐらいのリードがマップされたかを表すリードカウントデータが得られる。カウントデータをまとめた表が得られることで、2つあるいはそれ以上のサンプルを比較し、サンプル間で発現量の異なる遺伝子：DEGsを検出できるようになる。 発現変動遺伝子　Differentially Expressed Genes： DEGs 異なる条件やグループ間の比較 において発現量が大きく上昇または減少した遺伝子 RNA-seqを利用して発現変動遺伝子を同定する場合、データセットによっては数百から数千個もの遺伝子が発現変動していると同定される。このような大量な遺伝子に対して、遺伝子オントロジー解析：GO解析を一つの解釈方法として用いることが多い。 発現変動遺伝子の同定には倍率変化による選別と仮説検定に基づく判定がある。 倍率変化による選別 一方の発現量の値が他方と比べて2倍より大きく増えたか、あるいは1/2倍より小さくなった場合に、DEGと判定することが多い。 この慣習的に用いられる閾値に何ら根拠はなく、4倍と1/4倍など、他の値に設定しても構わない。 比較したい2つのグループのそれぞれに複数のサンプルがある場合は、発現量の対数を取ったものの平均値を用いる。先に算術平均をとってから対数変換するのではない。 仮説検定による選別 DNAマイクロアレイのデータでは、対数変換するとほぼ正規分布になるため、一般的にt検定が用いられる。 通常はWelchのt検定を 両側検定で使うことが多い（2群比較、独立性、非等分散を仮定したことを意味する、） 散布図 Scatter plots 2サンプル間の比較　変動の大きさをみる。 　　増加した遺伝子（赤）： ratio > 2.0 　　減少した遺伝子（青）： ratio < 0.5 正規化後データを用いる。 散布図の色付けは、変動遺伝子を ratio と Z-score (intensity-based) の両方を用いて、判定したものになっている。 　　増加した遺伝子（赤）： Z-score > +2.0 　　減少した遺伝子（青）： Z-score < -2.0 エムエープロット、MA プロット　M-A plot 2サンプル間の比較。変動の大きさを見る。 シグナル値の高低と ratio の関係 横軸が全体的な発現レベル、縦軸がlog比からなるプロット 名前の由来は、対数の世界での縦軸が引き算（Minus）、横軸が平均（Average） M > 1 ということは、logFC > 1 つまり、ratio > 2　（発現増加）赤 M = 0 ということは、logFC = 0 つまり、ratio = 1　（変動なし） M < -1 ということは、logFC < -1 つまり、ratio < 0.5　（発現減少）青 DESeq2　参考1 RNA-seqの二群間比較 RNA-seqのリードカウントデータから発現変動遺伝子：DEGを検出するためのパッケージ 一般化線形モデルをサポートしているため複雑な解析にも柔軟に対応できる。 二群間比較に対しては、Wald 検定と尤度検定の 2 種類の方法が利用できる。 負の二項分布を仮定している。 正規化法：RLE法 edgeRのモデルをさらに拡張（しているらしい） パラメーター推定を行う際に外れ値も考慮に入れている。また、biological replicate が少ないあるいは存在しない時も、発現量の似ている遺伝子のデータを利用するなどして分布のパラメーターを効率よく推測を可能にしている。 他のパッケージとして、edgeRやMBCluster.Seqなどがある。 正規化　参考 RNA-Seq データから得られたリードカウントデータは、そのまま転写物（遺伝子）発現量を表すわけではない。 RNA-Seq によりシーケンシングされたリードは、mRNA などの転写産物の断片である。その断片の元となる転写産物の長さが長ければ長いほど、リード数が多くなる。つまり、短い転写産物からシーケンシングされたリードの数は少なく、長い転写産物からシーケンシングされたリードの数は多いという状況が起こる。遺伝子間の発現量比較を行うのが目的であれば、このような転写産物の長さに由来する影響を取り除く必要がある。その解決方法の一つとして、転写産物 1,000 bp あたりのリード数を求めればよい。このような操作を正規化という。 ライブラリサイズ　library factor　＝総リード数　＝sequecning depth ライブラリ libraryとはサンプルのこと ライブラリサイズとはライブラリのリード数のこと。Sequecning depthともいう。 fragments per kilobase of exon per million reads mapped：FPKM RNA-Seq データから得られたリードカウントデータに対して、総リード数による補正の後に、転写産物長による補正を行なって得られるデータを FPKM（single-end リードの場合は RPKM）という。 ただし、FPKM/RPKM は転写産物の発現量を正しく表せないことが報告されていて、最近では、FPKM/RPKM の代わりにTPMが用いられるようになった。 transcripts per millio：TPM TPM は、サンプル中に全転写産物が 100 万個存在するときに、各転写産物に何個あたりの転写産物が存在するのかを表す値である。 RLE法　relative log expression　参考 DESeq/DESeq2の正規化はsize factorと呼ばれる係数を計算し、この係数を利用してカウントデータを正規化している。 size factor　＝scaling factor 各ライブラリのFPKMやフラグメントカウントを割るための値。各ライブラリについて計算される値。正規化因子とかスケーリング因子とか呼ばれたりする。通常他のライブラリに比べてFPKMやフラグメントカウントが大きいライブラリのsize factor子は大きくなる。 この size factor は、edgeRに実装されている TMM 正規化法で計算される normalization factor と異なるものである。 size factorsはライブラリーサイズに依存しない。 edgeR 発現が負の二項分布に従うと仮定した検定法 edgeR はTMM法による正規化を行う。 Trimmed mean of M values　TMM 法 RNA-seq のリードカウントデータを正規化する方法の一つである。 発現が負の二項分布に従うと仮定した検定法。FPKM/RPKM補正のcufflinksより正しくDEGの検出ができる検定法とされる。 normalization factors とよばれる係数が計算され、正規化はこの係数とライブラリーサイズの積を利用して正規化を行う。 normalization factors はライブラリーサイズに依存するので、normalization factors とライブラリーサイズの積をsize factorと比較する。 細胞内で発現している遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子などのような発現変動のない遺伝子（非発現変動遺伝子）が多いことに着目した正規化法である。 Wald検定　Wald test ロジスティック回帰分析などで、推定された偏回帰係数の有意性を確認するために用いられる検定の一つ 偏回帰係数の推定値を標準誤差で割ったものを2乗した値が自由度1のカイ二乗分布に従うことを用いて、帰無仮説「偏回帰係数は0である」のもとで検定を行う。 Wald 検定は多群間比較のときANOVAのような解析が行えずに 2 群間ずつの比較となる。ANOVA のように群間全体で比較を行う場合は尤度比検定を利用する。 尤度比検定（ゆうどひけんてい）　likelihood ratio test 尤度 likelihood 統計学で、もっともらしさ 想定するパラメーターがある値をとる場合に観測している事柄や事象が起こりうる確率のこと。尤度はパラメーターの関数として表すことができるので尤度関数とも言う。 例えば、「2枚のコインを投げて2枚とも表が出た」という観測結果が得られた場合、この結果が観測される確率はコインが表になる確率p をパラメーターとする関数L(p)=p2で表すことができる。このとき、p=0.2であれば、尤度は0.04である。 確率はこれから行う施行の結果の確率であり、尤度はすでに観測された現象に対する説明の「もっともらしさ」である。 確率密度関数において確率変数に観測値を代入したものをいう。つまり，確率密度を観測値で評価した値である。また，これを未知母数の関数とみる時、とくに尤度関数という。尤度関数の自然対数は対数尤度と呼ぶ。観測値とその確率分布が与えられたとき、尤度あるいは対数尤度を最大にする母数の値は，母数の一つの自然な推定量を与える。これは最尤推定量と呼ばれ，標本サイズが大きくなると母数の真値に漸近的に一致するとか、漸近的に正規分布に従うなど、いろいろ好ましい漸近的性質をもつ。 尤度比を検定統計量として用いる統計学的検定の総称である。 検定統計量とは検定に用いる統計量（標本データの関数）であり、その値が予め決めた有意水準より小さいならば帰無仮説を棄却する検定を行う。 単純二仮説の場合には尤度比検定は一様最強検出力検定となる（ネイマン・ピアソンの補題）。 尤度比検定は2つの統計モデルのそれぞれから計算される尤度を比較することにより検定を行う方法であり、一般化線形モデルでよく使われる検定の一つである。この考え方は発現変動遺伝子の検出にも適用できる。 Benjamini-Hochberg Procedure　BH法 BenjaminiとHochbergが1995年に発表した、FDRを調整する方法 ヒトやマウスの遺伝子は2万個以上あるので、各遺伝子についてt検定を繰り返せば、当然多重比較のための特別な処置が必要となってくる。通常の実験研究ではBonferroni補正やTukey-Kramer法などが使われるが、遺伝子発現量データ解析ではBH法によるFDR制御がよく用いられる。 FDRを制御することによって補正するBH法は、第1種の過誤の確率が上昇するという代償を払って、より高い検出力を有している。 Bonferroni法やHolm法によるfamilywise error rate：FWERの調整は、「何回検定を繰り返しても、全体のαレベル（FWER）は0.05を超えないようにする！」という非常に保守的な方法である。したがって本当は有意差があるのに、帰無仮説が棄却されないというβエラー（第2種の過誤）が問題になる。そこで、ある程度αエラー（第1種の過誤）を許容して、βエラーを起こす可能性を小さくする方法の一つとして、FDRを調整するという方法が開発された。 ある有意水準を決めた時、陽性判定となる遺伝子の中に含まれる、偽陽性の割合を表わす値を調べるためにも用いられる。 q-value という p値のように扱うことのできるFDRの指標をそれぞれの帰無仮説に対して求める。 偽発見率　False Discovery Rate：FDR 　←→FDRを調整するためのBenjamini & Hochberg法（BH法） FDRは、多重検定を行う際の有意水準指標の一つ 棄却した帰無仮説の中に含まれる、正しい帰無仮説の割合の期待値を表している。 ある有意水準を決めたとき、陽性判定となる遺伝子のなかに含まれる偽陽性の割合を表わす値 Bonferroni補正では、陰性データの分布のみに着目しながら有意水準を調整することによって，偽陽性数を減らそうとしていたので、有意水準が厳しくなりすぎてしまった。そこで陽性データの分布も考慮に入れて有意水準を設定することを考える。陽性判定データのなかに混ざっていると見積もられる偽陽性の割合が許容範囲になるよう有意水準を調整する。 FDRは「棄却された全ての帰無仮説のうち、αエラー（第1種の過誤）が含まれている確率」ではある。 例えば、FDR = 0.1 のもとで100個の帰無仮説に対して検定を行って、20個の仮説を棄却したとする。このとき、この棄却された20個の仮説のうち、間違って棄却されたと思われる仮説が 20 × 0.1 = 2 個未満である。 ファミリーワイズエラー率　familywise error rate：FWER 多重仮説検定を行う時に、全ての仮説の中で少なくとも1つの正しい帰無仮説が誤って棄却されてしまう（第1種の過誤）確率である。 ファミリーワイズは「帰無仮説の集合ごとの」といった意味である。 したがってFWERは「帰無仮説の集合ごとの第一種の過誤の確率」を意味する。（Error rate：危険率） ボンフェローニ補正といったFWER手順は、偽発見率 (FDR) 制御法と比較してより厳しく偽発見を制御する。FWER制御は、偽発見の予測比率ではなく、「たった1つの」偽発見の確率を減らそうと試みる。 外部RNA標準コンソーシアム、External RNA Controls Consortium：ERCCスパイクインコントロールを用いた実験　←→内在性コントロール ダミーのRNA試料に ERCC コントロールRNAを微量 spike-in し、一般的な RNA-Seq 調製キットでライブラリーを調製した後各手法で検出できた ERCCコントロール RNA の数を定量 ERCC Spike-inコントロールは、ストランド方向性が既知の人工的転写物のセットで、アンチセンス転写物を含まない。そのため、検出されたアンチセンスERCC配列読み取り結果はライブラリ調製中に生じた偽陽性と考えられる。一方で、ゲノムワイドでストランド方向性を算出する場合、真のアンチセンス転写物の影響から正確な値が得られない。そのため、真のストランド特異性はERCCデータによってのみ算出でき、内在性アンチセンス転写物レベルと擬似的な第2鎖合成によるバックグラウンドとを区別する許容限度レベルも得られる。 階層的クラスター分析 log2変換やQuantile正規化されたRPKM値を使って、全サンプルに対し、教師なし階層的クラスタリング（Unsupervised hierarchical clustering）を行う。 その結果、赤色は高い発現を示し、緑色は低い発現を示す。 シングルセルRNAシーケンス 個々の細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを調べ、細胞間の差異を高解像度で把握できる手法 高感度RNAシーケンス（RNA-Seq）法では、トランスクリプトームを偏りなくプロファイリングすることで複雑な組織における細胞の個々の寄与を評価することができまる。 　→シングルセルトランスクリプトーム解析、single cell transcriptomics：SCT

キャップトラッパー法　Cap-trapper 完全長cDNAを作製するために開発された理化学研究所の独自技術 理化学研究所・トランスクリプトーム研究チームのDr Piero Carninciが開発した。 RNAポリメラーゼIIによって転写されたmRNAからcDNAを作製した後、NaIO4およびビオチンヒドラシドなどで処理することにより、5'末端CAP構造および3'末端 polyA をビオチン化する。 完全長cDNAをは全長においてDNA/RNAのハイブリッドをつくっていることを利用して、RNase I処理によって1本鎖RNAを切断し、ビオチンを指標に濃縮することによって不完全長cDNAを排除する。 過ヨウ素酸ナトリウム　sodium periodate：NaIO4 ナトリウム・ヨウ素・酸素から成る無機塩の一種 ７価のヨウ素化合物 元となるメタ過ヨウ素酸が、pKa = 1.64となかなか強い酸性を示す一方で、そのナトリウム塩である過ヨウ素酸ナトリウムは、基本的には中性の白色結晶 過ヨウ素酸ナトリウムは有機合成分野で酸化剤として用いられる。水にしか溶けないため、溶解性の低い有機分子を酸化する際にはメタノール・エタノール・ジオキサン・アセトニトリルなどを補助溶媒として用いる。 取り扱い易い酸化剤　アルコールとは反応しないが、特定の官能基に対しては有効な酸化剤として利用されている。 過ヨウ素酸ナトリウムは1,2-ジオールの炭素-炭素結合を切断する酸化剤 糖鎖上のシアル酸のcis-diolは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いた穏やかな酸化開裂によりアルデヒド基（－CHO）を生成する。 ジオール　diol 2個の水酸基が2個の異なる炭素に結合している脂肪族あるいは脂環式化合物の総称 グリコール (glycol) はアルコールの一種（ポリオール）で、鎖式脂肪族炭化水素または環式脂肪族炭化水素の2つの炭素原子に1つずつヒドロキシ基が置換している構造を持つ化合物であり、ジオール化合物とも呼ばれる。 2個の水酸基はそれぞれアルコールとしての性質をもち、隣合せの炭素に結合しているものを1,2‐グリコールといい，間にメチレン鎖－CH2－が増えていくにしたがって、1,3‐グリコール，1,4‐グリコール，1,5‐グリコールなどと呼ばれる。 ビオチンヒドラジド　biotin hydrazide ビオチンのヒドラジド誘導体 タンパク質修飾において、糖タンパク質の糖鎖部分が反応する、最も一般的な標的の1つ ビオチンヒドラジドはヒドラジノ基を有するため、タンパク質のカルボニル基に結合できる。 アルデヒド基は、pH 4-6においてヒドラジドと反応してヒドラゾン結合を形成する。

Cap Analysis of Gene Expression：CAGE法、CAGE-seq　参考1/2 CAGE法は理化学研究所とダナフォームが共同開発した、他の発現解析技術とは異なる視点のトランスクリプトーム解析技術 CAGE-seqは、理化学研究所にて開発されたRNA-seqやマイクロアレイに代わる新しい発現解析方法で、完全長cDNAをのみを回収し、mRNAやlncRNAの発現量および転写開始点を網羅的に解析する方法です。その特徴は、RNAの5’末端に付加されるキャップ構造を特異的にビオチン化して回収すること（キャップトラッパー法）。PCRによる増幅工程をライブラリー作製過程から完全に排除することにより、CAGE-seqは、他の方法よりも定量性に優れ、広いダイナミックレンジを有している。さらに、転写因子結合モチーフやalternative promoterの探索、高度な遺伝子制御ネットワークの推定など、CAGE-seqの結果からは多くの情報を得ることができる。 耐熱性逆転写酵素やキャップトラッパー法を組み合わせて転写物の5′末端の塩基配列を決定する実験技法 RNAのCap構造を捕捉する技術などを組み合わせて転写産物の5'末端の塩基配列を決定する実験手法。この塩基配列を読み取ってゲノム配列と照らし合わせることで、遺伝子の転写開始点をゲノムワイドに同定することができる、マイクロアレイやRNA-seqに代わる発現解析法 この塩基配列を読み取ってゲノム配列と照らし合わせて、どこからどこまでコピーが始まっているかを調べることができる。 遺伝子の転写開始点をゲノムワイドに同定できる。 CAGEの基本は、マウスエンサイクロペディアプロジェクトで開発した一連の完全長cDNA技術 CAGEライブラリを作成するには、はじめに、細胞や組織から抽出した全RNAから、ランダムプライマーまたはオリゴdTプライマーを用いて相補鎖cDNAを合成し、キャップトラッパー法によりcDNAの5’末端を選別する。 RNase Iを用いてRNA鎖を除去して得られる一本鎖cDNAの5’末端にビオチン化したリンカーを結合する。このリンカーには、クローニングに必要な認識部位、目印になる短い特異的塩基配列およびエンドヌクレアーゼ認識部位（MmeI）が含まれている。 第2鎖cDNAを合成した後、クラスII制限酵素（MmeI）で5’末端から20塩基を切り出す。これをタグ配列という。切り出されたタグ配列の3’側に二本のリンカーを結合させる。 このリンカーは別の制限酵素認識部位（XmajI）を含んでいる。ストレプトアビジンコートした磁気ビーズを用いて、ビオチン化したcDNAタグのみを取り出して精製する。 両端のリンカーにある認識部位を制限酵素で切断し、リンカーの間に挟まれたタグを切り出します。このようにして得られたCAGEタグのDNA配列を決定し、ゲノム上にマップしていく。 Chromosome Conformation Capture assay：3C アッセイ　　←→クロモソーム　参考1 2002年〜 J. Dekker （Harvard University）らによって開発され、核内で3次元的に近接する領域を検出する方法 核内で位相的に接して存在しているゲノム領域を特定する方法 細胞核内のクロマチン相互作用を検出する方法 さまざまな染色体領域の細胞核内での3次元的な折り畳みパターンを解析するこが可能となっている。 DNA配列上では遠位にあっても，空間的に近接して存在するゲノム領域を検出する方法 Hi-C解析　Hi-C法 3C法を応用した方法で、in vivoでゲノムがどのような三次元上の距離をとるかを1対多や多対多の領域で網羅的に得ることができる。 4C法や5Cなどが存在し、一般的には4C以上をHi-Cと呼ぶ。 シーケンシングによって、ゲノム（染色体）の3次元空間内の立体構造を明らかにする手法 Hi-C法などの最新のゲノム解析技術によって、クロマチンの相互作用を検出できるようになり、核内での染色体構造の三次元像が得られるようになった。 Chromosome conformation capture-on-chip =3C-on-chip、circular 3C：4C 核内空間において、あるDNA座位と接する座位を、バイアスをかけることなくゲノムワイドに検索方法 3C carbon copy：5C Topology associating domain：TAD　参考1 ヒトゲノムには約2000のTADが存在すると考えられている。 核内で位相的に接して存在しているゲノム領域を特定するchromosome conformation captureの開発が大きく寄与している。 TADは平均500kb—1Mb程度の大きさで、その中に1個から複数の細胞特異的、あるいは発生時期特異的に働くcoding遺伝子と、その発現調節（エンハンサー）領域を含む長いDNA単位が大きな塊を作って核内に存在していると考えられる。 バイオイメージング Bioimaging　参考1 そのままでは見ることのできない生体内の分子の挙動を、生きたままの状態で観察できるようにする技術 バイオイメージングのツールには、タンパク性の分子としてはGreen Fluorescent Protein：GFP、低分子化合物としてはフルオレセインやローダミンなどが汎用されている。 見たい分子をGFPやフルオレセインなどの蛍光分子で標識することで、生体内の分子の挙動をリアルタイムで観察することが可能となる。 蛍光分子の原理を応用することにより、特定の酵素や生理活性分子との反応により蛍光特性（蛍光強度や波長）が変化がする「蛍光プローブ」が数多く開発されている。 ライブイメージング live imaging 生体組織や細胞を生かしたまま、個々の細胞のはたらきや遺伝子の発現の様子を可視化し、外部から観察する手法 観察対象であるタンパク質にGFPをつないで細胞内に導入し、蛍光顕微鏡や二光子励起顕微鏡などでその挙動を知ることができる。

　→オプトジェネティクス/チャネルロドプシン2/アーキロドプシン3/ハロロドプシン/ケモジェネティクス（DREADD）

⭐︎遺伝子関連　←→遺伝子関連酵素/遺伝子/タンパク質

構造遺伝子 structural gene タンパクをコードする遺伝子 タンパク名がすでに命名されている場合には、遺伝子はできる限りタンパクと同じ名前とする。 特定のポリペプチドの構造（タンパク質の1次構造、アミノ酸配列）またはヌクレオチド（RNAの1次構造の1部）を決定するDNA領域（ヌクレオチド配列） シストロンとも呼ばれる。 構造遺伝子はmRNAに転写され、リボソームに運ばれて、そこでポリペプチド鎖に翻訳される。 ポリペプチド鎖からなる分子がタンパク質であるが、なかにはmRNAに転写された後、選択的スプライシングによって一度に複数のタンパク質を生じるものもある。その場合、構造的に関連した一連のタンパク質を生む。 「構造遺伝子」はラクトースオペロンに由来する用語である。構造遺伝子は典型的にはタンパク質が遺伝子発現を調節するように機能しない限り、産生されるタンパク質のアミノ酸に対応するDNAの配列を含む遺伝子とみなされる。 構造遺伝子産物には、酵素および構造タンパク質が含まれる。

調節遺伝子　regulator gene 構造遺伝子の形質発現を調節する機能をもつ遺伝子 プロモーターやオペレーターなど

標的遺伝子 target gene　←→遺伝子ターゲティング法/オフターゲット効果 分子生物学の実験で、遺伝子変異の導入や組換えなどを起こさせる目標とする遺伝子

ハウスキーピング遺伝子 housekeeping gene どの細胞でも常に発現し、細胞の生命活動に必須な機能を果たしている遺伝子の総称 形質発現や細胞分裂などの基礎機構に関与するもの、細胞のエネルギー代謝、物質代謝を支えるものなど、遺伝子には様々なものがある。 β-Actin　→β-Actin αアクチンは筋に含まれ、βアクチンはマイクロフィラメントを構成するアクチンである。 外径は6 nm前後。二重らせん構造となっており、アクチン分子13.5個、35 nmでちょうど1回転ねじれている。 代表的なハウスキービング遺伝子の１つ GAPDHやβ-Actinといったハウスキービング遺伝子は発現量が変動せず安定しているので、ノーザンブロッティングなどで内在性コントロールとして利用される。 ハウスキービング遺伝子の発現量が多少変動するので、高精度のリアルタイムPCRでは、内在性コントロールとして利用できない。 CpGアイランド CpG islands：CGI CpGサイト　CpG site シトシンとグアニンが隣り合うDNA配列 CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表している。 シトシンの次にグアニンが現れるタイプの２塩基配列（ジヌクレオチド）であるCpGサイトの出現頻度が、ゲノム中で他と比べ高い領域のことである。 グアニンとシトシンの合計の含有率が50％以上，CpG配列頻度の実測値と予測値の比が0.6以上である200塩基以上のゲノム領域． CpGアイランドの定義は、少なくとも200塩基対の長さを持ち、GC含量が50%以上で、存在するCpGの割合が60%以上というものである。 CpGアイランドは哺乳類の遺伝子のプロモーターの40％近くを占める。 ヒトゲノムでは遺伝子プロモーターの約70％がCpGアイランドを含むとされる。 哺乳類ゲノム上では約半数の遺伝子の転写開始点に存在し，その大部分がいわゆるハウスキーピング遺伝子である発現調節異常の原因となることが知られている。 通常CpGアイランドがメチル化されると遺伝子の転写が抑制される。 CpGアイランドは通常メチル化されていないが、がん細胞ではしばしばCpGアイランドのメチル化による遺伝子転写抑制がみられる。 脊椎動物においては、CpGアイランドのシトシンが高度にメチル化を受ける。シトシンのメチル化はDNAメチルトランスフェラーゼによって触媒される。シトシンがメチル化を受けるとメチル化シトシンに特異的に結合するタンパク質（methyl-binding protein：MBPs）などの働きにより、遺伝子発現の抑制や、染色体の不活化が起こる。 ヒト遺伝子のCpGアイランドを含むプロモーター領域でRループが広範に形成されている。 Toll様受容体のひとつTLR9タンパク質が、メチル化されていないCpG核酸断片を認識し、免疫機能をオンにする。 →ハウスキーピングな酵素：GAPDH

セーフハーバー遺伝子座、安全領域　safe harbor さまざまな細胞で転写活性を有しているが、欠損させても細胞に有害作用が生じないことが知られ遺伝子座 導入遺伝子の安全な発現を可能にする遺伝子座 ROSA26 CRISPR/Cas TALEN ヒトゲノム内の AAVS1（Adeno-associated virus integration site 1）領域（PPP1R12C 遺伝子座）

アクセサリー遺伝子　accessory gene 薬剤耐性遺伝子群や病原性遺伝子群、物質代謝遺伝子群など、宿主の生存に必須ではない遺伝子群

遺伝子重複 gene duplication / chromosomal duplication 遺伝子を含むDNAのある領域が重複する現象のことである。遺伝子重複が起こる原因としては、遺伝的組換えの異常、レトロトランスポゾンの転移、染色体全体の重複などがある。 遺伝子の重複だけでなく、ゲノム全体の重複も珍しいことではない。例えば酵母のゲノムは1億年ほど前に重複したと考えられている。また植物では頻繁にゲノム重複が起こっており、コムギは6つのゲノムセットを持つ6倍体である（→ 倍数性） 染色体 1q21.1 の反復性 第1染色体　q-arm of Chromosome 1 染色体1q21.1領域は大規模で複雑な低コピー反復配列を含んでいて、この領域のコピー数多型（CNV）は、最近、先天性心疾患、統合失調症およびそれに関連する精神病との関連が報告されている。 ヒトゲノムの重複と欠失は疾患を引き起こしたり、疾患にかかりやすくなる。 1q21.1 deletion syndrome 1q21.1 duplication syndrome 配列と機能の似た遺伝子 またホモ（homo-）は「同じ」「等価」の意を示す接頭語 ホモログは狭義には、同種内・同染色体上における、共通の起源をもつ相同性の高い遺伝子配列の関係を指す。 ホモログは、オーソログとパラログの2種類に分けられる。 オーソログ orthologs オルソ（ortho-）は「正の」という接頭語 種分化の際に分岐したホモログ 異種同士における、共通の起源をもつ単一の遺伝子から種の分化によってできた相同性を持つ遺伝子配列の関係を指す。 異なる生物に存在する相同な機能を持った遺伝子群 パラログ paralogs パラ（para-）は「近く」「並列の」「普通と少し外れた＝異常な（主に医学系で使用される）」という接頭語 遺伝子重複によって生じたホモログ：遺伝子重複によりその遺伝子がコピーされてできたもの 同種・異染色体上における、共通の起源をもつ単一の遺伝子から遺伝子重複によってできた相同性を持つ遺伝子配列の関係を指す。 一般に機能や構造が異なるタンパク質をコードする。 ヒト特異的NOTCH2NL遺伝子には３つのパラログがある。 ゼノノログ xenolog 水平移動によって得られた類似遺伝子

偽遺伝子 pseudogene DNAの配列のうち、かつては遺伝子産物（特にタンパク質）をコードしていたと思われるが、現在はその機能を失っているものをいう。偽遺伝子はもとの機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと考えられている。具体的にはある位置でストップコドンが生じてタンパク質のペプチド鎖が短くなってしまいタンパク質として機能を果たせなくなる場合、あるいは正常な転写に必要な調節配列が機能を失う場合などがある。元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、単独でそのまま偽遺伝子になったものもある。 偽遺伝子は構造から3つのタイプに分けることができる。 正常な遺伝子からイントロン配列が取り除かれて末端にポリA配列が付いた、mRNAのような構造をとるタイプ 重複偽遺伝子または非プロセス型偽遺伝子と呼ばれるタイプ ゲノム内の単独の遺伝子がそのまま突然変異により機能を失ったもの

マーカー遺伝子 marker gene 選択マーカー selectable marker 遺伝子組み換え生物を作成する際、組み換えに成功した生物をスクリーニングするための目印として導入する遺伝子 多くの場合、遺伝子導入が成功した形質転換体と非形質転換体では外観上差はない。また、組み換え効率は非常に低いため、大量の培養細胞の中から形質転換体を効率よく検出する必要がある。 そのため、遺伝子組み換え生物の作成にはマーカー遺伝子の利用は必須である。 →蛍光タンパク質などの遺伝子/薬剤耐性遺伝子/発現すると致死的に働く遺伝子 蛍光タンパク質・呈色反応を触媒する酵素の遺伝子　←→レポーター遺伝子/蛍光/蛍光色素/光タンパク 緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子 ルシフェラーゼ遺伝子 β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子(uidA) β-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ) 薬剤耐性遺伝子　drug resistance gene　←→薬剤耐性プラスミド 遺伝子トラップ法、遺伝子ターゲティング法、トランスフェクションに用いられる。 抗生物質耐性遺伝子 antibiotic resistance genes　←→抗生物質選択 抗生物質に対して耐性を発現させる酵素の遺伝子 アンピシリン耐性遺伝子 ampicillin resistance gene, ampicillinr, ampr β-ラクタム系（ペニシリン系）抗生物質であるアンピシリン存在下でも宿主のE. coliが増殖することを可能にする遺伝子　←→プラスミドpBR322 従って、このベクターをもっているE. coliのみを選択的に得ることができるようになる。 βラクタマーゼをコードしていて、βラクタマーゼがアンピシリンのβラクタム環を加水分解することによってアンピシリンを無害化する。 βラクタム環を持つことで抗菌作用を示すような抗生物質に対して耐性を示す。 ネオマイシン耐性遺伝子　neomycin resistance gene：neo ネオマイシン耐性遺伝子の細胞へのトランスフェクションは、細胞をG-418耐性（neor）にし、 ジェネティシン（G-418）を含む培地での増殖を可能にする。 ネオマイシンを含む培地で培養すると、ネオマイシン耐性遺伝子を持たない細胞は生き残れないので、ネオマイシン耐性遺伝子を繋いだ遺伝子がトランスフェクションされた細胞だけを得ることができる。 動物細胞培養系で用いられる。 G-418、ジェネティシン Geneticin®　参考1 ゲンタマイシンに類似した構造のアミノグリコシド系抗生物質タンパク質合成阻害抗生物質 研究目的で、真核生物に対して遺伝子操作を行った細胞を選択するために用いられ、治療には使われない。 1974年シェリング（現・シェリング・プラウ）社の研究チームによって、放線菌Micromonospora rhodorangea NRRL 5326株から単離された。 シェリング社は抗寄生虫薬としての利用を想定して研究を進めていたが、化学療法剤として実用化されることはなかった。 硫酸塩として流通していて、Geneticin®と呼ばれることも多いが、これはライフテクノロジーズ社の登録商標である。 硫酸ネオマイシンアナログとして、80Sリボソームの機能と真核生物のタンパク質合成を妨げる。 一般的な哺乳類発現ベクターで用いられる優性で作用するネオマイシン耐性遺伝子には、トランスポゾンTn601 (903)またはTn5に由来する。 Geneticin®選択試薬を含む培地で成長すると、これらの抵抗性マーカーを発現する哺乳類細胞のステーブルのコロニーが10から14日で生成する。 ネオマイシン耐性遺伝子により、アミノグリコシドリン酸転移酵素(APH)が発現することでG418耐性となる。 G418はタンパク質合成のうち伸長反応を阻害する。 通常のアミノグリコシド系抗生物質が真正細菌の70Sリボソームによるタンパク質合成を阻害するのに対して､G418は真核生物の80Sリボソームによるタンパク質合成も阻害する。同様に80Sを阻害するアミノグリコシド系抗生物質としてハイグロマイシンBがある。 一般的には、細菌や藻類に対しては5 μg/mL以下、哺乳類細胞に対しては400 μg/mLの濃度で用いられる。しかし至適濃度は細胞株や耐性遺伝子を運ぶプラスミドの種類に依存するため、実験系ごとに用量を決める必要がある。 カナマイシン耐性遺伝子　←→安定的導入 主にネオマイシンリン酸転移酵素II（neomycin phosphotransferase type II ：NPT II、Neo） アミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼをコードする。 細菌はカナマイシン含有（50〜100µg/mL）寒天培地で耐性遺伝子を含むプラスミドと共に培養すると形質転換して増殖する。形質を獲得できた細菌のみがこの培地で生存できる。 カナマイシン耐性遺伝子はE. coli 等の選択マーカーとして利用されている。 カナマイシン耐性遺伝子はカナマイシンだけでなく、ネオマイシンにも耐性を示すので使いやすい。 ある遺伝子の上流にE. coli用プロモーターと、ヒト用など動物細胞用のプロモーターの両方をつなぐ場合、E. coliでのベクターの構築はカナマイシンを使用し、動物細胞に構築された遺伝子を導入した後にはネオマイシンを使って培養する。　参考1 ピューロマイシン耐性遺伝子 原核・真核細胞双方に毒性を示す。 ピューロマイシン生産菌から得られた。 ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ (PAC) をコードするPac遺伝子 ハイグロマイシン耐性遺伝子　hyg, hph E. coli由来のハイグロマイシン耐性遺伝子　hyg, hph ハイグロマイシンBはG-418と同様に80Sを阻害するアミノグリコシド系抗生物質 安定細胞株樹立のためのコトランスフェクションに利用 直鎖状およびプラスミド型選択マーカー テトラサイクリン耐性遺伝子 テトラサイクリン排出トランスポーターをコードする。 テトラサイクリンは細菌のリボソームに作用して、タンパク合成を阻害する薬剤。テトラサイクリン耐性遺伝子はテトラサイクリンを細胞外へ排出するタンパクをコードしているため、テトラサイクリンに対して耐性を示すことができる。 プロトンとのアンチポーターで、テトラサイクリンを菌体外に排出する。 　→ゲンタマイシン/ ネオマイシン/ ハイグロマイシン/ カナマイシン/ ピューロマイシン 除草剤耐性遺伝子 変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子 薬剤感受性遺伝子、発現すると致死的に働く遺伝子 チミジンキナーゼ（TK）遺伝子←→チミジンキナーゼ 単純ヘルペスウイルス1型-チミジンキナーゼ（HSV-TK）遺伝子　　←→ターゲッティングベクター/glioblastoma 　参考1 ガンシクロビルは通常の細胞に対しては弱い毒性しか示さないが、HSV-TK遺伝子を発現する細胞内ではリン酸化され、強い細胞毒性（DNA複製阻害）を有する最終産物に変化する。 HSV-TK遺伝子が導入された細胞は、発現したHSV-TKが、抗ウイルス薬として汎用されているガンシクロビルに作用し、DNA合成阻害活性を有する毒性物質に変化させるため、自らをアポトーシス死に至らしめる機能（自殺機能）を有している。 従ってガンシクロビルを投与する事によりHSV-TK遺伝子を発現する細胞のみを死滅させることが可能となる。 このことから、HSV-TK遺伝子は一般的に「自殺遺伝子」と呼ばれている。 　→Suicide Gene Therapy ジフテリアトキシン（DT）遺伝子

→レポーター遺伝子/レポーターマウス




染色体、クロモソーム　chromosome　←→3Cアッセイ　参考1 遺伝情報の発現と伝達を担う生体物質である。 細胞分裂時に現れる、塩基性色素（ヘマトキシリン）によく染まる糸状構造体 塩基性の色素でよく染色されることから、Heinrich Wilhelm Gottfried von Waldeyer-Hartz（P 1836/10/6〜1921/1/23, ドイツの解剖学者）が1888年に「Chromosome」と名づけた。Chromo- はギリシャ語 χρῶμα （chroma）「色のついた」に、-some はギリシャ語 σῶμα（soma）「体」に由来する。 一般的には細胞が分裂する前後に細胞内において観察されるもの それ以外の時期には、クロマチンと呼ばれる糸状の構造物になっている。 染色体の最も基本な構成要素は、DNAとヒストンである。分裂期の染色体は一対の姉妹染色分体から構成され、それぞれの染色分体には長いDNA一分子が含まれている。DNAは酸性であり、塩基性タンパク質のヒストンとの親和性が高い。DNAとヒストンの重量比は、ほぼ1:1である。

Genom　←→ゲノム編集/プロテオーム/トランスクリプトーム ある生物をその生物たらしめるのに必須な遺伝情報 遺伝情報を持つ単位であるgene（遺伝子）とchromosome（染色体）を組み合わせた造語であり、細胞における遺伝子全体を対象とする。 1920年にドイツのハンブルク大学の植物学者Hans Winklerにより造られた造語である。 ゲノミクス　genomics、ジェノミクス、ゲノム学、ゲノム科学 ゲノムと遺伝子について研究する生命科学の一分野 ゲノミクスは1980年代に現れ、1990年代のゲノムプロジェクトの開始とともに発展した。初めて完全長のゲノムが解読されたのはバクテリオファージFX174 (5,368 kb) で1980年のことである。 ヒトゲノムのおおまかな配列はヒトゲノムプロジェクトによって2001年前半に解読されている。 ポストゲノムプロジェクトのゲノミクスとして、さまざまな生物種のゲノムを比較することで、進化の解明を試みる比較ゲノミクスや、RNA干渉などによる遺伝子阻害から、全体論的な機構解明を行う機能ゲノミクスなどがある。ゲノミクスではバイオインフォマティクスや遺伝学、分子生物学をツールとして用いるとともに、システム生物学のツールとしても用いられる。 バイオインフォマティクス　bioinformatics、生命情報科学　←→ゲノミクス/プロテオミクス/トランスクリプトミクス/メタボロミクス 生命科学と情報科学の融合分野のひとつで、DNAやRNA、タンパク質の構造などの生命が持っている「情報」といえるものを情報科学や統計学などのアルゴリズムを用いて分析することで生命について解き明かしていく学問である。 機械学習による遺伝子領域予測や、タンパク質構造予測、次世代シーケンサーを利用したゲノム解析など、大きな計算能力を要求される課題が多く存在するため、スーパーコンピュータの重要な応用領域の一つとして認識されている。 主な研究対象分野に、遺伝子予測、遺伝子機能予測、遺伝子分類、配列アラインメント、ゲノムアセンブリ、タンパク質構造アラインメント、タンパク質構造予測、遺伝子発現解析、タンパク質間相互作用の予測、進化のモデリングなどがある。 ゲノム不安定性　genomic instability　←→ドライバー遺伝子 ゲノムが傷つきやすく、書き換えられやすいこと、また、その変化が蓄積しやすいこと ゲノムを安定に維持するには、「DNA修復反応」による速やかな損傷の修復が必要。DNA修復機能の異常によってゲノムの不安定化を生じ、これが引き金となり、発がん、小頭症・低身長・奇形などの各種発育異常、神経症状や早期老化、その他多様な症状を示す遺伝性疾患を「ゲノム不安定性疾患群」と総称する。 ゲノム不安定性疾患の症例解析により、DNA修復に関与する様々な遺伝子が同定され、分子機能が明らかにされてきた。 マイクロサテライト不安定性　microsatellite instability：MSI　←→ゲノム不安定性 ミスマッチ修復：MMR遺伝子の機能異常により、くり返し配列であるマイクロサテライトに異常な反復をきたす現象 マイクロサテライト不安定性とは、DNAの複製の際に生じる塩基配列の間違いを修復する機能の低下により、マイクロサテライト反復配列が腫瘍組織において非腫瘍（正常）組織と異なる反復回数を示す現象 代表的な関連遺伝子としてMLH1が知られる。 マイクロサテライト不安定性は、リンチ症候群以外の散発性大腸がんでも10-20％程度に認められるが、リンチ症候群（HNPCC）の患者では80-90％と高頻度にみられる。 進行・再発の高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）を有する固形がんに対し、抗PD-1抗体ペムブロリズマブ（キイトルーダ）が2018年12月に承認された。 マイクロサテライト　microsatellite ゲノムDNAの中で、1～数塩基程度の短い塩基配列が繰り返す場所 細胞核やオルガネラのゲノム上に存在する反復配列で、とくに数塩基の単位配列の繰り返しからなるもの 縦列型反復配列（short tandem repeat：STR）あるいは単純反復配列（simple sequence repeat：SSR）とも呼ばれる。 繰り返し回数が多くなると遺伝子もしくはその産物であるタンパク質が不安定になりやすく、疾患の原因となるものも存在する。 ゲノム中に広く散在しており、普通は中立で共優性を示すことから、集団遺伝学やDNA鑑定のための遺伝マーカーとして利用されている。 ミスマッチ修復　mismatch repair：MMR DNAの間違いを修正するための、すべての正常で健康な細胞内のシステム DNA複製時に生じる、塩基のミスマッチ（間違った対合や塩基の誤挿入、欠失など）を修正するDNA修復機構の1つ ミスマッチ修復に関わる、最も一般的な2つのタンパク質は、MSH6、MSH1、MLH2、およびPMSXNUMXと呼ばれている。 XNUMXが失われると、がんを発症するリスクが高まる。 リンチ症候群は、ミスマッチ修復酵素であるMLH1、MSH2、MSH6、PMS2の異常が原因であることが知られている。 ミスマッチ修復酵素に異常があると、マイクロサテライトのコピーミスが起こりやすくなり、腫瘍組織と正常組織でマイクロサテライトの反復回数に違いが生じる。これをマイクロサテライト不安定性と呼び、リンチ症候群の90%以上で認められる。

染色糸、クロマチン chromatin　←→クロマチン免疫沈降：ChIP/アポトーシス 真核生物の細胞の核に存在するDNAとタンパク（ヒストンなど）の複合体、染色体を構成する物質 真核生物はその膨大なサイズのDNAを核内に収納するため、DNAを高度に折りたたまれている。 クロマチンには、大きく分類してユークロマチンとヘテロクロマチンの二種類がある。、 ユークロマチン　euchromatin クロマチン構造がゆるまっていて、転写されている遺伝子はこの部分に多く存在する。 ヘテロクロマチン　heterochromatin 密に凝集していて、この領域では転写はあまり起きない。 ヘテロクロマチンはさらにに次の二つに分類すされる。 構成的ヘテロクロマチン　constitutive heterochromatin 遺伝子の発現はほとんどみられない セントロメア付近にあり、この領域の DNA は繰り返し配列に富む。 条件的ヘテロクロマチン　facultative heterochromatin 条件によっては遺伝子の発現がみられる。

DNA二重らせん　DNA double helix 　←→ヘリカーゼ/トポイソメラーゼ James Dewey WatsonとFrancis Harry Compton Crickが1953年に分子模型を構築する手法を用いて提唱した。 WatsonとCrickはMaurice Hugh Frederick Wilkinsとともに1962年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。 二重らせんの主要な特徴 二重らせんは2本のポリヌクレオチド鎖から成る。 2本のポリヌクレオチドはそれぞれ方向が逆である（反平行である）。 二重らせんは、右巻きである。 塩基は二重らせんの内部に、リン酸基をもつバックボーンは外側に配向している。 一対の塩基は相補的な関係にあり、水素結合によって結ばれている。 二重らせんは約10塩基対で一回転する。 二重らせんには、主溝と副溝、がある。 主溝 major groove 二重らせんは完全に規則正しいらせんを描いているわけではないことをあらわしている。塩基の積み重なりと糖ーリン酸骨格のねじれの関係上、完全に規則正しい二重らせんから鎖がずれ、らせんには幅が異なる2種類の溝が存在する。大きなほうの溝を主溝、小さなほうの溝を副溝という。 タンパク質が塩基配列を読み取るのは主溝の部分である。 主溝の中では、塩基の水素結合以外の疎水的部分が水と接している。 副溝 minor groove DNA二重螺旋の小さな溝 いDAPIはDNA二重螺旋の副溝、特にAT（アデニン・チミン）に富んだ領域に優先的に結合する。 様々な二重らせん構造 A型DNA 右巻き、1回転あたり塩基数11 塩基対間距離2.6 Å、らせんの直径23 Å 湿度75%時にとる立体構造 B型DNA 生体内では最も一般的なDNAの構造 右巻き、1回転あたり塩基数10、塩基対間距離3.4 Å らせんの直径20 Å 湿度92%時にとる立体構造 Z型DNA 左巻き、1回転あたり塩基数12、塩基対間距離3.7 Å、らせんの直径18 Å グアニンとシトシンの繰り返し配列がとる立体構造

ヌクレオソーム nucleosome 染色体の最も基本的な構造 すべての真核生物に共通するクロマチンの基本的構成単位 ヌクレオソームは、4種のヒストン（H2A、H2B、H3、H4）から構成されるヒストン8量体に146 bpの2重鎖DNAが巻き付いた構造をとる。 2つのヌクレオソームをつなぐ部分のDNAはリンカーDNAと呼ばれる。 ヌクレオソームの構造を電子顕微鏡で観察すると、DNA鎖上にビーズが並んでいるように見える。 リンカーDNA　linker DNA ヌクレオソーム間に存在する、ヒストン八量体に巻き付いていない二本鎖DNA リンカーDNAにリンカーヒストン（ヒストンH1）が結合する。 リンカー linker DNA断片の端に付けて遺伝子操作しやすくするための短い合成DNA 2本鎖で制限酵素による切断部位を含むようにデザインする場合が多い。 リンカーペプチド VH鎖とVL鎖をつなぐリンカーペプチドを指す。 長さも5残基程度から20残基程度まで、また、水溶性を上げるためArgを導入したものなど様々なリンカーペプチドがデザインされているが、GSリンカーと呼ばれる（GGGGS）3が最も一般的なものである。 このリンカーの配列がscFvの構造、安定性に影響する場合があり、例えば5残基程度の短いリンカーを使用するとモノマーのscFvよりも、ダイマー（Diabodies）を形成しやすくなる。

ヌクレオシド nucleoside 塩基と糖が結合した化合物の一種 ヌクレオシドは五単糖の1位にプリン塩基またはピリミジン塩基がグリコシド結合したもの 塩基としては、アデニン、グアニンなどのプリン塩基、チミン、シトシン、ウラシルなどのピリミジン塩基、ニコチンアミド、ジメチルイソアロキサジンなどを含む。 代表的なヌクレオシド：アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジンなど このほか、ジメチルイソアロキサジンとリボースからなるヌクレオシドはビタミンB2として有名である。 ヌクレオチド nucleotide　→プリンヌクレオチド ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質 語源は“nucleo(核の)tide(結ばれた)”と言う意味であり、これをローマ字読みしたものである。英語では「ニュークリオタイド」と発音する。 DNAやRNAを構成する単位でもある。 ヌクレオチドが鎖のように連なりポリヌクレオチドになる。またアデノシン三リン酸はリン酸供与体としても機能し、加えてセカンドメッセンジャーの機能を持つcAMPなども知られる。 遺伝暗号のコドンでは、ヌクレオチド3個でアミノ酸一つをコードしている。 命名法 ヌクレオチドの名称は4文字の略号で表される。 1文字目は糖の種類がリボヌクレオチド（r：省略する場合もある）か、デオキシリボヌクレオチド (d) かを示す。 2文字目は次の塩基の種類を示す。 A: アデニン C: シトシン G: グアニン T: チミン（通常RNAには現れない） U: ウラシル（通常DNAには現れない） 最初の2文字でヌクレオシドの種類が決まる。 3文字目は結合するリン酸基の数 (mono 1：M、di 2：D、tri 3：T) 4文字目はリン酸塩 (P) であることを示す。 デオキシシチジン三リン酸 (deoxycytidine triphosphate) はdCTPと略される。 デオキシヌクレオチド三リン酸　Deoxynucleotide ；dNTP 　4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸 (dATP,　dCTP,　dGTP,　dTTP) を混合したものはdNTPと表記する。 ＝　モノヌクレオチド　mononucleotide ヌクレオシドリン酸　参考1 DNAもRNAもモノヌクレオチド単量体の重合によって作られる。 モノヌクレオチドはアミノ酸よりさらに重合しにくい。これは単量体をつなげているホスホジエステル結合が加水分解によってかなり大きな自由エネルギーを放出する性質があるからである（6kcal/mol）。これは核酸がゆっくりとではあるが自然に加水分解して、モノヌクレオチドになる傾向を持つことを示している。 ホスホジエステル結合　Phosphodiester bond 炭素原子の間がリン酸を介した2つのエステル結合によって強く共有結合している結合様式のこと 地球上のすべての生命に存在し、DNAやRNAの骨格を形成している。 （デオキシ）リボースの5'位の炭素原子と、他の（デオキシ）リボースの3'位の炭素原子の間を結合している。 リン酸基のpKa値は0に近いため、生体内の中性条件では負電荷をもつ。そのため二本鎖DNAでは相対するリン酸同士が反発力を示し、それがタンパク質（ヒストン）、金属イオン、そしてポリアミンによって中和されている。 ホスホジエステル結合を形成して新たなヌクレオチドを結合する際には、ヌクレオチドの三リン酸型もしくは二リン酸型が解裂することで、酵素反応を進行させるために必要なエネルギーが発生し、そのリン酸基がホスホジエステル結合を形成する ジヌクレオチド dinucleotide モノヌクレオチド2個がリン酸基部分で結合 NAD、FADなどの酸化還元補酵素がある。 　→CpGジヌクレオチド ポリヌクレオチド polynucleotide ヌクレオチドが直鎖状に重合した高分子化合物 天然には核酸があり、人工的に合成したものは核酸の基礎研究に用いられる。 ポリヌクレオチド鎖=DNAやRNAの糖・塩基・リン酸が１分子ずつ結合したヌクレオチドという構成単位が多数結合したもの DNAが２本鎖の螺旋状のポリヌクレオチド=DNAにはポリヌクレオチド鎖が2本ある RNAが１本鎖のポリヌクレオチド=RNAにはポリヌクレオチド鎖が１本ある。 オリゴヌクレオチド oligonucleotide　←→アンチセンスオリゴヌクレオチド 約20塩基対かそれ以下の長さの短いヌクレオチド（DNAまたはRNA）の配列 自動合成装置によって、160から200塩基対程度のオリゴヌクレオチドは自動的に合成できる。 ヌクレオチドは相補的なヌクレオチドと結合する性質があるので、オリゴヌクレオチドは相補的DNAまたはRNAを検出するプローブとして使われる。 そのほかのオリゴヌクレオチドを用いる実験手法としては、DNAマイクロアレイ、サザンブロッティング、FISH法、人工遺伝子の作成などがある。 DNAと相補的なオリゴヌクレオチドはPCRのプライマーとして盛んに使われる。 オリゴヌクレオチドの濃度決定凍結乾燥したサンプルを適当な量の bufferに溶かし、OD測定(at 260 nm)により濃度決定を行う。 光学濃度　Optical Density：OD ODを測定することで、溶液中のDNA/RNA量を定量することができる。 アンチセンスオリゴヌクレオチド antisense oligonucleotid：ASO　←→DNAアンチセンス鎖/オリゴヌクレオチド 標的配列に相補的な、一本鎖のDNAまたはRNA 特定の遺伝子発現を抑えるDNAあるいは、RNA アンチセンスRNAは、相補的なRNAと結合することにより、その翻訳を阻害する。アンチセンスDNAは特異的な配列を持つRNAの検出に用いられ、DNA/RNA対が形成された部分はリボヌクレアーゼHによって速やかに分解される。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸医薬の中で最も適応範囲が広いと考えられている。RNAのウイルスに対して使用したり、がん細胞のアポトーシス抑制遺伝子を抑制したりするといった臨床応用が考えられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞質内、核内のどちらでも効果を発揮することから、タンパク質に翻訳される遺伝子だけではなくmiRNAや長鎖非コードRNAの機能を抑制することも可能である。 S化オリゴDNA　＝ホスホロチオエートPhosphorothioate：PS ヌクレオチド間の結合部位にある全てのリン酸基をS化(硫黄化)したオリゴDNA 通常のヌクレオチド間の結合はホスホジエステル(phosphodiester)結合であるのに対し、このS化の結合はホスホロチオエート(phosphorothioate)結合と呼ばれる。 ホスホロチオエート核酸はリン酸ジエステル結合部分の酸素原子を1つ硫黄原子に置き換えたものでヌクレアーゼ耐性がある。標的配列をmRNAの翻訳開始部位付近などに設定し、立体障害やRNase Hによる切断による翻訳抑制に用いることができる。 S化オリゴDNAの骨格はほとんどのエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼの活性に耐性があり、この構造の安定性から、標的遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンスの実験に使用される。 問題点としては結合が天然の核酸よりも弱いこと、タンパク質との非特異的相互作用による細胞毒性が高い。リン原子が不斉になるため立体異性体の混合物になるということがあげられる。リン原子の立体配置によって二本鎖RNAの熱安定性やヌクレアーゼ耐性が大きく異なることが知られている。 モルフォリノアンチセンスオリゴ　←→アンチセンス法 RNA、DNAのリボース、デオキシリボースの代わりにモルフォリン環を持つオリゴヌクレオチド モルフォリノホスホロジアミデートはアンチセンスとしてよく用いられている核酸アナログであり、リボースの代わりにモルフォリン環、リン酸ジエステルの代わりに電荷のないホスホロジアミデート結合をもつ。 RNase H活性はないが、天然のDNA、RNAより結合が強くかつ特異性が高い。他に細胞毒性が低い、水溶性が高いという優れた特徴があり、細胞への導入法も確立している。 モルフォリノ環を付加したオリゴDNA、RNAに対する親和性が高く、DNA分解酵素に対して抵抗性があるため、生体内で安定である。 5′非翻訳領域、またはエキソンとイントロン境界領域に相同性をもつように設計すると、mRNAからの翻訳やスプライシングを抑制することで、標的遺伝子の発現を特異的に阻害できる。 主に翻訳阻害、pre-mRNAのスプライシング阻害、miRNAのノックダウンや成熟化阻害に用いられている 従来使用されているS-Oligoなどのアンチセンスの問題点（特異性，安定性，配列決定の難しさなど）を克服した、細胞毒性のない、第三世代のアンチセンス

2本鎖DNA /1本鎖DNA [2本鎖鋳型DNA] 5' 　鋳型DNAセンス鎖　　 3' 3' 鋳型DNAアンチセンス鎖 5' [1本鎖鋳型DNA] 5' 　鋳型DNAセンス鎖　　 3' ←リバースプライマー　5' 5'フォワードプライマー→　 3' 鋳型DNAアンチセンス鎖 5' センス鎖 sense strand↑ タンパク質をコードする。 アンチセンス鎖の逆鎖 リバースプライマーは、PCRでは熱変性後1本鎖となった鋳型センス鎖の3'側に識別し、アニーリングする。 アンチセンス鎖 antisense strand↑ 鋳型となるDNA DNAの2本鎖がほどけ、一方のDNA鎖を鋳型としてmRNAが合成される過程が「転写」であり、2本のDNAのうち、鋳型となるDNAは決まっており、鋳型となるDNAをアンチセンス鎖 センス鎖と相補的 フォワードプライマーはPCRでは熱変性後1本鎖となった鋳型アンチセンス鎖の3'側に識別し、アニーリングする。

岡崎フラグメント　Okazaki fragments 1968年に岡崎令治博士（1930/10/8〜1975/8/1、名古屋大学の分子生物学者、広島で被爆、白血病のため44歳の若さで他界）、恒子博士1933/6/7〜）らが発見した。 DNA複製時に、DNA二本鎖のうちの片方で生じる小さなDNA断片、ポリヌクレオチド断片 DNAの合成は常に5′末端から3′末端へとヌクレオチド鎖が伸長していく。したがって、DNAが複製するときに二本鎖の片方は、連続的に塩基が結合されるが、反対側の鎖は構造上それが不可能なので、真核生物では約100〜200ポリヌクレオチドの断片を作ってそれを結合して合成する。 DNA複製におけるラギング鎖の合成時にDNAプライマーゼによって形成される比較的短いDNA断片 ラギング鎖はDNA ligase Iによって連結されることで、DNA複製が行われる。 「DNAの不連続的複製モデル」を支持する研究成果は、1968年に行われたコールドスプリングハーバーシンポジウム (Replication of DNA in Microorganisms)において発表された。 リーディング鎖　leading chain 5’→3’方向に伸長するDNA鎖 複製フォークの移動と同一方向に重合が進むDNA鎖 複製フォークの進行方向と同じ方向の一本鎖で合成される鎖 ラギング鎖　lagging chain 3’→5’方向に伸長するDNA鎖 複製フォークの移動と逆方向に重合が進むDNA鎖 フォークの進行と逆向きに合成される鎖 複製フォーク　replication fork 二本鎖DNAの複製が進行する部位 二本鎖DNAの水素結合が解離してできるY字型の領域は、その形から"複製フォーク"と呼ばれる。 一本の親分子から二本の娘分子ができ、フォーク状に描くことができることからついた名称 リーディング鎖、ラギング鎖いずれの複製も、この領域で行われる。

DNA bending ???? 転写因子の結合によりDNA構造は変化する DNAルーピング、DNA looping 遺伝子DNAの高次構造変化 DNAがループ構造をとることにより、遠く離れた場所にあるエンハンサーとプロモーターが核内で接近することができる。 DNAのルーピングなどによってプロモーターに作用して 転写を促進する。 DNAルーピングのモデルでは、エンハンサーが二種類のプロモーターにランダムに結合・解放しては転写バーストを誘導することから、双方の遺伝子の転写バーストのパターンが入れ替わっていく関係になる。

Rループ R-loop 2本鎖DNAのうちの片方の鎖が1本鎖RNAと相補的な結合によってハイブリッドを形成し、もう片方のDNA鎖が1本鎖となる状態のことをいう。 DNA-RNAハイブリッドおよび関連する非鋳型1本鎖DNAからなる3本鎖核酸構造である。Rループは種々の状況で形成され、そして細胞成分によって許容され得るかまたは排除される。「Rループ」という用語は、これらの構造のDループに対する類似性を反映するために与えられた。「R」はRNA 部分の関与を表す。 Rループはクロマチンの状態を制御できるCpGアイランド領域に豊富に存在するDNA-RNAハイブリッド Rループは1976年に記載された。Rループ研究は、Richard J. Roberts（1943/9/6〜　イギリスの生化学者、分子生物学者）とPhillip A. Sharp（1944/6/6〜　アメリカ合衆国の遺伝学者、分子生物学者）の研究室から独立して報告され、アデノウイルス遺伝子をコードするタンパク質は、成熟mRNAが存在しないDNA配列を含むことを示した。1993年にRobertsとSharpは真核生物のイントロンの発見及び遺伝子組み換え技術の発見により、ノーベル生理学・医学賞を受賞した。 Rループの形成は、転写過程の結果として自然に生じる現象で、新生転写産物がDNA二本鎖に入り込むことが原因である。このような構造は、転写でまれに生じる副産物と見なさていて、引き離されたDNAコード鎖が脆弱になることから、ゲノムの完全性に対して有害となるだろうと考えられてきた。しかしヒト遺伝子のCpGアイランドを含むプロモーター領域でRループが広範に形成されることがわかってきて、Rループには有益な作用もある可能性が出てきた。 GADD45Aが直接Rループに結合し、TET1を動員することによって局所的なDNAの脱メチル化を仲介する。腫瘍抑制因子TCF21を研究することで、アンチセンスの長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）であるTARID（TCF21 antisense RNA inducing promoter demethylation）がTCF21プロモーターにおいてRループを形成するすることが判明した。このRループへのGADD45Aの結合により、局所でのDNA脱メチル化とTCF21の発現が開始した。TARIDの転写、Rループの形成、DNAの脱メチル化、およびTCF21の発現は、細胞周期中に連続して進行する。酸化DNAの脱メチル化中間産物はゲノムのRループに豊富に存在し、その量はRNase H1を除去した際に上昇した。ES細胞のゲノムプロファイリングから、CpGアイランド：CGIに数千のRループ依存性TET1結合部位が存在することが明らかになった。　参考

ホリデイ・ジャンクション Holliday junction, Holliday structure 相同組換えの中間体とされる２本のDNA鎖が相互に組み換わった構造 Robin Holliday（1932/11/6〜2014/4/9, 英国の分子生物学者）が1964年に提唱し、実際に存在も確認されている。 減数分裂や相同組み換えによるDNA修復の際には、ホリデイジャンクションと呼ばれるDNA四本鎖からなる中間体が生じる。この構造は2個のDNA分子が共有結合で結ばれたものなので、染色体が適切な分離と複製を行えるようにするには、この構造を解離させる必要がある。

ニック nick　←→ニッカーゼ/エンドデオキシリボヌクレアーゼ/Cas9 Nickase/開環状DNA 2本鎖DNAの一方の鎖の、隣接したヌクレオチド間のホスホジエステル結合が欠如している部分 二重鎖のある位置で、片側鎖のみ切れた状態

平滑末端 blunt end, flush end　←→平滑末端クローニング 組換えDNA実験で用いるDNAの末端構造に着目した用語で、DNA鎖の末端が、5'末端ヌクレオチドと3'末端ヌクレオチドのどちらもが突き出ることなく対になっている状態 平滑末端を作る酵素でDNA分子を切断するか、突き出た１本鎖部分を選択的に除去、または鋳型として部分的にDNA合成をさせて作る。

粘着末端 sticky end, cohesive end, staggered end　←→平滑末端 組換えDNA実験で用いるDNAの末端構造に着目した用語で、制限酵素で切断するなどして互いに相補的な配列がDNA鎖の5'末端または3'末端から突き出た状態




プロモーター promoter DNAにおける遺伝子の転写制御を行う領域 プロモーターに転写因子が結合して転写が始まる。 狭義：真核生物において、転写基本因子群とRNAポリメラーゼが結合するDNA領域：コアプロモーター 広義：転写調節因子群が結合する転写調節エレメントも含める。 転写の開始に関与する遺伝子の上流領域 プロモーターには、1つの転写開始点を決めるものと、複数の転写開始点を散在させるものの2つのタイプがある。 コンセンサス配列　consensus sequence　←→シャイン・ダルガノ配列/コザック配列　参考1/2 プロモーター領域には共通した塩基配列がある。この配列は転写が開始される最初のDNAの塩基から10塩基と35塩基手前にある。転写が開始される塩基対を 1とすると、これらの配列は-10と-35の領域に存在することになる。 この二つの配列にはコンセンサス配列（共通配列）がある。コンセンサス配列とは「他の生物のDNAを比較したときにだいたい似た配列をもち、同じ機能をもつ領域」のことである。-10領域の共通配列は「TATAAT」であり、-35領域の共通配列は「TGTTGACA」である。 -35ボックスと-10ボックス 真正細菌のプロモーターにはRNAポリメラーゼを強力に引き寄せる2つの仕組みがある。 －35領域 -35 region または-35配列 -35 sequence 転写開始点から35bp（35塩基対）上流 -10領域の共通配列は「TATAAT」 －10領域 -10 region または-10配列 10bp、より正確には-18〜-9上流の-10ボックス -10 box -35領域の共通配列は「TGTTGACA」 -10領域は発見者 David Pribnowの名前に因んで「Pribnow Box」ともいう。 2つは15〜19nt、例外的に長いもので20nt離れる。 -10領域と-35領域はセンス鎖に存在し、転写は鋳型鎖を参考にして転写される。 コアプロモーター core promoter　参考1 狭義のプロモーター 転写開始に必要最小限のDNA領域であり、転写開始点の前後の数十base pair (bp)程度の大きさである。 転写基本因子群とRNAポリメラーゼが結合するDNA領域 コアプロモーターの上流あるいは下流には様々な転写調節因子が結合して正負の転写制御が行われる転写調節エレメントが存在している。 転写開始点 Transcriptional Start Sites：TSS コアプロモーターの一部 TATAボックスの約25bp程度下流 RNAポリメラーゼは転写開始点を含む正しい位置に配置される。 原核細菌のプロモーターの転写開始点は90%以上の場合でプリン塩基である。CATという塩基配列の中央であることが比較的多いが、よく保存されているとは言い難い。 理研が開発した遺伝子解析技術の1つであるCAGE法は、少量のRNA試料からでも末端配列を決定でき、転写開始点を網羅的かつ1塩基レベルの正確さで解読できる。 オルターナティブ プロモーター alternative promoter プロモーターには、1つの転写開始点を決めるものと、複数の転写開始点を散在させるものの2つのタイプがある。 遺伝子が同じであっても、発現プロモーターは臓器ごとに異なっていて、時間的・空間的に異なる制御がかけられている。 生物種間比較ゲノムに基づいて予測される。 転写調節エレメント、転写調節シスエレメント cis-regulatory element　←→シスエレメント 転写にとって必要な塩基配列 プロモーター上流部の転写因子が結合する領域 基本エレメントと上流エレメントと、エンハンサーで構成される。 基本エレメントと上流エレメントが広義のプロモーター 基本エレメント、転写基本因子、基本転写因子 　general transcription factor：GTF,　basal transcription factor 広義のプロモーターの一部 転写開始点のごく近傍の上流に認められ、普遍的な転写因子が結合する。 ほとんどどの遺伝子に共通のもので、TATAボックス、CAATボックス、Sp1など TATAボックス　TATA box　←→TATAボックスを有するプロモーター ゴールドバーグ・ホグネスボックス（Goldberg-Hogness box）、 あるいはホグネスボックスとも呼ばれる。 Michael Goldberg とDavid Swenson Hognes（1925〜　米国の生化学者）がショウジョウバエの研究から1978年に発見した。 遺伝子の転写においてプロモーターとして機能し、その転写開始点を規定するDNA配列 真核生物及び古細菌の遺伝子において、RNAポリメラーゼIIによる転写開始位置の上流25塩基対の位置、あるいはさらに上流に存在する共通した塩基配列 チミン (T) と アデニン (A) が繰り返すことから命名された。 具体的な配列としては（5'-TATAA/TAA/TG-3'）などがある。 転写開始点の約25bp程度上流に存在する塩基配列（TATAA）であり、TFIIDのサブユニットの一つTBPによって認識される。 真核生物の場合、TATAボックスに基本転写因子のTFIIDが結合し、DNAの形を「ねじる」とされている。 CAATボックス TATAボックスのさらに上流 5'‐CCAAT‐3'の共通配列を持つ領域 GCボックス 5'‐GGCGGG‐3'の共通配列を持つ領域 Spファミリー転写因子　Sp-family (small protein family) transcription factor Spファミリー転写因子は、ヒト組織において広く発現され、多くの細胞プロセスの制御および細胞微小環境への応答に関与する。 認識配列は，5′-（G/T）GGGCGG（G/A）（G/A）（C/T）- 3′とされている。 SpファミリーはSp1〜8の8遺伝子からなる。 DNA結合領域である3つの保存されたジンクフィンガードメインをもつ。 Sp1とSp3がよく調べられている。 Sp1転写因子　Sp1 transcription factor Splはハウスキーピング遺伝子を始め、様々な遺伝子の転写を制御している。 薬物代謝酵素チトクロームP 450のCyp1a1遺伝子のプロモーター近傍に存在する構成的転写制御因子BTEに結合する。 Sp1ノックアウトマウスは胎生10日頃に死亡、Sp3ノックアウトマウスは、骨形成の遅れがみられ、出生後に死亡する。 Sp7転写因子 Sp7は骨形成に必須である。 転写基本因子群の多くはサブユニット構造をとる複合体である：TBPとTAF TATA結合タンパク質 TATA-binding protein：TBP TATAボックスに結合する基本転写因子 TATAボックス認識に貢献するだけではなく、TATAレスプロモーターからの転写、さらには、クラスIプロモーターおよび、クラスIIIプロモーターからの転写にも必要であることが明らかにされており、真核細胞における転写制御において必須な役割を果たしている。 様々なTBPに関連した因子とともにRNAポリメラーゼII転写開始前複合体を作り上げる基本転写因子であるTFIIDを作り上げる。 TBP関連因子、TBP随伴因子 TBP-associated factor：TAF TBP以外のTFIID構成タンパク質 原核生物ではRNAポリメラーゼ単独で基本的な転写を行うことができるが、真核生物では転写基本因子群も必要である。 RNAポリメラーゼIIと共にコアプロモーター上に転写開始複合体を形成することで、RNAポリメラーゼIIに正確な位置（転写開始点）から転写を開始させる役割を果たしている。 RNAポリメラーゼI, II, IIIのそれぞれの系にはたらく転写基本因子があり、RNAポリメラーゼIIの系では、TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIHが知られている。 TFIIA TFIIDのDNAへの結合を助ける。 TFIIB　←→TF IIB認識エレメント 転写開始点の決定に直接機能する。 RNAポリメラーゼII特異的な基本転写因子の1種 TFIID転写因子　TFIID transcription factors, transcription factor for polymerase II：TFIID 転写開始の引き金となる、最も重要な転写基本因子 TATA結合タンパク質：TBPと13個のTBP随伴因子：TAFから構成され、プロモーターでの転写開始前複合体：PIC組み立ての際の核となることで、RNAポリメラーゼIIに依存する転写開始に中心的な役割を担っている。 TFIIE THIIHの機能を制御・プロモータークリアランスに関与 TFIIF RNAポリメラーゼをプロモーターへ連れてくる TFIIH プロモーターのDNA二重らせんをほどく プロモータークリアランスにも関与 TFIIJ 上流エレメント、上流制御配列、 上流プロモーターエレメント upstream promoter element：UPE 広義のプロモーターの一部 基本エレメントの上流にある調節エレメントの一部 転写開始に関与するほかの転写因子が結合する。 遺伝子によって かなり異なることから、細胞組織特異的な転写、あるいは、例えばcAMPを二次メッセンジャーとするような刺激や、ステロイドホルモンに対する応答などの遺伝子発現の誘導過程に関与している。 →エンハンサー エンハンサーの定義はあいまい 必ずしも上流になくともよい。イントロン中にあっても、下流にあっても働く。 逆向きに存在しても働く。 転写効率を10倍から100倍も上昇させる などといった、 プロモーターにはない特徴がある。 TATAボックスを有するプロモーター TATAボックスを有するプロモーターでは転写制御が厳格かつ劇的に行われる傾向が高いのに対して、TATAレスプロモーターには恒常的な活性を示すものが多い。 クラスIIプロモーターにおいて、TATAボックスを有するプロモーターは多くない（ヒトでは約30%）。 TATAレスプロモーター TATA-less promoters TATAボックスを持たないプロモーター イニシエーターと下流プロモーター配列 を有するTATAレスプロモーターであり、GCボックスを有することも多い。 ハウスキーピング遺伝子に多く見られ、複数の転写開始点を持つことも多い。 最小プロモーター minimal promoter 遺伝子の転写開始に必要なTATA boxを含む最小プロモーター 真核生物のプロモーター クラスIプロモーター class I promoter クラスIプロモーターがコードするのはリボソームRNA：rRNA前駆体のみ 例外として、トリパノソーマという原核生物で発見された2種類の遺伝子はRNAポリメラーゼIによりタンパク質を発現する。そのため、1つのゲノムに何百とあるがその配列は全く同じ。しかし、生物種ごとの多様性は、配列要素をいくつも持つクラスIIプロモーターよりはるかに大きい。保存された配列は転写開始部位を囲むATが豊富なるイニシエーター： initiator：rINR だけしか確認されていない。 RNAポリメラーゼIが働き、rRNAが転写される。 トリパノソーマ　trypanosoma トリパノソーマ科に属する原生生物で、幅広い宿主に感染し、アフリカ睡眠病をはじめとするさまざまな病気（総称してトリパノソーマ症）を引き起こす。 名はギリシャ語で、τρυπανον「錐」+ σωμα「体」という意味で、コルク抜きのような形状・動きに由来する。 クラスIIプロモーター class II promoter クラスIIプロモーターは2つの配列から構成されている。 RNAポリメラーゼIIが働き、mRNAが転写される。 コアプロモーター 約40〜60bp 以下に細分化されている。 -33位を中心に存在するTATAボックス クラスIIプロモーターにおいて、TATAボックスを有するプロモーターは多くない（ヒトでは約30%）。 TF IIB認識エレメント ：TF IIB recognition element：BRE TATAボックスのすぐ上流 重要な基本転写因子であるTFIIBが結合するためのプロモーター配列 共通配列は(G/C)(G/C)(G/A)CGCCで 転写開始部位を中心とするイニシエーター 下流プロモーターエレメント downstream promoter element：DPE るイニシエーターのさらに下流 DPEはTATAボックスが欠損したとき、その機能を補う。 DPEはさらに細分化される。 同名のDPE 下流コア配列 downstream core element：DCE モチーフ10配列 motif ten element：MTE コアプロモーターーは基本転写因子と結合し、RNAポリメラーゼに与える。 上流エレメント 転写開始に関与するほかの転写因子が結合する。 RNAポリメラーゼIIは伝令RNA（ｍRNA）前駆体のヘテロ核RNA（hnRNA）と少数の核内低分子RNA（snRNA）を転写する。 クラスIIIプロモーター class III promoter クラスIIIプロモーターは転写開始の過程をその構造により3つに分ける。 RNAポリメラーゼIIIが働き、tRNAを中心とする低分子RNAが転写される。 I型クラスIIIプロモーター 5S rRNA を発現するプロモーターである。最大の特徴は遺伝子の内部で働くことだろう。 Donald Brown はケニアツメガエル Xenopus borealis の5S rRNA遺伝子から世界で初めてクラスIIIプロモーターを解析したが、その結果は50〜83位上流に存在するという驚くべきものだった。上流から欠失させていくと+55位まで、下流からなら+80位まで転写は影響を受けない。しかし、これを踏み越えると転写は全く起きなくなるのだ。このプロモーターはRNAポリメラーゼIを自身の上流から転写を始めさせる。 Robert Roeder らがボックスA box A、中間エレメント intermediate element、ボックスC box C というI型プロモーターの3領域を発見した。 ボックスAは基本転写因子のTF IIIAと、ボックスCはTF IIICと結合する。これには順番があり、まずTF IIIAから続いてTF IIICが来る。これらは構築因子と言われ、2つがそろうと転写開始点にTF IIIBが結合して転写は始まる。 II型クラスIIIプロモーター tRNAやVA RNAなどの遺伝子といった、ほとんどのクラスIIIプロモーターに該当する。I型同様遺伝子の内部に存在する。I型の同名領域と酷似するボックスAとボックスB box B を持つ。2つの距離はまちまちだが、普通あまり短すぎると機能を失う。 AボックスにTF IIICが結合することでTF IIIBが転写開始点に結合する。 III型クラスIIIプロモーター ほかの2つと異なり、III型は遺伝子上流にある。ヒト7SK RNAやヒトU6 RNAなどの核内低分子RNA(snRNA)を発現させる。 1985年にElisabetta UlluとAlan Weiner が7SL RNA遺伝子から発見したが、そのときの実験では、この領域の除去は転写効率を50〜100分の1まで低下させた。ただし、まったく転写されなくなるわけではないので、内部にII型プロモーターも含んでいると考えられる。このことから、ヒトゲノムにおいて何百もある7SL RNA偽遺伝子やそれに関連するAlu配列はあまり転写されない理由が考え出された。これらには高頻度の転写に必要なIII型プロモーターがないのだろう。 III型プロモーターだけを持つ一つの例は7SK RNA遺伝子である。この事実に気づいたMarialuisa Melli らは、-37位から下流なら欠損させても転写のレベルを維持できることを証明した。この遺伝子をはじめ、U6 RNA遺伝子やEBER2遺伝子などはII型プロモーター同様にTATAボックスを持つという特徴がある。実は、TATA結合タンパク質(TBP)はクラスIIプロモーターだけでなく、クラスIとクラスIIIの転写にも関与する。ほかにオクタマー octamer、近位配列因子 proximal sequence element：PSE と呼ばれる配列を含む。転写開始はTATAボックスだけを含む短い領域で行われるが、2つの配列が加わると転写効率は劇的に増す。 誘導性プロモーター inducible promoter 人為的に発現をコントロールできるプロモーター 大腸菌 lac promoter （IPTGで誘導） ラクトースオペロンの広義のプロモーター イソプロピル-1-チオ-β-ガラクトシド (IPTG) 等の存在下でlacZ αとMCSに挿入された配列を転写する。 →lacZ α cspA プロモーター (コールドショックで誘導） araBAD プロモーター （アラビノースで誘導） 真核生物 metallothioneinプロモーター（重金属イオンで誘導） heat shock protein プロモーター （ヒートショックで誘導） Tet-ON系/Tet-OFF系（テトラサイクリンで誘導／抑制） ステロイド応答性プロモーター（ステロイドホルモンやそのアゴニストで誘導） Cumate 従来の誘導系と比較して、バックグラウンド発現のリークが非常に少ない誘導発現系 CMVプロモーター　←→CMV前初期エンハンサー/サイトメガロウイルス 最も広く使用されているプロモーター 大部分の細胞において非常に強力な遺伝子プロモーターとして働くが、ヒトおよびマウスの幹細胞においては活性が弱い。 EF1α 強力な発現プロモーターで、幹細胞において高い効率を示す。 長期培養後も発現が安定。 マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター　phosphoglycerate kinase promoter：PGK 中程度の発現プロモーター 幹細胞において最も高い効率を示し、未分化幹細胞の長期培養において安定した活性を維持 CAGGSプロモーター　←→pCAGGSベクター CMV前初期エンハンサー、CBAプロモーター、CBAイントロン1／エクソン1 から構成されるハイブリッドプロモーターで、メチル化の影響を受けない強力な発現プロモーター プロモーターのサイズが大きく、最大インサートサイズは 2 kb CBAプロモーター　CBA promoter Chicken beta-actin プロモーター CAG プロモーター　CAG promoter ß　←→pCAGGSベクター/ROSA26 locus/Creドライバーマウス 宮崎 純一教授（阪大）が開発したプロモーター CMV・エンハンサーとchicken beta-actinプロモーターのハイブリッド（キメラ）プロモーター得ら C：the Cytomegalovirus (CMV) early enhancer element A：the promoter, the first exon and the first intron of chicken beta-actin gene G：the splice acceptor of the rabbit beta-globin gene 　　beta-actinプロモーターの下流に挿入されているbeta-globinのイントロン 得られた合成要素はpCAGGS 発現ベクターで使用される。 コンストラクト全体は一般に「CAGプロモーター」と呼ばれまるが、転写された配列の一部（2つのエクソン（？）とイントロン）およびエンハンサー要素が含まれるため、厳密な意味でのプロモーターではない。 CMV即時初期エンハンサーに加えて、ニワトリベータアクチン遺伝子のイントロンにはエンハンサー要素が含まれていて、脊椎動物の間で高度に保存されている。 プロモーターの3 '部分はGC含量が高いため、PCR増幅に抵抗性がある。 pCAG-EGxxFPプラスミドはEGFPフラグメントの間で多くのマルチクローニングサイト（BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI, EcoRV）がある。

イニシエーター initiator、Inr配列 転写開始点のごく近く（約1塩基分上流付近）にあるのが特徴の、真核生物のコアプロモーターの一部である。 RNAポリメラーゼⅡによる転写を高効率とする働きを持つ。 高効率の転写に必要な、開始部位周辺の-3〜+5位に存在する保存配列 哺乳類の共通配列はPyPyAN(T/A)PyPyで、ショウジョウバエはTCA(G/T)T(T/C)だ。ここでPyはピリミジン塩基（CまたはT）、Nは不特定、そしてAが転写開始点を示す。 ただし、全てのコアプロモーターに存在するわけではない。 イニシエーターは上流プロモーターエレメントやエンハンサーによる影響を受けやすい。 この例として、末端デオキシヌクレチドトランスフェラーゼ：TdT遺伝子が挙げられる。これはTリンパ球およびBリンパ球の発現のために活性化される遺伝子である。 イニシエーターは個体によって異なる配列を持つが、種といった所属によって共通する配列（コンセンサス配列）がある。

ターミネーター terminator 遺伝子の転写を終結させる領域 ターミネーターは4種のジデオキシヌクレオチド (ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP) のうちそれぞれ1種類だけを用いる。　←→サンガー法

エンハンサー enhancer 遺伝子の転写を活性化する際に必要なDNA領域 位置や方向に依存せず、長距離からでも転写を活性化できるDNAの領域 エンハンサーは転写基本因子と結合することで遺伝子の転写量を大幅に増大（enhance）させることから、エンハンサーと命名された。 真核生物DNA上の塩基配列領域を区分する名称で、遺伝子調節タンパク質（転写基本因子）と結合することで遺伝子の発現を調節している。 真核生物においてはプロモーターとは離れて存在することも多い。 1981年、アカゲザルのポリオーマウイルスSV40の初期遺伝子の上流に位置する72塩基の反復配列を欠失させると、初期遺伝子の転写量が著しく低下することが見出された。また、この配列を他の遺伝子と連結すると、その遺伝子の転写量が増加することも見出され、そのような機能をもつ配列をエンハンサーと呼ぶようになった。 その後、1983年にマウス免疫グロブリン遺伝子においてもエンハンサーが報告され、様々なウイルスおよび真核生物の遺伝子でもエンハンサーが同定されている。 細胞種に特異的なエンハンサーによる遺伝子の発現制御は、細胞のアイデンティティが決定されたり、さまざまな疾患において細胞の特性の脱制御が起こったりする過程において中心的な役割をはたす。 サイトメガロウイルス前初期エンハンサー　CMV immediate-early enhancer：CMV-IE エンハンサー 　←→CMVプロモーター/pCAGGSベクター サイトメガロウイルス：CMV DNAがループ構造をとることにより、遠く離れた場所にあるエンハンサーとプロモーターが核内で接近することができる：DNAルーピング スーパーエンハンサー　参考1 スーパーエンハンサーは、転写因子、メディエーター複合体、クロマチン調節因子が密に結合する大きなエンハンサーで、細胞同一性や疾患に関連する遺伝子の高発現をもたらす。 Richard Youngが最初に呼び、Youngの研究室からスーパーエンハンサーが大きな複合体を形成して広いゲノム領域を1箇所に集めるときの化学的メカニズムも解析された。 「スーパーエンハンサー」という用語は、ChIPシーケンス：ChIP-seqによって明らかになった、ゲノム上で近接して存在し、極めて多数のメディエーターが結合しているとみられるエンハンサーの集団を指すために用いられてきた。 従来の典型的なエンハンサーが細胞種あたり1万ほどなのに対し、スーパーエンハンサーはおのおのの細胞種において200〜600ほど同定され、これらは細胞の種類や機能に関係する重要な遺伝子の近傍に見い出された。 スーパーエンハンサーにおいては疾患に関連したゲノム多型が多く見い出され，がん遺伝子の活性化に関連することも報告されている。 Locus Control Region：LCR 遺伝子座制御領域 強力なエンハンサーの集合体

メディエーター　mediator：MED メディエーターは、転写開始領域から遠く離れたエンハンサーDNAと転写マシーナリーを直接繋ぐことによって、真核生物のほとんどすべての遺伝子に活性化シグナルを伝える、重要な転写コファクターである。 メディエーターは、RNAポリメラーゼIIを含む基本転写因子やエンハンサーの転写因子などと相互作用して、転写のコアクチベーターとしてはたらく巨大複合体である。

サイレンサー silencer 遺伝子の発現抑制を担っているDNA領域

スペーサー　spacer 構造遺伝子間をつなぐDNA配列 細菌では１つの転写単位を形成するオペロンにある構造遺伝子間の配列、真核生物ではリボソームRNA遺伝子、ヒストン遺伝子、転移RNA遺伝子などの反復DNA配列での各遺伝子間の配列

オペレーター operator 構造遺伝子に隣接し、構造遺伝子のmRNA合成を制御する塩基配列 プロモーター近傍にある、リプレッサーの結合領域 オペレーターにリプレッサーが結合したり脱離することにより転写が調節される。

オペロン Operon　→ラクトースオペロン、テトラサイクリン耐性オペロン、traオペロン 原核生物の遺伝子の制御単位 一つの転写因子によって同時に発現が制御される複数の遺伝子が存在するゲノム上の領域、あるいはその複数の遺伝子群 オペロンには、タンパク質をコードした構造遺伝子群と、構造遺伝子の発現を制御する 調節遺伝子がある。 あるオペレーターを含む調節遺伝子群と、調節遺伝子の一つのオペレーターによって調節を受ける構造遺伝子群 フランソワ・ジャコブとジャック・モノーが発現制御機構の概念としてオペロンの存在を示唆した。彼らは大腸菌を用いた遺伝学的解析を通して、ラクトース代謝系の構造遺伝子群とその発現を制御する塩基配列部分とを合わせて一つの単位と考え、このような単位をオペロンと呼んだ。Jacques MonodはFrançois Jacob↓、André Michel Lwoffと共に1965年、ノーベル生理学医学賞を受賞した。 ラクトースオペロン lactose operon　→ラックプロモーター/ラックリプレッサー /ラックオペレーター ラクトース （乳糖 lactose ）分解に関与する一連の遺伝子の集合オペロンで、プロモーターとオペレーターにより 転写が支配されている。lac オペロン lac operon とも表記する。 1961年のフランソワ・ジャコブとジャック・モノーによる大腸菌のラクトースオペロンに関する研究と、その際に提唱されたオペロン説は、遺伝子発現の調節に関する研究の大きな転換点となった。 ラクトースオペロンはlacZYAともいわれるが、これはラクトースオペロンがラクトース代謝系の3つの構造遺伝子lacZ、lacY、lacAから構成されているためである。 転写頻度を決定する調節遺伝子はlacP（プロモーター配列）、lacO（オペレーター配列）とプロモーター上流に存在するCAP結合部位の三つである。 　 　 　 ┌　　　　　 　　lac operon　 　　　　　　　　　　┐ =　 lacI =　 プロモーター オペレーター　= lacZ lacY lacA = └　　構造遺伝子　　┘ ラックリプレッサー lactose repressor：LacI ラクトースオペロンのリプレッサー lacI遺伝子にコードされていて、オペレーター配列に結合する。 遺伝子が転写されないように、負の制御 negative control を行う。 38 kDaの同じポリペプチドからなる四量体で、機能的には2つの二量体である。構成単位の単量体については、1〜59番のアミノ酸はヘッドピース headpiece と呼ばれるDNA結合ドメインであり、残りの部分はコアという。ヘッドピースはトリプシン消化で切り離すことができる。 LacIはプロモーターの下流すぐにあるlac オペレーター operator (lacO)に結合する。オペレーターには主力と補助が存在し、2つのサブユニットが同時に結合することでDNAをより強力に捉える。抑制がより効果的なものにする。 イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside：IPTG　←→ブルーホワイトスクリーニング IPTGの化合物はアロラクトースの類似体として用いられ、ラクトースオペロンの転写を誘導する試薬 アロラクトースとは異なり、生体内では硫黄原子の部分で分解されないため、ラクトースオペロンは常に誘導された状態となる。 IPTGはラックリプレッサーに結合してその働きを阻害し、ラクトースを分解するβ-ガラクトシダーゼの発現を誘導する。 クローニングにおいては、lacZ遺伝子の部分に目的の遺伝子が導入され、IPTGはその遺伝子の発現を誘導することになる。 traオペロン　Transfer operon, tra operon, or tra genes グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方において遺伝物質の非性的転移に必要な遺伝子群 tra遺伝子座はpilin遺伝子、細胞表面のpiliを形成する調節遺伝子、F-bacteriaの表面を攻撃し、接合を開始する高分子タンパクを含む。 プラスミドゲノムのtra領域の存在はDavid H. Figurskiと Donald R. Helinskiによって1979年に発見された。 （性）線毛、繊毛 pilus, pili（複数形）、sex pili＝ fimbria（複数形 fimbriae）　←→繊毛　cilia 細菌の細胞外構造体で、タンパク質が重合して繊維状となるもので、鞭毛以外を指す。 多くの細菌の表面に見られる毛の様な付属物である。細菌の接合の際に使われる。 プラスミド性線毛には、それぞれF因子、R因子によってコードされているF線毛、R線毛などがある。 Fプラスミドを持つ菌は性線毛を持つオスの菌と言われる。Fプラスミドを持たない菌はメスである。オスの菌は性線毛を利用してDNAをメスに注入する。この現象を接合 conjugationと呼ぶ。 多量体化したピリンというタンパク質から構成される。 性線毛はピリンが右巻きらせん状に集まった中空の繊維で、染色体にコードされている普通線毛と、プラスミドに支配されているプラスミド性線毛がある。 接合に関わる性線毛はある細菌と、同種のまたは異種の細菌の細胞膜同士を架橋する。これによって細胞間でプラスミドの移動が可能となる。交換されたプラスミドは、細菌の中で例えば抗生物質耐性など新しい形質を発現する。 ピリン pilin　＝フィンブリリン　fimbrillin 細菌の繊毛piliを構成するたんぱく質 分子量約１.７万

レギュロン regulon 共通の転写因子あるいは共通の転写制御メカニズムによって制御される遺伝子の一群 近接して転写制御を受ける遺伝子の一群をオペロンと呼ぶが，レギュロン遺伝子群は必ずしも同じ染色体上にあるわけではない。

マルチクローニングサイト　Multiple Cloning Sites：MCS 様々な制限酵素に認識される塩基配列が（複数）存在する部位 マルチクローニングサイトを該当する制限酵素で切断し、外来のDNA配列を挿入することができる。 の役割を持たせることができ、外部のDNAを挿入しやすくするはたらきがある。 lacZ領域にもマルチクローニングサイトが存在する。

Internal Ribosome Entry Site：IRES 内部リボソーム導入部位 通常のタンパク質翻訳はmRNA の5′側cap構造を認識して開始されるが、IRESがあるとcap構造なしにリボソームに認識されて翻訳が開始される。 多くの遺伝子改変マウス作製に利用され，目的遺伝子のstop コドンの下流、polyAシグナルの上流にIRESを介して任意の遺伝子を挿入することで、1つのmRNAから2つのタンパク質を発現できる。

キャップ cap, cap structure　←→CAGE法 リボソーム結合部位　ribosomal binding site：RBS 真核生物はキャップ結合タンパク質を介してリボソームと結合する。 RNAが受けるプロセシングの一つで、５’末端塩基の三リン酸にメチルGTPが５’−５’向きに結合した構造 RNAの５’末端を保護するための構造と考えられている。 キャップ構造はmRNAの安定性の向上、エキソヌクレアーゼからの分解の保護、翻訳開始複合体の形成促進をおこなう。一部の原核生物のmRNAは5′末端キャップ構造を付加することで、真核生物の無細胞タンパク質合成系で翻訳できる。真核生物のRNAの一部ではスプライシングにキャップ構造を必要とすることが報告されている。 伝令RNAの末端にある「キャップ」は3つの段階を経て付加され、その各段階の反応はそれぞれ別々の酵素によって行われる。 できたばかりの伝令RNAは末端に3つのリン酸があるが、ここからリン酸を1つ除去する反応が最初の段階で行われる。 2つ目の酵素が新たにできた2つのリン酸を持つ末端にGMPを付加し、3つのリン酸を持ち通常とは逆方向に配置された珍しい結合を作る。 3つ目の酵素がグアニン塩基をメチル化し、更に認識されやすくする。驚くべきことに、これら3種類の酵素は RNAポリメラーゼ が持つ長いリン酸化された尾部につながっており、新たな伝令RNAが作られるとすぐにきっちり正確な場所に修飾を加えることができるよう待機させられている。

コザック配列 Kozak sequence　←→シャイン・ダルガノ配列/コンセンサス配列　参考1 真核生物のmRNAに出現する共通配列であり、主に翻訳の開始に関与している。 Marilyn S. Kozak（1943/7/8〜 米国の微生物学者、生化学者）が発見した。 ただし厳密な共通配列ではなく、不一致であることも非常に多い。 脊椎動物では(gcc)gccRccAUGGと表され、なかでも開始コドン(AUG)の3塩基上流のR（プリン塩基・アデニンまたはグアニン）と開始コドンの次のGが重要な役割を果たすと考えられている。 コンセンサス配列は　GCC RCC ATG G ただしR = A or G (puRineの略)。この３つ前のRは必須。ATG (開始コドン)直後のGも重要とされる。 リボソームが翻訳を始めるためにはコザック配列（不一致のあるものも含む）が必要であり、リボソームによって認識された部位からタンパク質の翻訳が開始される。 コザック配列は、リボソーム結合部位であるmRNAの5'キャップや、内部リボソーム導入部位：IRESとは異なるので混同しないこと。 コザック配列は原核生物のシャイン・ダルガノ配列に相当する。




リプレッサー repressor　←→ラックリプレッサー/repressor-typeのbHLH因子/Tet-offシステム DNAのプロモーター近傍に位置するオペレーターに結合して遺伝子の発現を抑えるタンパク質性の転写調節因子 プロモーターやオペレーターが転写に関わるシス因子であるのに対し、リプレッサーはトランス因子である。

コリプレッサー　corepressor 転写を抑制する転写制御因子 リプレッサーと協調的に働き抑制調節に関与するもの。 リプレッサーと結合してリプレッサーを活性化してオペレーターに結合できるようにし、転写できなくなるようにする低分子化合物 転写コリプレッサー複合体　Transcriptional co-repressor complex 核内受容体やAP-1などの多くの転写因子と共役することによりヒストン脱アセチル化酵素を標的遺伝子プロモーター上にリクルートして転写を抑制する活性をもつタンパク質複合体．SANTドメインをもつN-CoR/SMRTを始めとして，WD40リピートを有するTBL1などが複合体に含まれる。 核内コリプレッサー 核内受容体は、リガンドが結合することによって、これらのコリプレッサーから分離され、転写活性が促進される。 コリプレッサーには、甲状腺機能低下症（＝甲状腺ホルモン受容体がNcoR1やSMRTに結合し続けていてリガンドが結合しない）のように、疾患の原因として重要なものがある。 nuclear-receptor corepressor：NcoR1 NcoR2　＝SMRT：silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptors：SMRT Groucho/Transducin -Like Enhancer of split (TLE) 転写因子と結合することによりその転写活性化能を抑制する転写補助因子である。 脊椎動物には複数のGroucho/TLEが存在し、様々な転写因子とそれぞれ特異的に相互作用することが知られている。

アクチベーター　転写調節因子　activator プロモーター上流のアクチベーター結合領域に結合し、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合するのを促進させる因子 トランスアクチベーター transactivator 遺伝子発現を活性化する要因のうち、遺伝子自身と同じ部位に存在するシスエレメントに対して、活性化タンパクなど他の遺伝子産物に対して用いられる総称

インデューサー　転写調節因子　inducer DNAからリプレッサーを引き離し 、 負の制御を解除するタンパク質 リプレッサーに結合し立体構造変化を起こさせ、オペレーターからリプレッサーを取り除く因子 ラクトースオペロンでは、ラクトースだけでなく、ラクトースの代謝産物であるグルコースもインデューサーとして機能する。




プラスミド plasmid ＝核外遺伝子　→プラスミドベクター　参考1/ 1952年にJoshua Lederberg（1925年〜2008、アメリカの分子生物学者、1958年度ノーベル生理学医学賞受賞）によって提案された。 細菌や酵母の細胞内に存在し、染色体DNAとは別の自己増殖性のDNAの総称で、染色体とは別に環状二本鎖DNAとして存在している。 細胞内にある染色体とは別個に増殖し、次の世代に伝達される遺伝因子 細胞内で複製され、娘細胞に分配される染色体以外のDNA分子の総称 細菌や酵母の細胞質内に存在し、染色体のDNAとは独立して自律的に複製を行う。一般に環状2本鎖構造をとる大腸菌などの細菌や酵母の核外に存在し、細胞分裂によって娘細胞へ引き継がれるDNA分子の総称 複製開始点など遺伝に必要な仕組みを備えた小型（1〜200kbp）の環状二本鎖DNAである。細菌中で自立増殖が可能で、染色体DNAとは独立に複製される。細胞内に１〜数10個（クローニングに用いられるものは細胞内にふつう10〜200個）存在できる。 プラスミドには、薬剤に対する耐性を示すタンパク質の遺伝子を持つものや細菌の接合を起こし他の細菌を形質転換させるものなど、さまざまな役割を持つものがある。組換え体作成のためのマーカー遺伝子としても利用される。 天然のプラスミドは制限酵素部位が多すぎるため、人工的に改変されたものが用いられる。 遺伝子工学分野においては、遺伝子組み換えのために用いられる。様々な人工的な改変がなされた数 kbpのプラスミドが研究用キットとして市販されている。 プラスミドは独立した遺伝子複製機構から、遺伝子組み換え操作のベクターとして利用されている。 大腸菌を用いた遺伝子のクローニングでは、まずプラスミドを回収し制限酵素で切断する。 プラスミドと同じ制限酵素で切断した、増幅させたいDNAをDNAリガーゼでプラスミドに結合する。 このプラスミドを大腸菌に導入し、大腸菌の大量培養により目的のDNAを増幅する。 またアグロバクテリウム（土壌菌の一種）が持つプラスミドは自分でプラスミドを切断し、植物のゲノム上に遺伝子を導入する性質があり、植物の遺伝子導入において頻繁に利用されている。 エピソーム episome 細胞が本来もっている染色体とは別に、比較的短い環状DNAが独立した染色体として安定的に維持されたもの プラスミドの状態と、ゲノムに組み込まれた状態の両方を取りうるDNA 独立して存在することも、染色体に組み込まれることもできるプラスミド。いずれの状態でも大腸菌のそれは接合において個体間を移動する。供与菌のF因子がプラスミド型の場合、それを移し、F-（受容菌）はF（供与菌）へと変わる。組み込まれている場合、染色体の一部または全てが伝達される。 すべてのヘルペスウイルスは自然宿主に潜伏感染を成立させるが、いずれもエピソームの形態をととると考えられている。 B細胞に潜伏するEBV（EBウイルス　Epstein-Barr virus）場合、B細胞の分裂に伴ってエピソームは娘細胞に分配される。 大腸菌のF因子のように細胞質内に存在し、遊離の状態と染色体図に組込まれた状態の二つの状態をとることのできる因子をエピソームと呼び、エピソームにはF因子のほか、薬剤抵抗性を支配する R因子などもある。 細菌の接合Fプラスミド、抗生物質に対する耐性を宿主にもたらすRプラスミドなどがその主要機能とされている。 プラスミド性線毛には、それぞれF因子、R因子によってコードされているF線毛、R線毛などがある。 薬剤耐性プラスミド　Rプラスミド　R plasmid、R因子；Resistance factor　←→薬剤耐性遺伝子 主にグラム陰性菌の薬剤耐性の原因であり、多くの場合、トランスポゾンとしてプラスミド間や染色体・プラスミド間で転移を繰り返す。 Fプラスミド、接合プラスミド、稔性プラスミド　fertility plasmid、F plasmid F因子、Fertility factor 大腸菌の接合性を決定する働きを持つプラスミド 厳密なコピー数制御機構を持つ。 F因子における接合伝達の過程 両菌が接合橋（一時的な細胞融合）によってつながる。 細菌細胞が接合するとそれが引き金となってFプラスミドDNAのtraオペロン上の一方の鎖の定点にニックが入り、Fプラスミドの相補鎖が複製をはじめる。 それと同時に供与菌から5′末端を先頭に受容菌へ接合橋を通じて移動する。 受容菌内においてDNAポリメラーゼにより相補的な鎖が作られ、供与菌と受容菌が離れ受容菌にもFプラスミドが作られ、受容菌が供与菌に転換される。 供与菌、雄菌、F+、donor 染色体DNA（Chromosomal DNA）とFプラスミドを持つ菌である。 供与菌は性線毛を利用してDNAを受容菌に注入する。 Fプラスミドは接合伝達時に使用されるoriTから一方向性にDNA複製をしながら、DNA 鎖が受容菌に入る。全部入ってしまうと、受容菌は供与菌になってしまう。 受容菌、雌菌、F-、recipient 染色体DNAを持つが、受容菌はFプラスミドを持たない菌である。 接合伝達時に供与菌からF因子を受けて、供与菌となる。 接合　conjugation、fertility、　←→形質転換、形質導入 接合においてDNA複製が利用される。 接合とは細菌の生殖様式の一つで、一つの個体（供与菌）が別の個体（受容菌）に自身の（染色体やプラスミドの）DNAを移動させることである。 その典型例は大腸菌のエピソームであるF因子（Fプラスミド）の仲介で起こる。供与菌がF因子を受容菌に移す。 接合ではF因子（とそれと地続きの染色体）の巻き戻りが起こり、一方のssDNAは受容菌へと移動。もう片方は供与菌に残る。DNA複製はここで登場し、供与菌と受容菌両方のssDNAを正常なdsDNAに変換する。 供与菌も受容菌も染色体DNAを持つが、供与菌はそれに加えてF因子を持つ。供与菌は性線毛を形成し、線毛は受容菌に付着し、両者を引き付け、接着させる。プラスミドにニックが入り、DNAポリメラーゼ、Relaxosome、Transfersomeが結合する。巻き戻されたssDNAは受容菌へと伝達する。両細胞でプラスミドが二重らせんになるようDNA複製が起こり、受容菌は新しい供与菌になる。 接合には伝達領域と呼ばれるF因子の大きな（約33 kb）領域が必要で、伝達領域の一端にある伝達起点oriTから始まる。 リラクセーズのTraIはoriT認識し、nickと呼ばれる部位を切断する。生じた5’末端に共有結合し、約200bpにわたりdsDNAを巻き戻す。巻き戻しはTraIが5’末端から環に沿って移動しながら行う。遊離した5’末端は受容菌へと移動し(このとき供与菌と受容菌は接触し、つながっている)、次々と巻き戻されるssDNAを先導する。 F因子がプラスミド型の場合、巻き戻しは環全体にわたり、（一本鎖の）F因子丸々1個が受容菌に伝達される。一方、染色体に組み込まれている場合、DNA伝達は伝達領域とは逆方向へ進む。プラスミド型と同様に5’末端から受容菌へと入っていくが、これは細菌間の接触が壊れるまで続く。細菌の染色体全体が伝達するのに約100分かかるが、通常はその前に接合は中断する。 接合によって互いのF因子または染色体は一本鎖になるが、それはDNA複製によって二重らせんに戻る。 リラクソーム　Relaxosome 細菌接合中のプラスミド移動を促進するタンパク質の複合体 リラクソームのタンパク質はFプラスミド上の、oriT近隣の領域で、traオペロンによってコードされている。 リラクソーム中の最も重要なタンパクはリラクセーズ リラクソームはoriT内の統合宿主因子と相互作用する。 リラクソーム成分をコードする遺伝子 TraH：リラクソームの構造形成を安定化させる。 TraI 線毛の形成に関与する、移動のためのタンパク質 接合に必須の遺伝子 リラクセーズをエンコードする遺伝子 FプラスミドでコードされるTraIタンパク質、DNAヘリカーゼIとしても知られている。抱合型DNA転移に必要な二機能性タンパク質である。 traオペロンの始めと終わりにあるtraYとtraI遺伝子の産物 ヘリカーゼが初めて報告されたのは1976年のことで、大腸菌のtraI遺伝子の産物である。 TraJ：oriT領域に複合体をリクルートする。 TraK：標的プラスミドの「ニックの入った」状態を増加させる。 TraM：'relaxed' DNA形成を刺激することによって、リラクセーズとの相互作用において重要な役割を果たす。 リラクセーズ、リラキサーゼ、リラキシーゼ？　relaxase 弛緩酵素？ リラクソーム中の最も重要なタンパク dsDNAにニックを入れ、生じた5‘末端に結合する酵素 トランスエステル化（transesterification）を介して、ニック部位で切断することによってコンジュゲーションプロセスを開始させる原因となる。 リラクセーズはヘリカーゼ特性とコンジュゲートしているプラ​​スミドを巻き戻すこともする。 リラクセーズがoriTで二本鎖DNAを切断し、放出された５’末端に結合する中間構造 ニッキングは、リボソームがプラスミドDNAの一本鎖に結合し、露出した3 'ヒドロキシル基と結合したDNA- タンパク質複合体をもたらす。 リラクセーズは単独で、またはリキソソームとして集合的に知られている十数種のタンパク質の複合体で働くことができ、F-プラスミド系ではリラクセーズ酵素はTraIと呼ばれる。 複製開始点、複製起点　origin of replication, replication origin　←→oriT DNAの複製が始まる、ゲノム上の特定の部位 大腸菌でDNA複製開始が起こらな突然変異体が単離されたのが研究の緒点となった、その遺伝子名、oriに由来する。 複製開始には、oriを認識するタンパク質が機能する。 レプリコン　replicon 1つのDNA複製起点で複製されるDNAの単位 連続的に複製される遺伝物質の構造単位 複製起点によって巻き戻しが及ぶ範囲 1963年にフランスのFrançois Jacob（1920〜2013, 1965年ノーベル生理学医学賞を受賞）とイギリスのSydney Brennerが提唱した単位で、彼らは、レプリコンの複製は、イニシエーターの働きで、複製起点から開始され、連続的に行われると主張した。 細菌類の染色体DNA、ウイルスのDNA、あるいはRNA、自律増殖する細胞質中のプラスミドは、それぞれレプリコンである。 真核生物の染色体は多数のレプリコンからなり、細胞分裂のときには各染色体のそれぞれのレプリコンでDNA分子の複製が行われる。 オリ　Ori オリとは複製開始のシグナルであるDNA塩基配列であり、単にオリジンともよばれる。 E. coli の染色体のオリ（oriC）は長さ約250組のヌクレオチドで成り立っている。プラスミドのオリの塩基配列は oriC に類似している。 接合時、環形型遺伝子複製はFプラスミドのoriTから始まる。 真正細菌には1つ（複製）開始地点が、古細菌には1つの（複製）開始地点、または複数のレプリコンが、真核生物には複数のレプリコンがあり、それぞれにひとつずつオリがある。レプリコンの長さは40kb（酵母菌やショウジョウバエ）から300kb（植物）と差がある。 多くの生物のミトコンドリアDNAには2つのオリシーケンスがある。 ヒトにおいてはDNA鎖の重さよりoriHとoriLと呼ばれ、それぞれが一重鎖複製の開始点である。 origin of transfer：oriT 接合時のFプラスミドの複製開始点 DNA伝達開始点 col E1 大腸菌内でプラスミドを複製するための複製起点 比較的多数のプラスミドを一細胞内に保持する。 col E2 ColE2プラスミドの複製に必要な領域には特異的な複製開始タンパクをコードする遺伝子(rep)と複製起点が含まれている。 プラスミドの複製起点およびコピー数　←→コスミドの複製起点 DNAコンストラクト 複製開始点 コピー数 分類 pUCベクター pMB1* 500~700 高コピー pBluescriptベクター ColE1 300~500 高コピー pGEMベクター pMB1* 300~400 高コピー pTZベクター pMB1* >1000 高コピー pBR322および誘導体 pMB1* 15~20 低コピー pACYCおよび誘導体 p15A 10~12 低コピー pSC101および誘導体 pSC101 ~5 非常に低いコピー * pMB1の複製起点はColE1の複製起点と非常に関連しているので，お互いに不和合性と考えられる。 トランスファーDNAバイナリーシステム　A transfer DNA (T-DNA) binary system バイナリープラスミドとヘルパープラスミドとからなる一対のプラスミドである。 2つのプラスミドは遺伝子組み換え生物を生産するために一緒に使用される。 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）にみられる天然に存在するTiプラスミドから作製された人工ベクター バイナリプラスミド　binary plasmid バイナリープラスミドのT-DNA部分は、左右の境界配列に隣接し、導入遺伝子ならびに植物選択マーカー （PSM）からなる。 T-DNAの外側では、バイナリープラスミドは細菌選択マーカー（BSM）および細菌の複製起点も含む。 バイナリーベクターは、複数の宿主（大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス ）で複製することができるので、いわゆるシャトルベクターである。 ヘルパープラスミド　helper plasmid ヘルパープラスミドはアグロバクテリウムのTiプラスミドに由来するvir遺伝子を含む。 これらの遺伝子は、左右の境界配列でバイナリープラスミドを切断し、宿主植物細胞へのT-DNAの形質導入を促進する一連のタンパク質をコードする。 ヘルパープラスミドもバイナリプラスミドと同様に、BSMおよびバクテリアのための複製起点を含む。 腫瘍誘発プラスミド、Tiプラスミド　tumor inducing plasmid、Ti plasmid　参考1 アグロバクテリウム属のA. tumefaciensやA. rhizogenesが自身の遺伝子を植物に導入するために、必ずではないがしばしば用いる遺伝装置 アグロバクテリウムを28℃以上で成育すると、Tiプラスミドは消失する。このような細菌はクラウンゴールを形成できず、無毒型になる。pTiとpRiは配列の相同性をほとんど持たないが、機能的には似ている。Tiプラスミドは、その遺伝子で生産するオパインの種類により分類される。Tiプラスミドが生産するオパインの種類には、オクトピン、ノパリン、スクシナモピン、ロイシノピン等がある。 このプラスミドには、195個のタンパク質をコードする196個の遺伝子を持つ。また1つの構造RNAが存在する。このプラスミドは、206,479ヌクレオチド長でGC含量は56%、全体の81%がコード領域である。偽遺伝子は含まない。 遺伝子工学によるこのプラスミドの改変は、遺伝子組み換え作物の作成にとって非常に重要である。 毒性領域の遺伝子は、virABCDEFGオペロンにまとめられる。このオペロンは、T-DNAの植物細胞への導入を仲介する酵素をコードする。 プラスミドの抽出法　Plasmid preparation プレップ？　　　---プラスミドのプレパレーション？ DNAミニプレップ法、アルカリミニプレップ、アルカリ-SDS法　Minipreparation、miniprep　参考1/2 大腸菌からのプラスミド DNAを精製する簡便法 1979年にBirnboim and Dolyが開発したにアルカリおよびSDS を用いたプラスミドの抽出法 * 形質転換大腸菌が目的とする組み換え体プラスミドを持つことを確かめるために、少量の大腸菌から迅速にプラスミドを単離する方法 プラスミドがうまく大腸菌に導入されていれば、プレートにはプラスミドを 持つ大腸菌のコロニーがたくさんできているはずで、1 個のコロニーには、1 個のライゲーション反応産物に由来する単一種類のプラスミドが導入されていることが予想される。コロニーを拾って大腸菌を培養し、そこからプラスミドを精製すれば、単一種類の cDNAのクローニングができるはずである。 しかしセルフライゲーションしていたり、制限酵素処理が不十分だった場合などには、期待しない形のプラスミドが入ったコロニーができている可能性もある。そこでコロニーを拾ってプラスミドを精製し、目的とする形に組み立てられているかをを確認する必要がある。 アルカリ抽出法の基本的な原理は、DNAのアルカリ変性を巧みに利用して、効率的にプラスミドDNAを抽出することである。 DNAは中性付近のpHで塩基間に水素結合を形成しているが、pHが9.2を越えると塩基の脱プロトン化が始まり、水素結合が壊れてDNAは変性する（一本鎖になる）。本来この変性状態は穏和な変化に対しては、可逆的（つまりpHを戻せば、DNAは二本鎖に戻る）であるが、急激な変化には対応できず二本鎖に戻ることができない。 アルカリ-SDSは、大腸菌染色体DNAを細胞壁とともに除去するため、プラスミドDNAのみを得るのに信頼性の高い方法である。 ミニプレップの標準的なプラスミドDNA収量は、細胞株に依存して50〜100μgである。 シークエンス用のプラスミドをプレップする時には、PEG沈殿を行う。 プラスミドを含むバクテリアを高 pH 条件で anionic detergent （ 陰イオン洗浄剤; 陰イオン界面活性剤）に晒すことで細胞壁を破壊し、かつ染色体の DNA を結合タンパク質とともに変性させる。pH が高いので DNA は 1 本鎖に分かれるが、プラスミド DNA は複雑に絡まった構造をしているために分離しない。 バクテリアのタンパク質、細胞壁および染色体 DNA は、溶解の過程でSDSにコートされた複合体を形成する。Na+ を K+ で置換すると、この複合体が沈殿する。 沈殿物を遠心分離で除き、上清に含まれるプラスミドを回収する。 Solution I (A)：50mM Glucose, 25mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM EDTA 1M Tris-HCl(pH8.0) 25ml 0.5M EDTA 20ml Glucose 9g /1000 ml 調製したあとオートクレーブ滅菌する。 Solution II (B)：0.2N NaOH, O.1% SDS NaOH 8g SDS 1g /1000 ml 滅菌はしない。室温で数週間は保存して使えるが，使用直前に作るのがベスト 特に NaOH は直前に溶かすのがいい。 Solution III (C) CH3COOK 29.4g CH3COOH 11.5ml TE飽和フェノール 10ml /100 ml 最終濃度は酢酸については 5 M、カリウムについては 3 M となる？ RNase A入りTE バッファーT TEバッファー　Tris-EDTA Buffer ：T Tris/EDTA溶液 DNAやRNAの保存や希釈に一般的に用いられるバッファーである。 イソプロパノール、イソプロピルアルコール　isopropanol CH3CHOHCH3 消毒薬として使われるアルコール エタノール↓の代わりに、より極性が小さいイソプロパノールを用いると、より沈殿が得やすい。しかし、イソプロパノールはエタノールよりも揮発性が低いため、最後の乾燥の段階で時間がかかるという欠点がある。またイソプロパノールが残ると、その後の実験に影響が大きい（酵素活性が阻害されるなど）ので、沈殿の洗浄・乾燥に留意が必要である。 フェノール/クロロホルム抽出、フェノクロ抽出、PCI抽出　phenol-chloroform extraction 溶液からタンパク質を取り除き、核酸（DNAやRNA）を抽出する方法 タンパク質がフェノールによって不溶化することを利用する。 溶液からタンパク質を取り除き、核酸（DNAやRNA）を抽出する方法 タンパク質がフェノールによって不溶化することを利用する。 フェノールがタンパク質を変性させるので、残存のフェノールが次の酵素反応を阻害する。そのため、最後のクロロホルム抽出やエタノール沈殿は必ず必要となる。 DNAは化学的に安定だが、RNAは（酵素が存在しなくても）高pHで不安定な分子である（RNAの塩基触媒加水分解）。RNAの抽出には水飽和フェノール（弱酸性）を用いる。 ポリエチレングリコール (PEG)：PEG 沈 核酸を精製する基本操作として一般的な手法 シークエンシングのテンプレート用として使用するプラスミドを精製するのに用いる。 高分子量のポリエチレングリコールを添加して遠心すると、短いDNA(〜100bp)は沈殿させずに、長いDNAのみを沈殿させることができる。これを利用してPCR後に短いDNAを除去する。 ゲル切りやExoSAP-ITに比べて低コスト シークエンス用のプラスミドをプレップする時には、PEG沈殿を行う。 ポリエチレングリコール　polyethylene glycol：PEG　←→ペグインターフェロン HO−(CH2−CH2−O)n−H エチレングリコールが重合した構造をもつ高分子化合物（ポリエーテル） ポリエチレンオキシド（polyethylene oxide：PEO）も基本的に同じ構造を有する化合物であるが、PEGは分子量2万程度までのもの、PEOは数万以上のものをいう。両者は物理的性質（融点、粘度など）が異なり用途も異なるが、化学的性質はほぼ同じである。 PEG は水、メタノール、ベンゼン、ジクロロメタンに可溶、ジエチルエーテル、ヘキサンには不溶である。 タンパク質など他の高分子に PEG構造を付加することを PEG化　pegylationという。 PEG は DNA や RNA から水和水を奪う性質があるので、エタノール沈殿と同様に核酸の沈殿に用いることができる。 エタノール沈殿 ethanol precipitation：エタ沈 核酸を精製する基本操作として一般的な手法 多糖類などが溶解している溶液にエタノールを加え、溶質を沈殿させること、およびその沈殿物 James Lionel Alloway（ロックフェラー大学のAveryの研究室）は加熱死菌の代わりにS型菌の抽出物をベルケフェルト（ドイツのハノーバーのベルケフェルト鉱山の珪藻土を主成分にした素焼きの磁器製の細菌濾過器）で濾過し、その濾液をR型菌の抗血清と共に加えることによっても形質転換、R型肺炎双球菌からの抽出物をエタノール沈殿を用いて濃縮させると、S型肺炎双球菌の形質転換が安定することを1933年に発見した。Allowayは1944年にデオキシリボ核酸が形質転換の主役であることを実証した。　* 核酸は塩基・糖・リン酸からなるヌクレオチドのポリマーであり、主鎖を形成する糖・リン酸部分が特にエタノールに溶けにくい。しかし核酸の水溶液にエタノールを2倍量程度加えても、核酸はほとんど沈殿しない。これは水溶液中でリン酸部分が解離して核酸が全体的に負電荷を帯びているので、核酸分子同士が静電的に反発してしまい凝集しにくいためである。そこであらかじめ核酸の水溶液に、ナトリウム塩やアンモニウム塩を加えることにより、リン酸の対イオンとして一価の陽イオンを核酸分子に近づける。これにより核酸の負電荷を中和することができるので、エタノール中で核酸分子が凝集しやすくなるというのがエタノール沈殿の原理である。 エタノールの代わりに、より極性が小さいイソプロパノールを用いると、より沈殿が得やすい。しかし、イソプロパノールはエタノールよりも揮発性が低いため、最後の乾燥の段階で時間がかかるという欠点がある。またイソプロパノールが残ると、その後の実験に影響が大きい（酵素活性が阻害されるなど）ので、沈殿の洗浄・乾燥に留意が必要である。 　プラスミドなどの環状二重鎖DNAの形状には3種類ある。　参考1 プラスミドを環状のままで電気泳動すると、３本のバンドが現れることがある。 電気泳動では、長さが短いものほど良く流れ、長いものほど、流れにくくなるが、泳動の条件（エチジウムブロマイドの有無やその濃度、バッファー組成、ゲル濃度）やプラスミドの種類やサイズなどによって逆転することもある。 形状の異なるDNA同士では、移動度に基づいて分子量の比較はできない。 DNAスーパーコイル、DNA超らせん　DNA supercoil：SC, DNA superhelix, covalently closed circular 閉環状DNA　closed circular DNA：CC DNAの二本鎖の両端がそれぞれ結合し、環状になったDNA 超らせんを持つのが通常だが、実験的に超らせんを持たない分子も作ることができる。 通常の溶液条件にあるB型DNAでは、2本のDNA鎖は反平行の向きに並び、約10.5塩基対辺り一回の割合で互いに右巻きに巻き付いている。この絡まり合いをツイスト（twist）、その数をツイスト数（twist number [Tw]）という。このツイスト数を減らしたり（二重らせんを巻き戻したり）、増やしたり（二重らせんを過度に巻き付けたり）すると、DNA分子全体に構造的なひずみが生じる。このひずみによって作られる構造がスーパーコイルである。 二重鎖DNAの環化に際して両端がメビウスの輪のようにねじれて環化して、超らせん構造となっている。 環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っている。 分子量の大きい染色体は、選択的にアルカリに変性し、分子量が小さく、超らせん構造をとる閉環状のプラスミドは変性しにくい。 無傷のプラスミドは、スーパーコイルの状態をとる。プラスミドは環状のDNAであるが、トポイソメラーゼの働きでスーパーコイルの状態に変換されている。 プラスミド全体がコンパクトになっているので、同じ分子量の線形のDNAよりゲル電気泳動での移動度が大きくなる。 泳動条件にもよるが、移動度はお約線形の倍くらい。 カテナン　catenane 2個以上の環状 の物質が互いに「知恵の輪」のように連結している状態 閉環状DNAが鎖状に結合した状態 プラスミドDNAにDNase Iを添加すると閉環状DNAを開環状構造体に変化する。ここにトポイソメラーゼIを添加した結果、新たな電気泳動バンドが現れる。このバンドから抽出されたDNAのAFMイメージでは鎖長がDNAモノマーの鎖長（約1.5 μm）の2倍で、かつDNA鎖が絡み合ってカテナン構造を形成する。* リンキング数　linking number 閉環状DNAで、直鎖DNAの螺旋の巻き数から何回余分に巻いているか（巻き戻されているか）を示す数 二本鎖DNAが互いに絡まり合っているかを示す数。10.5塩基対が１回転に相当するので、塩基対数を10.5で割った値がリンキング数である。 閉環状DNAは鎖の切断をしなければリンキング数は変えられないから、リンキング数はDNA分子が持つ固有の値となる。同じ塩基配列をもつ閉環状DNAはリンキング数が異なると別の高次構造となり、互いにトポアイソマーと呼ぶ。 トポイソメラーゼは、この数を変える。 開環状　open circular：OC スーパーコイルにニック（二重鎖のある位置で、片側鎖のみ切れる）が生じると、開環状になる。 スーパーコイルのDNAの2本鎖のうち、片方のDAN鎖のホスホジエステル結合が決断されると、残ったDNA鎖が支軸となって自由回転し、開環状になる。 環状構造は保たれているけれど、ねじれが失われ、らせん構造のない単一の輪の環状となる。 スーパーコイルにはならず広がっている。 電気泳動では移動度は小さくなり、通常、同じ分子量の線形DNAよりやや遅くなる。 開環状は体積が大きいから、ゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるが、泳動の条件などによって逆転することもある。 直鎖状、線状　linear：L 開環状DNAの2本鎖の両方が切断されると線状になる。




プライマー Primer DNAの合成・複製に必要な核酸の断片 DNAポリメラーゼがDNAを合成する時に 3'OH を供給する役割をもつ短い核酸の断片 プライマーは増幅させるDNAの起点あるいは5'側を識別する。 鋳型となるDNAとプライマーが相補的に結合した後、DNAポリメラーゼの作用によって、プライマーの一方の端を起点として、鋳型DNAと相補的な塩基配列を持つ新しいDNA鎖が伸長していく。 DNAポリメラーゼはプライマーなしに DNA を伸長することはできない。 生体内でのDNA複製では主にDNAポリメラーゼによって合成される RNA 断片が用いられる。またタンパク質がその機能を果たすこともある。 試験管内でのPCRに使用されるものは、化学合成した短いオリゴヌクレオチドである。その長さは通常は20塩基程度であるが、目的によってより短いことも長いこともある。増幅対象の2本鎖DNAの両鎖それぞれの3'側と相補的な配列をプライマーとして用意する。 3’末端側の約8塩基・・・・・酵素が結合して伸長反応をプロモートする領域 5’末端側領域・・・・・プライマー自身のTm値と特異性を高める領域 PCRにはリバースプライマーとフォワードプライマーが必要 PCRによってDNAを増幅する際に必要となる1組のプライマーペアのうち、増幅したい領域の3'末端側にアニーリングするように設計する。 プライマー設計時に、発現効率に影響するコザック配列に気をつける。 リバースプライマー reverse primer 熱変性前のDNAは鋳型DNAセンス鎖（5’–––––––3’）とアンチセンス鎖（3’–––––––5’）が相補的に2本鎖を形成しているが、熱変性を受けると1本鎖となる。 リバースプライマーは、熱変性後1本鎖となったDNAはセンス鎖の3'側に識別する。 リバースプライマーがセンス鎖に相補的にアニーリングすると、DNA Taqポリメラーゼは鋳型に沿って、5’→3’方向にDNA塩基合成を進展させる。 フォワードプライマー forward primer フォワードプライマーは鋳型アンチセンス鎖にアニーリングする。 M13 primers　←→M13ファージベクター もともとM13ファージにクローニングされたDNAをサンガー法でシークエンスするためのプライマー シークエンスしたいDNAをM13 RFにクローニングし、大腸菌から分泌されたM13ファージをとり、そこから一本鎖DNAを得て、これをシークエンスの鋳型にする。 ランダムプライマー　Random Primer　←→CAGE法 ランダムな配列を有する6 merまたは9 merのdeoxyribonucleotide mixture（46個または49個の配列が可能）で、5’末端がリン酸化されている。 オリゴdTプライマー　Oligo(dT) Primer 15塩基のTからなるオリゴヌクレオチド

ベクター vector 細胞外から細胞内へ遺伝子を導入するための「運び屋」 細胞または核内に遺伝子を導入する時に、遺伝子をのせて運ぶことができる物質 ウィルスのDNAやプラスミドがベクターとして用いられる。 →ウイルスベクター/発現ベクター/空ベクター/プラスミドベクター/クローニングベクター/コスミドベクター/ターゲッティングベクター/Tベクター/シャトルベクター 発現ベクター　expression vector 導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクター 発現ベクター遺伝子組み換え実験に使われるウイルスやプラスミドなどで、組み込み部位の上流部分に遺伝子発現に必要なプロモーター配列などを持たせ、形質転換後の細胞で遺伝子が発現する（遺伝子からRNAやタンパク質が作られる）ように構築したベクターの総称 コンストラクト：cDNAを組み込んだ発現ベクター 空ベクター　empty vector　←→ブルーホワイトスクリーニング 標的の遺伝子を組み込んでいないプラスミド ネガティブコントロールとして使用する。 クローニングベクター　cloning cosmid vector　←→クローニング 遺伝子工学や遺伝子組み換え実験に使う目的で、薬剤耐性遺伝子や都合のいい制限酵素部位などを追加して異種DNAのクローニングや形質転換実験に使いやすくしたプラスミドベクターやウイルスまたは、そのDNAの総称 　→プラスミドpBR322 bacterial artificial chromosome：BAC 大腸菌人工染色体 大腸菌の染色体を改変して作製したDNAクローニングベクターで、～300 kbのゲノムDNA断片を挿入することができる。 プラスミドベクター　←→プラスミド/ベクター プラスミドを改変して利用されるベクター 遺伝子組み換え実験に使うベクターは、バクテリアに内在性の自律増殖DNA（プラスミド）を応用したもの プラスミドベクターは、試薬や電気穿孔などの方法で宿主の細胞に導入され、外来遺伝子を染色体外で発現させる。 導入効率は、一般にレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターの方が高い。 プラスミドベクターは安定で、一度作製すると長期間にわたって保存することができる。 プラスミドベクターには5〜10kbまでのDNA断片を組み込むことができる(これ以上大きなDNAを組み込むと不安定になる。 通常の実験室で作成することができる。 人工的に変化させ、薬剤耐性遺伝子や制限酵素サイト、目的遺伝子などを追加して遺伝子クローニング実験に使いやすくしたプラスミドDNA プラスミドpBR322　参考1/2 pBR322 DNA は、一般的に用いられてきたE. coli のクローニングベクター 大腸菌を宿主とする古典的人工プラスミドベクター 環状二本鎖DNA上にテトラサイクリン耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子をもつ。 このプラスミドを基に改良型のpUC系ベクターなどの多くのプラスミドベクターが作られた。 pUCタイプベクター　参考1/2 プラスミドpBR322を改良して作られたプラスミドベクター pUCは「plasmid」の「p」と創世記にいち早く研究していた「University of California」 pUC19はJoachim Messing（1946〜　ドイツの分子生物学者）と共同研究者が開発した。 ブルーホワイトスクリーニングを行うために開発されたベクター α-complementationによるブルーホワイトスクリーニングを行うためのベクターには、lacプロモーター（lacP）、lacオペレーター（lacO）、そしてlacZ遺伝子のαフラグメントが乗っている。 dideoxy法（Sanger法）によるDNAシーケンシングに適したプラスミドベクターで、選択マーカーとしてアンピシリン耐性をもち、M13ファージベクターに比べて大きなDNA断片をクローニングすることができる。 pCAGGSベクター　←→CAGGSプロモーター　1/2 pCAGGSは広範な細胞種において目的タンパク質を高度に発現することを目的に作製された。 pCAGGSベクターのマップに、CMV・エンハンサーの下流に「CAG プロモーター」がある。 プロモーターの直下にはβ-アクチン遺伝子のスプライシングドナーを配置し、ウサギ由来β-アクチンのスプライシングアクセプターおよびポリAシグナルを搭載する。 SV40由来の複製起点を搭載していることから、SV40のラージT抗原を発現するCOS細胞や293T細胞において増幅し、目的タンパク質を大量に調製することが可能である。 大腸菌内での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子およびpUC由来の複製起点を搭載している。 CAG プロモーターとウサギのβ-グロビン遺伝子のpolyA signalによって、導入したい遺伝子をほぼ全身性に過剰発現させるベクター ニワトリ由来のβ-アクチン遺伝子のプロモーターおよびサイトメガロウイルス由来のCMV-IE エンハンサー（CAGプロモーター）によって目的遺伝子を転写する。CMVプロモーターを基盤とした発現ベクターに比べて、CAG プロモーターは細胞種に依存しない強力なプロモーターであり、目的タンパク質の高発現が期待できる。 丹羽 仁史先生　Dr Hitoshi Niwa（理研→熊本大学）が1991年に開発 理化学研究所バイオリソースセンターから入手できる。 ファージベクター　phage vector ファージは大腸菌に寄生するウィルスで、クローニングによく用いられる。 ファージベクターは遺伝子組み換え実験に使うために、プラスミドベクターに対し、細菌に感染するバクテリオファージを利用して作成した半人工的なDNA 48.5kbpの２本鎖線状DNAである。分子中央1/3はウィルスを感染させるのに必要ではないので、外来のDNAとそっくり置換が可能である。ここに、15〜20kbの外来DNAを組み込める。 ファージDNAが頭部に収納されるためにはcos部位と呼ばれる12塩基の相補的な2つの１本鎖配列が両端にあり、これらが36〜51kb離れていることが必要である。ファージタンパク質とDNAを試験管内で混ぜるだけで、成熟ファージ粒子ができあがる（in vitro packaging）。 M13ファージベクター　M13 phage vectors M13ファージ 環状一本鎖DNAゲノムをもつ繊維状ファージ 大腸菌内で環状二本鎖のプラスミド（replication form：RF）として増殖し、環状一本鎖DNAが被殻に包まれた繊維状ファージとなって大腸菌から分泌される。 λファージよりもクローニング可能なDNA断片が大きく、溶菌をせずに大腸菌から放出されるため取り扱いが容易で重宝されている。 M13ファージの端にあるg3pと呼ばれるタンパクが大腸菌の性繊毛を認識して付着し、一本鎖DNAを注入する。 M13 mp18はdideoxy法によるDNAシーケンシングに適したファージベクター lacZ領域にマルチクローニングサイトを持っていて、IPTGとX-galを含むsoft-agar plateによって、外来DNAの挿入の有無を容易に判別できる。 クローニングしたDNAはファージ粒子から一本鎖DNAとして回収できるので、そのままDNAシーケンシングに使用できる。 M13 primersを利用するのが便利である。 コスミドベクター cosmid vector　 大腸菌に感染するλファージのDNAが、ファージ頭部に取り込まれるための信号となるcos配列を利用し、この配列をプラスミドベクターに持たせることでλファージと同程度の大きさのDNAをクローニングできるように作成したベクター ファージDNAのcos部位の「コス」と、プラスミドDNAの「ミド」をとってコスミドベクターと名付けられている。 コスミドベクターは45kbpまでのDNA断片をクローニングすることができる。 ファージの2つのcos部位をプラスミドベクター上に適当な距離に置けば、ファージにin vitro packagingが可能 この目的で作られた小型（4〜6kb）のベクターをコスミドという。 プラスミドと同様にマーカー遺伝子や複製開始点をもつのでファージ感染後、細胞内ではプラスミドとして増殖する。 cos部位　cos site 大腸菌に感染するλファージのDNAが、ファージ頭部に取り込まれる時に、認識されための信号となる配列 この配列をプラスミドベクターに持たせることでλファージと同程度の大きさのDNAをクローニングできるように作成したベクターをコスミドとよぶ。 コスミドの複製起点およびコピー数 DNAコンストラクト 複製開始点 コピー数 分類 SuperCos pMB1 10~20 低コピー pWE15 ColE1 10~20 低コピー ターゲッティングベクター　←→ベクター/遺伝子ターゲティング法 一般にはガンシクロビル感受性であるチミジンキナーゼをもったベクターに目的遺伝子が機能的タンパクを合成できないよう翻訳部分を大きく欠損させるために、遺伝子の両端付近を相同組換えのアームとして約3.5~4kbずつもってきて、ネオマイシン耐性遺伝子をはさんでクローニングする。 シャトルベクター　 shuttle vector 一つのベクターであって、2種類の生物系で増殖できるもの 2つ（以上）の異なる宿主で複製ができるベクター 大腸菌でも酵母でも増殖できるなど 大腸菌と酵母、その他の細菌などではプラスミドの複製に必要なoriをが違うが、シャトルベクターはoriを2つ（以上）持っている。 シャトルベクターは真核細胞の遺伝子産物の研究にきわめて有用である。最初のクローニングと遺伝子操作には細菌細胞を使うことができ、また遺伝子機能の発現の研究には真核細胞を用いることができるからである。DNAは大腸菌で簡単に操作できる。しかし、発現された真核細胞タンパク質の適正なプロセシングや糖鎖の付加には酵母などの真核細胞の中で生産される必要がある。

インターカレーター intercalation DNA二重らせんの塩基対間に平行挿入（インターカレート）する化合物群の総称 臭化エチジウム：PCR反応によって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発する薬剤 SYBR Green：定量PCRには用いられるインターカレーター 縫い込み型インターカレーター：DNA二重らせんとの複合体においてインターカレーター分子に存在する2つの置換基が主溝と副溝に位置するもの。これは、DNA二重らせんとの複合体形成過程において置換基の1つがDNA塩基対間を通り抜けることに由来している。二本鎖DNAに結合した縫い込み型インターカレーターは、そのトポロジーから特に安定化される。

融合タンパク fusion protein 遺伝子工学によって作られたタンパク質で、2個以上の遺伝子が一体となって転写・発現し、一個のタンパク質を形成している状態 タンパク質をコードする遺伝子内の開始コドンや終止コドンの部分に、グルタチオン･S-トランスフェラーゼ（GSTタグ）やポリヒスチジン（Hisタグ）等の遺伝子をタグとして挿入することで、融合タンパク質が作られることも多い。 　→FUS

タンパク質タグ、プロテインタグ　protein tag 特定のタンパク質分子の目印（荷札、タグ）とするために遺伝子工学的に結合した部分のことをいい、単にタグと呼ぶことが多い。 特定のタンパク質分子に対する特異抗体がない場合に、遺伝子工学的手法により、目的のタンパク質にタグをつけて生体内に発現させることで、他の類似のタンパク質と区別することができる。 短いペプチドあるいは他種タンパク質の場合がある。様々な種類が開発されており、性質に応じてタンパク質の単離、固定化、タンパク質間相互作用の検出、タンパク分子の可視化などに利用されている。 タグは、数アミノ酸から数十アミノ酸の比較的短いポリペプチド鎖からなります。 タグを認識する抗体を一般にタグ抗体と呼び、タグ抗体のエピトープとなるタグ配列を「エピトープタグ」と呼ぶ。 タグは単独で発現させるレポーター遺伝子等と違い、目的とするタンパク質の生理的・物理化学的性質に影響を与えてはいけないので、目的タンパク質の末端につけるのが普通であり、またなるべく低分子量のものが望ましい。 さらにタグと目的タンパク質との間が特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたタグもよく使われる。タグを介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理すれば、目的タンパク質部分だけが外れて回収できる。 エピトープタグ　epitope-tag 特定の抗体のエピトープとなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を標識（タグ）として目的の遺伝子に連結して細胞内に導入し、発現したタンパク質をタグに対する抗体を利用して検出したり分離したりする方法をエピトープタグ法と呼ぶ。 エピトープタグにはHAタグ、mycタグ、FLAGタグなどがある。 プロテオミクスでは、FLAG（DYKDDDDK）やMYC（EQKLISEEDL）、6His（HHHHHH）タグなどがよく利用される。 アフィニティタグ　affinity Tag　参考1 アフィニティタグとは、検出と精製をより一般化させるために発現させたタンパク質のN末端またはC末端に人工的に付加できるポリペプチドアミノ酸シーケンス タグ融合タンパク質は、その組換えタンパク質とは無関係な結合パートナーに対して、親和性をもつように設計されています。アフィニティタグ融合タンパク質によって、その組換えタンパク質のユニークな生理学的特性、三次構造、および生物学的活性を変更することなく、これらのタンパク質をキャプチャすることが可能 His6、FLAG、GST、ストレップ-タグII、プロテインA HAタグ HA-tag インフルエンザの表面に存在する糖タンパク質であるヘマグルチニンから、抗体の認識部位として決定された。 ペプチドタグ、エピトープタグ、FLAG-tag 由来：ウイルス サイズ：9アミノ酸（1.1 kDa）（YPYDVPDYA） Mycタグ Myc-tag c-mycタンパク質は細胞周期やアポトーシスに関与する転写因子で、c-Mycの変異や過剰発現などの異常は様々な造血系のがんに関与している。 ペプチドタグ、エピトープタグ、FLAG-tag 由来：c-mycタンパク質 サイズ：10アミノ酸（1.2 kDa）（EQKLISEEDL） FLAGタグ　FLAG-tag　参考1 エピトープタグ FLAGタグあるいはFLAGオクタペプチドは、組み換えDNA (Recombinant DNA) 技術を用いてタンパク質に付加することができるポリペプチドタンパク質タグである。 アフィニティークロマトグラフィーで用いることができ、ホスト生物に発現している野生型タンパク質から、過剰発現させた組み換えタンパク質を分離するために用いられる。また、複数のサブユニットからなるタンパク質複合体を単離するのに使用することもできる。 FLAGタグは、抗体による認識を必要とする多くの異なる試験に用いることができる。研究対象のタンパク質に対する抗体がない場合、このタンパク質にFLAGタグを付加することで、FLAG配列に対する抗体でこのタンパク質を追い掛けること（免疫蛍光法による細胞内局在の研究やSDS-PAGEタンパク質電気泳動による検出）が可能になる。 FLAGタグのペプチド配列はN-DYKDDDDK-C (1012 Da) である。Hisタグ、HAタグ、mycタグのような、その他のアフィニティタグと組み合わせて使用することができる。FLAGタグはタンパク質のC末端あるいはN末端に融合される。一部の市販の抗体（例えばM1/4E11）などはFLAGタグがN末端に存在する時エピトープのみを認識する。しかしその他の市販の抗体（例えばM2）などは位置を問わない。 FLAGタグは、学術論文で発表された完全に機能するエピトープタグの初めての例であり、特許が取られた唯一のエピトープタグである。存在するタンパク質に対するモノクローナル抗体が初めに単離された後エピトープとして特徴を明らかにされタグに使われることとなったその他のタグ（mycタグ、HAタグ）とは異なり、FLAGエピトープは初めに設計され、その後タグを認識するモノクローナル抗体が作られた。FLAGタグの構造は付加されるタンパク質との適合性が最適化されている。FLAGタグはその他の一般的なタグよりも親水性であることから、付加されたタンパク質を変性あるいは不活性化しにくい。加えて、N末端のFLAGタグはタンパク質を単離した後に、特異的なプロテアーゼであるエンテロキナーゼ（エンテロペプチターゼ）によって容易に除去することができる。 Hisタグ ヒスチジンタグ Polyhistidine-tag, His-tag タグペプチドの一種であり、通常は遺伝子工学的に産生したタンパク質を固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによって精製する際に用いられる。 ヒスチジン残基（His）を6個ほどつないだ短いペプチドで、ニッケルなどの金属イオンと特異的に結合する性質がある。 ニッケルイオンをキレート樹脂に固定化しておき、Hisタグのついたタンパク質の溶液を流しこむと、タンパク質は樹脂に吸着する。ここへニッケルイオンあるいはイミダゾールなどニッケルイオンと結合する低分子化合物を流しこめば、タンパク質は樹脂から外れて回収できる。 His・Tagはドイツのメルク社の登録商標である。 グルタチオン S-トランスフェラーゼ、GSTタグ　←→GST/GSTπ/グルタチオン 遺伝子工学で目的のタンパク質に"タグ"として用いられる。 分子量26 kDaのタンパク質であり、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）由来の遺伝子が利用されている。 GSTタグを持つ目的のタンパク質はグルタチオンを固定化したアフィニティークロマトグラフィーにより効率よく回収することができる。 GST抗体を用いた免疫沈降法やウェスタンブロッティングにおいてタンパク質の検出などにも利用される。 融合タンパク質の中にはmaltose binding protein：MBP、cellulose binding protein：CBP、Thioredoxin：TRXやGFPなどがあるが、中でもGSTは目的とするタンパク質のN末端に結合させた場合、安定した可溶性タンパク質を回収することができることが多い。 目的タンパク質とGSTの連結部に特異的なプロテアーゼ（例として、PreScission Proteaseやthrombin）の切断箇所を導入したベクターを使用していれば、アフィニティ精製後にプロテアーゼでGSTを切断して目的タンパク質だけを単離することが可能である。 PreScission Protease GST融合タンパク質切断用プロテアーゼ PreScission ProteaseはGSTとヒトライノウイルス3Cプロテアーゼの融合タンパク質であるため、Glutathione Sepharose担体やGSTrap FF、GSTrap HPカラムを用いて切断反応液から容易に除去できる。 PreScission ProteaseのN末端にはGST融合タンパク質が付加されている。 認識配列が長く、低温で反応可能な点が特徴で、外の内在性プロテアーゼの活性を抑えつつタグ切断のみが行われることが最大のメリット 5℃ でも十分な酵素活性があるので、目的タンパク質を安定な状態で回収できます プロテインA　protein A mycタグ 黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus の細胞壁に存在するの細胞壁に存在する46.7 kDaのタンパク質、非グリコシル化タンパク質 抗体結合タンパク質 Alphabet Proteins：抗体と特異的に結合する細菌由来のタンパク質で、抗体精製、免疫沈降、免疫検出などに利用される。 プロテインAは、特定の種の免疫グロブリンのFc領域に強い親和性で結合する。 プロテインAの構造は、システイン残基を含まない〜60残基のアミノ酸残基から成る 5つのIgG結合ドメイン（A 、B、C、D、E）と、2つの S. aureus 細胞膜結合ドメイン（X および M）を有する。 IgGとのアフィニティー結合サイト（Ka=10-8M）は4箇所ある。 Protein Aは4Mウレアや6Mグアニジン塩酸にような変性剤にさらした後でも活性を保持している。 プロテインG　proteinG group G streptococci （G群溶血性レンサ球菌）の細胞壁に存在するタンパク質 Protein Gは免疫グロブリン（特にIgG）のFc領域に特異的に結合し、Fabフラグメントとも弱く結合する。 IgGとのアフィニティー結合サイト（Ka=10-8M）は2箇所あり、さらにアルブミンや細胞表面との結合性をしめすサイトもある。Pierce™ Recombinant Protein Gは、アルブミン結合サイトと細胞表面結合サイトを除去した組換えタンパク質のため、クルードなサンプルからアルブミンを除去してIgG精製できます。Protein Gの分子量は22 kDaですが、SDS電気泳動では34 kDa付近にバンドが検出される。 Protein Gと免疫グロブリンとの結合性も、抗体の動物種やサブクラスにより異なる。抗体精製においては、Protein Gは一般的に哺乳類のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体で、Protein Aとのアフィニティーが低い抗体の精製によく利用される。

HaloTag　←→NanoBRET 自己標識化タンパク質タグ　 self-labeling protein tag 細菌酵素由来の297残基ペプチド（33 kDa）で、最適な合成リガンドに共有結合し、目的のタンパク質に融合するように設計されています。 この細菌の酵素はhaloalkane dehalogenaseで、加水分解酵素として働き、目的のタンパク質の細胞内局在の可視化、目的のタンパク質の固定化、生化学的環境内で目的のタンパク質と結合する相手の捕捉を促進するように設計されている。 HaloTagはハロアルカンデハロゲナーゼと最適な合成リガンドを含む2つの共有結合セグメントから構成されている。 これらの合成配位子は官能基に結合した反応性クロロアルカンリンカーからなる。 官能基はビオチン（アフィニティタグして使用可能）であるか、またはクマリン、オレゴングリーン、TMRを含む5つの利用可能な蛍光色素から選択することができる。 生細胞でも、化学的に固定された細胞でも可視化に使用できる。



• 単相世代だけしか持たない細菌などでは、接合、形質転換、形質導入などの方式で遺伝的多様性を増す。
• 形質転換、形質導入ともに細菌の細胞に外からDNA分子が入り、菌の性質が変わることをいう。

  形質転換　transformation 細菌の形質転換とは、細菌細胞が環境から低頻度で外来DNAを取り込む自然のプロセス ある系統の細菌から抽出したDNAを、他の系統の細菌に取り込ませると、供与菌の形質が受容菌において発現する現象 培養細胞が性質をかえて，腫瘍細胞に類似の性質をもつことも形質転換と言われる。 形質転換は、1920年代にFrederick Griffith（1879〜1941, 英国の細菌学者、遺伝学者）により肺炎双球菌において観察された。1944年 Oswald Averyらは、形質転換をひき起こす物質がDNAであることをつきとめた。（Avery–MacLeod–McCarty experiment） 形質転換、形質導入ともに、発見されて以来、人工的に遺伝子組換え細菌を得る手法として用いられてきた。また、自然界においても、細菌が抗生物質への耐性を獲得したり新たな環境に適応するときなどに、形質転換や形質導入による種を超えた遺伝子の伝達が起きている場合があると考えられる。 1970年代における分子クローニングの到来により、形質転換のプロセスが開拓および改良されて、組み換えプラスミドDNAが「コンピテントな」（より透過性を高めた）細菌株に導入された。 形質導入　transduction バクテリオファージ粒子のなかにある細菌染色体の一部を含むDNA分子がファージ粒子の細菌への吸着にともない細胞中に注入されることにより起こる。 形質導入は1950年代バクテリオファージの遺伝現象の研究において発見された。

  形質転換受容性細胞、コンピテントセル competent cells competent 有能な、能力のある、(…の)能力があって、有能で、能力があって、資格があって、要求にかなう、十分な、(法定の)資格ある、適格の 外来DNA（プラスミド・ファージDNAなど）を細胞内に取り込める状態の細胞 通常はカルシウムイオン存在下で冷却することにより、DNAに対する膜透過性が増大した大腸菌を指す。

  トランスフォーマント transformant, transformed cells 外来 DNAが導入された細胞 （細菌、真菌、酵母または植物） トランスフォーム実験で作られた形質変換体、形質転換細胞 外来 物質が導入されて、悪性になる場合も含む。

  トランス遺伝子、トランスジーン trans gene トランスジェニックマウスなどで組み込まれた外来遺伝子 トランス遺伝子はゲノムの1箇所にタンデムに複数のコピーが組み込まれることが多く、挿入位置やコピー数により発現パターンや強度が左右される。 次世代の個体に受け継がれるなど、安定的に導入された遺伝子 トランス因子、トランス・エレメント 標的遺伝子に対してその発現に影響を与えるような、別の遺伝子（必ずしも別のDNA分子上になくてもよい）もしくはその遺伝子発現の産物であるRNAまたはタンパク質を指す用語である。 トランス因子は標的遺伝子と同じ分子上にあるシス因子、または他のトランス因子を介して機能する。 転写においては、標的遺伝子の転写を調節するRNAまたはタンパク質、もしくはそれをコードする遺伝子をトランスエレメントという。 タンパク質の場合は一般に転写因子という。このような発現産物が標的遺伝子と同じ染色体上にあるシス因子（オペレーター、エンハンサーやプロモーター等）に結合することにより、標的遺伝子の転写に影響を与える。 またmRNAの安定性や翻訳に影響を与えるトランス因子としても、種々のタンパク質因子のほか、miRNAなどのRNA因子が知られる。 シス因子、シスエレメント cis-element、cis-regulatory element またはcis-acting element 　←→転写調節シスエレメント/cis-inhibition 同一分子上の遺伝子発現を調節するDNA またはRNA の領域を指す。 cisはラテン語で「同じ側」の意味であり、「同じ側で発現調節する要素（因子）」がシスエレメントの原義 一般にシスエレメントは遺伝子上流部の転写因子が結合する領域を指す場合が多い。転写因子はタンパク質であり細胞内に拡散して特定のDNA 配列（シスエレメント）に結合して転写を調節するため、同じ場所に留まらずトランス因子に作用する。 一方、シスエレメントはDNA またはRNA 分子内の転写因子等に認識される塩基配列で、同一分子に即ちシスに作用し、遺伝子発現を調節する。 古典的なラクトースオペロンでは、オペレーターがシスエレメントであり、ラックリプレッサーがトランス因子である。

○サブクローニング subcloning

• サブクローニングとは、あるプラスミドの断片を、別のプラスミドに組み込むこと
• サブクローニングは、クローン化断片を研究により適した宿主（例えば、細菌、哺乳動物、昆虫、植物など）の発現ベクターに移す場合、目的遺伝子を別の発現プロモーター（例えば、恒常発現用から誘導発現用プロモーターへ）下に組み込む場合、または他のタンパク質やマーカーを目的遺伝子にタグとして付加し、融合発現を行う場合などにも行われる。

○クローニング cloning　←→サブクローニング

• 特定の遺伝子をもつ DNA 断片のクローンを作ること
• ある特定の遺伝子などを含むDNA断片を単離し、プラスミド等を使って増やすこと
• DNAの組み替えによる従来のクローニングは、ベクターと2本鎖DNAインサートをそれぞれ制限酵素で処理し、処理された断片はライゲーションにおいて、リガーゼでスプライシングされ、目的遺伝子を発現できる新しいベクターを形成する。
  
  

  ベクターの調製　→インサートの調製　→ライゲーション　→形質転換↑　→コロニースクリーニング インサート ライゲーションに用いる、目的遺伝子のDNA断片 ベクターに組み込むDNA断片 クローニングにはベクタープラスミドを切断したDNAと、インサートをDNAリガーゼを使って連結する。 ライゲーション ligation 組み換えDNA実験において、DNAリガーゼを用いてDNA分子を連結する反応を行うこと クローニングを行う場合、環状のプラスミドDNAを切り、その切り口の間に別のDNAを繋ぐこと 目的の断片が得られると、インサートとベクターを結合するためにライゲーション反応をセットアップする。 最も一般的なライゲーション用酵素はT4 DNAリガーゼで、DNA末端を5′リン酸と3′ OH基間で結合する。 セルフライゲーション self-ligation　参考1 自分自身でライゲーションしてしまうこと ライゲーションを行う時、切ったプラスミドDNAが、別のDNAと繋がらず、 同一分子で繋がってしまうこと セルフライゲーションを防ぐために、切り口の異なる2種類の制限酵素で切る、プラスミドDNAの5'末端のリン酸基を除去する方法がとられる（脱リン酸処理）。 5'末端のリン酸基がないプラスミドDNA同士は繋がらないが、5'末端のリン酸基プラスミドDNAと別のDNAは繋がる。 セルフライゲーションしたベクターを選別するためにブルーホワイトスクリーニングが考案された。 blunt end ligation　←→平滑末端クローニング 平滑末端DNAのライゲーション 平滑末端同士をつなぐブラントライゲーションの場合は、TdT活性による突出末端がライゲーション効率を落としてしまうため、T4 DNAポリメラーゼなどで末端の平滑化を行うと良い。

  
  

  平滑末端クローニング　blunt-end cloning　←→blunt-end-ligation　参考1 平滑末端を有するDNA断片のクローニング ベクターの脱リン酸化 平滑末端サイトを用いてDNA断片をクローニングする場合、ベクターがセルフライゲーションしないようにベクターを脱リン酸化して使用することが一般的 制限酵素で消化したDNAの5'末端にはリン酸基が残っておいるので、リン酸基を除去することでライゲーションされなくなる。 リン酸化PCR産物の調製 DNA断片のブランティング（平滑化） 方向性の確認

  TAクローニング TA-cloning ベクターの3'末端の「T（チミン, thymine）」とPCR断片の3'末端の「A（アデニン, adenine）」とでライゲーションするクローニング PCRに用いるTaq DNAポリメラーゼは弱い末端転移酵素活性を持っていて、PCR反応によって合成された産物の末端にAを１塩基付加するので、PCRで増幅した断片は3'末端にAが一塩基だけ突出した構造になる。 PCR産物をプラスミドにクローニングする際、開環したプラスミドベクターの末端にTを１塩基付加したものを用いると、AとTが水素結合を作ることによって、平滑末端同士のライゲーションよりもクローニング効率が上がる。 Taq DNA ポリメラーゼなどをベースとするPCR酵素を用いて得られた増幅産物のほとんどは、その3’末端にデオキシリボアデノシン（dA）が一塩基付加されている。これらのPCR増幅産物をクローニングする方法として、3’末端にデオキシリボチミジン（dT）を一塩基付加したTベクターを使用し、PCR増幅産物のdA一塩基突出部分と相補的となることを利用してクローニングを行う。 Tベクター TAクローニングで用いるT（チミン, thymine）突出ベクター PCR反応で後のA（アデニン, adenine）突出フラグメントをそのままインサートできる。 平滑末端同士をつなぐブラントライゲーションの場合は、TdT活性による突出末端がライゲーション効率を落としてしまうため、T4 DNAポリメラーゼなどで末端の平滑化を行うと良い。 一方、Tベクターを用いたTAクローニングは、突出したAを活用してライゲーションする方法である。

  TOPOクローニング

  PCRクローニング PCRによって増幅した2本鎖DNA断片をベクターに直接ライゲーションする手法

  ライゲーション非依存性クローニング

  遺伝子アセンブリ

  
  
  

  抗生物質選択　←→抗生物質耐性遺伝子 DNAクローニング時に、人工組換えプラスミドによって形質転換されない大腸菌（プラスミドを持たない）も存在する。 それらの大腸菌を排除するために抗生物質選択を行う。 ベクターとして使用するプラスミドに抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおくと、 そのプラスミドを持つ大腸菌が抗生物質に耐性になる。 従って、プレート培地や液体培地にその抗生物質を入れておくと、プラスミドを持つ大腸菌のみを選択的に増幅することができる。 大腸菌は体内のプラスミドを体外に排除する作用があるので、プラスミドを持つ大腸菌を保持するために、必ず培地に必要な抗生物質を加えるようにする。

  ブルーホワイトスクリーニング　青白選択　blue white screening　参考1 増幅したいDNAとベクターをライゲーションする時に、ベクターが自分自身とライゲーションするセルフライゲーションが起きることが多い。セルフライゲーションしたベクターを選別するためにブルーホワイトスクリーニングが考案された。 ベクターの増幅したいDNAを組み込む点を含む両側に、lacZ遺伝子を配置しておく。lacZ遺伝子はIPTGとX-galの存在下でlacZタンパク質を発現し、大腸菌コロニーを青くする。 lacZ遺伝子の中に増幅したいDNAがライゲーションされると、転写が抑制されたり、 正常なlacZタンパク質が発現しないために、大腸菌コロニーは白いままである。 そこで、プレート培地にIPTGとX-galを添加して、形質転換された大腸菌をまくと、DNAが組み込まれたプラスミドを持つ大腸菌は白いコロニーになり、セルフライゲーションしたプラスミドを持つ大腸菌は青いコロニーとなる。 空ベクターを使用すると、αペプチド（βガラクトシダーゼ）の活性は無傷のままなので、大腸菌コロニーは青色を呈す。 スクリーニング用の寒天培地に含んだ無色のX-galは、βガラクトシダーゼにより加水分解され、インディゴの青色（5,5′-dibromo-4,4′-dichloro-indigo）を呈す。 lacΖα遺伝子を破壊する形でインサートを挿入したベクターを使用すると、αペプチドは発現せず、X-galは加水分解されない。 そのため、インサートが存在する場合、コロニーは白色を呈す。 pUC118ベクターはlacΖのαフラグメントはをコードしていて、IPTGはこの遺伝子の発現を誘導する。 大腸菌にpUC118ベクターを形質転換させれば、lacZのαフラグメントをIPTGで誘導させ、発現させることが可能 大腸菌がlacZのωフラグメントを発現していれば、これらαとωのフラグメントはヘテロ4量体を形成しβガラクトシダーゼ活性を持る（α相補性）。 X-galを寒天培地に加えておけば、βガラクトシダーゼ活性によってX-galは青色の5,5'-ジブロモ-4,4'-ジクロロ-インディゴへと分解され、青色になる。 青色のコロニーはpUC118が形質転換され、βガラクトシダーゼ活性を発現した大腸菌のコロニー

  
  

  インビトロパッケージング in vitro packaging in vitroで、ファージDNAタンパク質の殻に包み込んでファージ粒子にする方法 λファージの場合は、E遺伝子産物よりなる殻の中に、A，Nu1，FⅠ，およびD遺伝子産物の働きでλDNAが詰め込まれ、さらにこの殻に尾部が結合してファージ粒子となる。 DNAクローニングの実験で、in vitro パケージングは、コスミドベクターやλファージ系クローニングベクターによって組み換えDNAを宿主へ高い効率で導入するために使用される。 組換えDNAをファージの外殻の中に包み込むと正常なファージの感染の過程を経て、宿主細胞内にそのDNAをきわめて効率的に導入できる。

⭐︎RNA関連　←→RNA結合タンパク/RNA干渉/RNAポリメラーゼ/RNAscope

• DNAの塩基情報がメッセンジャーRNAに転写され、その情報をもとにリボソームでタンパク質が合成される。
• リボソームの活性に重要な部分はリボソームRNAでできていて、タンパク質合成の際にアミノ酸をリボソームに誘導するのも運搬RNAの働きである。
• 最近では、タンパク質を生み出さないノンコーディングRNAが生命現象のさまざまな場面で重要な役割を果たしていることがわかってきている。

  開始コドン start codon RNA上でタンパク質の合成開始を指定するコドン 真核生物の核ゲノムの遺伝子に由来するmRNAではほぼ AUG（メチオニン）が使われる。 合成するたんぱく質に対応するコドンフレームのうち、mRNAの5'末端から最初に現れる AUG が開始コドンである場合が多い。 AUG はメチオニンをコードするコドンである。 原核生物である真正細菌のmRNAでは、リボゾーム結合部位（シャイン・ダルガノ配列など）の数〜10塩基程度下流に存在するAUGが主ではあるが、GUG（バリン）や AUA（イソロイシン）、UUG（ロイシン）なども開始コドンとして使用されている。 シャイン・ダルガノ配列 Shine-Dalgarno sequencen：SD配列　←→コザック配列/コンセンサス配列 原核生物のmRNAにおいて、開始コドンの上流に見られる共通配列 John Shine（1946/7/3〜, オーストラリアの生化学者、分子生物学者）とLynn Dalgarno（1935〜, オーストラリアの遺伝学者）が1975年に発見した。 -AGGAGG-のようにプリン塩基（アデニン・グアニン）に富んだ3ないし9塩基（平均4.8塩基）の長さの配列となっている。 原核生物の16SrRNAには3'末端に‐CCUCCUAの配列（アンチ・シャイン・ダルガノ配列）があり、これがシャイン・ダルガノ配列と相補的対合を行う。このため、リボゾーム結合部位となっている。 SD配列はmRNAにリボソームを動員するのを助け、リボソームを開始コドンに配置することによってタンパク質合成を開始させる。 真核生物にあるSD配列に類似した配列はコザック配列である。 大腸菌のSD配列：AGGAGGAである。

  終止コドン stop codon 遺伝暗号を構成する64種のコドンのうち、対応するアミノ酸（とtRNA）がなく、最終産物であるタンパク質の生合成を停止させるために使われているコドン 終結コドンあるいはアミノ酸を指定しないことから、ナンセンスコドンとも呼ばれる。 一般に核ゲノムから転写されるmRNA上のコードでは、UAA（オーカー）・UAG（アンバー）・UGA（オパール）の3種がある。

  RNAウイルス RNAをゲノムとするウイルス 宿主細胞内に感染し宿主のシステムを利用してウイルスゲノムの複製を行います。RNAウイルスはさらに、二本鎖RNAウイルス、一本鎖プラス鎖RNAウイルス、一本鎖マイナス鎖RNAウイルスに分類される。

  単鎖RNA、一本鎖RNA　single-stranded RNA：ssRNA 二重らせんを形成していないRNA 通常の転写反応で作られるRNAはすべて１本鎖である。 フレンドウイルス 一本鎖プラス鎖RNAウイルスはウイルスゲノムRNAがそのまま翻訳されウイルスタンパク質が作られるが、一本鎖マイナス鎖RNAウイルスではウイルスに由来するRNA合成酵素により相補的なRNAが合成されることがウイルスタンパク質の発現に必要 一本鎖プラス鎖RNA：日本脳炎ウイルス、及びピコルナウイルス 一本鎖マイナス鎖RNAウイルス：インフルエンザウイルス、センダイウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイル

  二本鎖RNA RNAウイルスに特有の構造である。 宿主の細胞内でRNAウイルスの複製の過程で産生される構造、または二本鎖RNAウイルスのゲノムとしても存在する。

  ノンコーディングRNA、非コードRNA　non-coding RNA：ncRNA タンパク質をコードしない非コードRNA タンパク質へ翻訳されないRNAの総称 細胞内には、タンパク質へと翻訳されないRNA：ncRNAが大量に存在する。 ncRNA群はその機能、長さなどの観点からさまざまなカテゴリーに分類されるが、これらのncRNAの中で低分子RNAの代表の一つであるmiRNAは、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たしている。 長鎖ノンコーディングRNA　long noncoding RNA：lncRNA siRNA, miRNA, piRNAなどのsmall RNAに対し、100〜200塩基以上のncRNAを一般的にlncRNAと呼んでいる。 lincRNA等の遺伝子間領域をはじめ、Tsixのようなアンチセンス遺伝子、さらにはプロモーター領域、イントロン、3′UTR由来のncRNAなどが含まれる。 lncRNAは通常は核に局在する。 lncRNAは主に転写サイレンシングに関連する。 長鎖遺伝子間ノンコーディングRNA　long intergenic/intervening non-coding RNA：lincRNA 遺伝子間領域に独立した転写ユニットをもつRNA 現在，いくつかのlincRNAは生理学的な機能をもつことが知られているが、多くの lincRNAについてはその生理学的な機能は不明であり、RNAポリメラーゼIIIによる転写にともなうノイズとも考えられている。 マイクロRNA microRNA：miRNA 約22塩基長の小分子RNAで、機能性のノンコーディングRNAに分類されている。 miRNAは内在性のRNAサイレンシング機構を担う代表的なshort non-coding RNAである。 miRNAによる遺伝子発現の調節という概念は1993年に報告された。 今日のmiRNA研究は、1998年のAndrew Fireと Craig MelloらによるRNA干渉の報告を起点として、再発見が促され飛躍的に進んだ。 他の遺伝子の転写後制御を担っているという、生命現象において重要な役割を担っている。 miRNAはゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に20から25塩基長の微小RNAとなる機能性核酸である。 ヒトでは2000種類近くのmiRNAがmiRBaseデータベースに登録されている。 miRNAは長鎖非コードRNAやイントロンに存在するヘアピンループ構造をとるRNAから生成される。 マイクロRNA-21：miR-21、has-mir-21、miRNA21　参考1 MIR21遺伝子によってコードされている哺乳類のmiRNA miR-21は哺乳類におけるマイクロRNAでもごく初期に同定されたマイクロRNAのうちのひとつである。 成熟miR-21の配列は進化の過程で強く保存されている。 ヒトmiR-21遺伝子は液胞膜タンパクと呼ばれるTMEM49遺伝子によって、第17番染色体長腕(17q23.2)の正鎖に存在している。 miR-21はコード遺伝子の転写方向におけるイントロン領域に存在しているにもかかわらず、自身のプロモーター領域を有しており、pri-miR-21と呼ばれる約3400塩基の独自の初期転写産物を生成する。 ステムループ構造を有する前駆体miR-21(pre-miR-21)はpri-miR-21の2445〜2516番の塩基に存在している。 ステム・ループ構造 stem-loop　＝ヘアピンループ構造 数塩基対の二本鎖ステム領域と、３〜５ヌクレオチド長の一本鎖のループ鎖からなる領域 RNA上に存在する逆方向反復配列間で、水素結合によって生じる二本鎖の部分（stem）と、それに挟まれたループ（loop）状の構造 転写終結シグナルや翻訳調節などの機能にかかわっている。 5SRNAやmiRNA、tRNAなどの低分子RNAによくみられる核酸の高次構造で、環状の一本鎖DNA部分と二重らせん構造のステム部分からなる。 RNAがステム・ループ構造を取ると、RNAポリメラーゼはその部分で転写を停止する。 DNAにおいても複製開始点やプロモーター領域付近に存在する。

  短鎖干渉RNA　short interfering RNAs：siRNA 21〜23塩基対からなる低分子二本鎖RNA siRNAは通常21塩基対の二本鎖RNAであるが、各RNA鎖の3'部分は2塩基分突出した構造をとる。 Thomas Tuschlが２本鎖RNAの短縮形であるsiRNAが、哺乳類の細胞で遺伝子を抑えることを発見した。 siRNAは細胞に導入された64塩基の二本鎖RNAが、それと同じ配列を持つ細胞内mRNAの分解を引き起こし、標的遺伝子の発現を抑制する。 二本鎖RNAと相補的な塩基配列をもつmRNAが分解される現象を利用し、特定の遺伝子の発現を一過的に阻害する手法として用いられる。 siRNAもmiRNAもその生合成にDicerを必要とする。 d-siRNA：Diced siRNA、Dicer siRNA リコンビナントのDicerを用いてsiRNAを作製する方法 500-1000bp程度の配列をターゲットとして二本鎖RNAを合成し、それをDicerで切断することでsiRNAを作製する方法

  PIWI-interacting RNA：piRNA　参考1 PIWIタンパク質群と結合する、24〜32塩基程度の低分子RNA 2006年に見つかった新しいカテゴリのRNA 生殖組織に特異的に発現する。 piRNAは主にレトロトランスポゾンに由来し、相補配列をもつ標的RNAへのガイド分子として機能する。 piRNAはトランスポゾンを抑制することにより生殖細胞においてゲノムの品質を管理する。 piRNA経路に異常が生じると、トランスポゾンのはたらきが活発化し、精子形成や卵形成が正常に行われなくなり、不妊になる。 PIWIとpiRISC（piRNA-induced silencing complex）を形成することによりトランスポゾンを抑制し、生殖細胞においてゲノムの品質を管理する。 piRNAの多くはトランスポゾンの残骸領域に由来し、トランスポゾンに相補的な塩基配列4)を持ちます。これらのpiRNAが核酸切断活性を有するPIWIタンパク質群をトランスポゾンRNAに導くことで、自身の配列特異的にトランスポゾンRNAの切断を引き起こしている

  短鎖ヘアピンRNA　short hairpin RNA：shRNA RNA干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のRNA配列 shRNAはベクターによって細胞に導入され、恒常的に発現されるように、U6あるいはH1プロモーターを利用する。 通常このベクターは娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングの効果も受け継がれる。 shRNAのヘアピン構造は細胞機構によってsiRNAへと切断され、RNA誘導サイレンシング複合体と結合する。 RISC複合体はsiRNAと相補的な配列を持つmRNAに結合し、切断する。 RNA誘導サイレンシング複合体：RISC タンパク質とsiRNAから構成されるヌクレアーゼ複合体 RISC複合体内に取り込まれたsiRNAは相補的な内在性mRNAを標的として切断する。

  転移RNA transfer RNA：tRNA　←→ミトコンドリアtRNA　参考1 73〜93塩基の長さの小さなRNAである。 ｔRNAは全RNAの約15％を占める。 真核生物では、tRNAはRNAポリメラーゼIIIによって転写され、約70〜100のリボヌクレオチドからなり、分子量約2万〜3万、沈降速度定数から4SRNAともよばれる。 リボソームのタンパク質合成部位でmRNA上の塩基配列を認識し、対応するアミノ酸を合成中のポリペプチド鎖に転移させるためのアダプター分子 大腸菌の細胞内に多量に存在する低分子RNAの一種である10SaRNAはtmRNAとも呼ばれ、tRNAとメッセンジャーRNAの両機能をもつ。

  ポリA鎖 polyA chain, polyadenylic acid chain 真核生物の多くのmRNAの3′末端に、ポリA合成酵素によって付加されるアデニンヌクレオチド残基の重合したもの ほとんどのmRNAの末端は長いアデノシンヌクレオチドの繰り返しでできている。この長いポリAの尾はゲノム情報を含んでいない。この部分はRNAポリメラーゼが通常の転写過程を終わらせた後に付加されるものである。RNAポリメラーゼがRNA鎖を放した後、他の酵素が最終処理のための接触を行い、イントロンが除去され、前にはキャップが、後ろには長いポリAの尾をが付加される。 遺伝子DNAから転写されたhnRNAが核内でmRNAに成熟する過程で、3′末端近くに共通してみられるポリAシグナル（AAUAAA）のあと10〜30ヌクレオチドのところに付加される。 ポリA鎖は遺伝子DNAの転写産物である前駆体RNAが核内でmRNAに成熟する際に付加される。 ポリAシグナル　polyA signal mRNA分子の3'末端に相当する部分に存在する配列で、これを目印としてポリAポリメラーゼによるポリ(A)の付加が始められる。 ポリA鎖 poly A tailが付加される位置は、一般にmRNAの3′末端付近に共通して存在するAAUAAA配列のあと、10〜30ヌクレオチドのところである。この共通配列をポリAシグナルという。

  
  
• RNAプロセッシングのうちmRNAの配列が変わるプロセッシングにはスプライシングとRNA編集がある。

  スプライシング　splicing 一般的な真核生物のDNAから転写されたmRNA前駆体には、イントロンと呼ばれる直接タンパク質のアミノ酸配列に関わらない領域がある。このイントロンを除き、残ったエクソンと呼ばれる領域からなるmRNAが作られる過程はスプライシングと呼ばれる。 スプライシングまたはイントロンの除去は、転写後修飾の主要な側面であり、真核生物の核においてのみ起こる。 スプライシング供与部位、スプライシングドナー部位　donor site：イントロンの5′スプライス部位 スプライシング受容部位、スプライシングアクセプター部位　acceptor site：3′スプライス部位

  選択的スプライシング　alternative splicing DNAからの転写過程において特定のエクソンをとばしてスプライシングを行うことである。択一的スプライシングとも呼ばれる。 通常スプライシングで切り取られる箇所は決まっている。しかし作られる臓器や環境によってエクソンの選ばれ方が変わることがある。この選択的スプライシングにより、1種類のDNAから複数のタンパク質を作ることができる。 選択的スプライシングによってスプライスバリアントと呼ばれる変異タンパク質が生成される。

  スプライスバリアント　splice variant 真核細胞で、RNA前駆体中のイントロンを除去し、前後のエキソンを再結合する反応がスプライシングである。最終的に、残るエキソンには多様性があり、さまざまな成熟mRNAが生産される。その多様なmRNAをスプライシングバリアントと呼ぶ。 それぞれ活性の異なるタンパク質を生産することもある。 １つの遺伝子が複数のエクソンから構成されるとき、2種以上の発現物、たとえばタンパク質が生成しうることをいう．例えばそれらが構造的に違うことにより、疾病の原因になりうる。

  スプライスジャンクション、スプライス部位　splice junction, splice site RNAスプライシングで、イントロンが除去されエキソン同士が結合される部位

  スプライシング因子　splicing factor mRNA前駆体からイントロンを取り除き、前後のエキソンを再結合する反応であるpre-mRNAスプライシングに関与する一群の因子 核内低分子RNAとタンパク質の複合体であるsnRNPとともに、mRNA前駆体に段階的に結合し、スプライシング反応の場となる複合体であるスプライソソームを形成する。 エキソンとイントロンの境界部位認識に関わるSF2/ASFやスプライソソーム形成に必要なSC35など、50種類以上のスプライシング因子が知られている。 核スペックルと呼ばれる斑点状核内ドメインは、スプライシング因子を貯蔵し、スプライシング反応を活発に行う領域と考えられている。 核スペックル　nuclear speckle 別名　クロマチン間顆粒　interchromatin granules 核質のクロマチン間に存在し、前駆体mRNAスプライシング因子を多く含む核内構造体 核内で10〜30個の斑点状構造として観察される。 主としてスプライシング因子群の貯蔵・会合・修飾の場と考えられている。 核スペックル内には、Clk/Styと呼ばれるセリン/スレオニンキナーゼが存在する。Clk/Sty はSF2/ASFのRSドメインのC末端側をリン酸化する。すると、RSドメインが過剰にリン酸化されたSRタンパク質は、核スペックルから開放される。ASF/SF2のRSドメインのN末端側とC末端側は近接して存在する。それにも関わらず、ASF/SF2のリン酸化の状態は精密に制御されている。 SRタンパク質ファミリー　serine-arginine-rich protein family、SR-rich protein family N末端側にRRM (RNA recognition motif)を一つか二つ持ち、C末端側にRSドメインを持つタンパク質の総称 1つまたは2つのRNA認識モチーフとアルギニン・セリンに富んだドメインを持つスプライシング因子群で、SF2/ASF、SC35、SRp40、SRp55など10種類がよく研究されている。 それぞれに特異的なESEに結合し、近傍のスプライシングを促進することが明らかにされている。 RSドメイン　RS domain アルギニン/セリンリッチドメインを持つことを特徴とするドメイン RSドメインはアルギニン-セリン(RS)のジペプチドを１つ以上持つ配列で、このセリンがリン酸化酵素によるリン酸化の標的となっている。 pre-mRNA-splicing factor SF2：SF2 alternative splicing factor 1：ASF1 33 kDaタンパク質 ASF/SF2はSRタンパク質の1つである 細胞質に存在するASF/SF2はSRタンパク質キナーゼ(SRPK)によりRSドメインのN末端側をリン酸化される。この状態ではRSドメインのC末端側はまだリン酸化されていない。するとASF/SF2は核内のスプライシング複合体が集合した、核スペックルへ移動する。 SC35 スプライシング因子の一つ 1990年にXiang-Dong Fu（ハーバード大学のManiatis研のポスドク）が、スプライソソームに対するモノクローナル抗体を使って同定した。 クローニングされると、この分子もN末にRRM、C末にRSドメインを持つことがわかり(Fu & Maniatis 1992)、SF2/ASFと同様な活性があるのではないかと予想した。

  pre-mRNAスプライシング、mRNA前駆体スプライシング　pre-mRNA splicing タンパク質代謝において、転写で合成された一次転写産物からイントロンが除去され、エクソンが結合する過程 この過程の結果生じるRNAをメッセンジャーRNA：mRNAといい、次の段階である翻訳でタンパク質合成の直接の引き金となる。 pre-mRNAスプライシングはスプライソソームという巨大な分子によって成し行われる。 スプライソソーム　spliceosome pre-mRNAスプライシングを行う巨大な分子 約150個のタンパク質と5個のRNAからなる酵素複合体 5個の核内低分子リボ核タンパク質（snRNP）と多数の補助因子や酵素から構成されている。 通常の酵素とは異なり、機能の大部分はタンパク質でなくRNAが担う。 核内低分子RNA small nuclear RNA：snRNA ノンコーディングRNA：ncRNAの一つ pre-mRNAスプライシングの機能を担い、スプライソソームを構成するRNAの総称 snRNAはほとんどの真核生物で100〜300bpで、数個のタンパク質と複合体を作っている。 snRNAは、その配列中にウリジンを豊富に有し、タンパク質と複合体を形成してU snRNPとして機能している。 U1、U2、U3、U4、U5、U6の6種類のU snRNPは、スプライソソーム構成因子としてスプライシングの調節に寄与する。 核内低分子リボ核タンパク質、スナープ　small nuclear ribonucleoprotein particle：snRNP　←→snRNP@タンパク pre-mRNAスプライシングの機能を担い、スプライソソームを構成するRNA-タンパク質複合体 RNAの決断と結合反応の触媒、または触媒の補助である。 5種類のsnRNPがある：U1、U2、U4、U5、U6 各snRNPは7つのタンパク質からなるリング状の部分複合体と特定のRNA分子を含んでいる。 スプライソソームにおけるsnRNPの構成はスプライシングの段階によって変わり、各段階でスプライソソームに就いたsnRNPがその時必要な独自の役割を果たす。 snRNPの役割は大きく3つに分けられる。 5'-スプライス部位や分岐部位の識別 この2つの部位を近づける RNAの決断と結合反応の触媒、または触媒の補助 U1 snRNA　参考1 Joan Steitzは1980年に、U1 snRNAがスプライス部位と相補的結合していると提唱したが、正しくなかった。 U1 snRNAと5′スプライス部位の対合は、6年後に正しいことが証明された(Zhuang & Weiner 1986)。 U1 snRNP 5'および3'スプライス部位のコンセンサス配列とほぼ相補的な配列を持ち、スプライシングの過程で2つは塩基対を形成する。 スプライソソームと一次転写産物を十分な時間、接近させておく役割だといえる。実際、この塩基対形成はスプライシングの成功に必須とされる。 U6 snRNA U6snRNPの構成成分であるノンコーディングsnRNAであり、mRNA前駆体からイントロンの切除を触媒するRNA スプライソソームに関与するすべての種間で、U6のRNA配列は最も高度に保存されている。U6 snRNAの機能は進化を通じて重要かつ変わらないと示唆されている。 U6 snRNAはRNAポリメラーゼIIIの転写産物で5'末端にγ-メチルグアノシンキャップを有し、Lsmタンパク質群と結合している。U6 snRNA以外はRNAポリメラーゼIIで転写されて5'末端に7-メチルグアノシンキャップ（m7G cap）を付加された後、核外に運ばれる。細胞質でSmタンパク質と結合し、m7G capがさらにメチル化されてトリメチルグアノシンキャップ（m3G cap）となり、再び核内へ運ばれた後でRNA修飾を受けることが知られている。 一般的に脊椎動物ゲノムでは、U6 snRNA遺伝子またはU6由来の偽遺伝子の多くのコピーを見出すことがである。 脊椎動物におけるU6 snRNA遺伝子の「back-ups」の蔓延は、生物の生存能力への進化の重要性を意味するものである。 U6 snRNP U1 snRNPと同様に5'-スプライス部位と塩基対形成をする。 Christine GuthrieとJoan Steitzは、U6の普遍配列ACAGAGとイントロンの+4から+6にあるUGUとの間で、塩基対形成について行われると仮定し、塩基対はスプライシングの第一の反応前から第二の反応後まで存在することを示した。 U6 snRNPは独特な七量体であるLsmタンパク質複合体を含んでいて、これがU6核内低分子RNAの3′末端を特異的に認識する。 少なくとも二種類の酵母で、U6 snRNPの遺伝子はmRNA成熟後にも、スプライシング後に残存するタイプのイントロンによって分断されている。

  
  

  RNA編集　RNA editing　←→ゲノム編集 ゲノム上の遺伝情報がRNAレベルで塩基置換、挿入、欠失などにより、配列が書き換えられる現象 この現象は1980年代にトリパノソーマのミトコンドリア遺伝子で確認されて以来、植物も含めてさまざまな真核生物で確認されている。 RNA編集は比較的まれな現象であり、転写されたmRNAが核から出る前に多くの分子に起こる転写後プロセッシング（メチル化キャップ付加、ポリA鎖付加、スプライシング）とは別の現象である 転写されたmRNAにおいて、特定の塩基が他の塩基へと変換されたり、ウリジン（U）などの塩基の挿入・欠失が起こる現象。 ほ乳類のRNA編集は、アデノシン(A)とシトシン(C)のアミノ基の加水分解反応である。加水分解の結果、それぞれイノシン(I)とウラシル(U)に変換される反応で、RNA編集の結果、１塩基置換が起こる。イノシンは、翻訳プロセスではグアニンとして振る舞う。 哺乳類ではADARやAPOBEC1が行うRNA編集が知られているが，それらのファミリーメンバーにはDNAを標的にするものが含まれる。近年ゲノム解析やトランスクリプトーム解析の急速な進歩と相まって、DNA/RNA編集研究は新次元の展開をみせている。 RNA編集は「脳の複雑性」に深く関与していると予想されていて、RNA編集の異常は筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、プラダー・ウィリー症候群やうつ病を含む精神疾患との関連が示唆されている。 脱アミノ酵素　deaminase 化合物のアミノ基を除いてアンモニアにする反応を触媒する酵素の総称 代表的なRNA編集deaminase：ADAR メチルシトシンがAID/Apobec1などのデアミナーゼの作用でチミンに変換され、その結果、相補DNA鎖とG::Tミスマッチ状態になる。@DNA脱メチル化 adenosine deaminase acting on RNA：ADAR　←→アデノシン/アデノシン・デアミナーゼ グルタミン酸受容体サブユニットやセロトニン受容体2Cサブタイプなど、生理的に重要な遺伝子のpre−mRNAを部位特異的にアデノシン（A）からイノシン（I）に塩基修飾するRNA編集（A−to−I RNA編集）酵素 ADARは線虫やショウジョウバエといった下等動物から存在するが、酵母には存在しない。ADARは，RNAのアデノシンをイノシンへと変換するADAT（adenosine deaminase acting on tRNA）から進化したものであり、mRNAのRNA編集が、多細胞生物に重要な役割を担っていることを示唆する。 A-to-I RNA編集機構は、転写されたRNA上の特定のアデノシン（A）が編集酵素である二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）によってイノシン（I）に変換される機構であり、生物が内在的に有するRNA情報変換機構 A-to-I RNA編集によるコドン変換 Prior to editing After A-to-I editing Ser AGU/C Gly IGU/C Tyr UAU/C Cys UIU/C Thr ACA/C/G/U Ala IGA/C/G/U ILe AUU/A/C Val IUU/C/A Start/Met AUG Val IUG Stop UAA Trp UIA, UAI Stop CAU/C Trp UIG His UAG,UGA Arg CIU/C Lys AAA/G/ Gly IGA/G Lys AAA/G Glu IGAA/G Asn AAU/C Asp IAU/C Asn AAU/C Ser AIU/C Gln CAA/G Arg CIA/G Asp GAU/C Gly GIU/C Glu GAA/G Gly GIU/C 近年ADAR遺伝子ノックアウトマウスの解析、またADAR遺伝子の突然変異やA−to−I RNA編集機構の不全によって引き起こされるヒト遺伝疾患や病態生理についても報告されている。 ADARは遺伝子の異なるADAR1、ADAR2、ADAR3が存在している。 ADAR1 ADARはN末端側に二つまたは三つの二本鎖RNA結合ドメインと，C末端側にデアミナーゼドメインを有し、ADAR1では一つの遺伝子からスプライシングによって二つのアイソフォーム（核に局在：ADAR1 p110，細胞質に局在：ADAR1 p150）が作られる。 N末端側にZ-DNA結合ドメインを持っているが、その生理的意義については議論が続いている。 ADAR1とADAR2はともに全身に発現し、特にADAR2は神経細胞に強く発現している。ADAR1とADAR2は基質が同じ場合と異なる場合があるが、何がその違いを生み出すのか分子機構はまだよくわかっていない。 ADAR1のノックアウトマウスは胚性致死 adenosine deaminase acting on RNA2：ADAR2 グルタミン酸受容体の一つGluR2のQ/R部位を、グルタミン酸（Q）からアルギニン（R）へと置換する酵素 ADAR2ノックアウトマウスは生後20日以内にけいれん重積によって死に至るが、このマウスにノックイン技術を用いてGluR2（R）を挿入すると、致死率はゼロになる。 ADAR3 ADAR3は神経細胞にのみ発現し，N末端側にアルギニンリッチな一本鎖RNA結合ドメインを持つがRNA編集活性は持たない。 ADAR3はin vitroでRNA編集活性を抑制することが報告されている。 ADAR3の一塩基多型は長寿と関連していることが報告されているが、RNA編集活性を持たないため，ADAR3の研究はあまり進んでいない。 APOBECファミリー　←→TDG　参考1/2 cytidine deaminaseモチーフを持つ一群の酵素群 H-X-E-X（23–25）-P-C-X（2–4）-Cのアミノ酸配列からなるシチジンデアミナーゼモチーフを一つないし二つ持つことを共通の生化学的特徴としている このファミリーの多くは、RNAやDNA上のシトシンをウラシルに変換する脱アミノ反応を触媒する。 哺乳類でRNA編集を行う酵素として最も研究が進んでいるデアミナーゼ ヒトでは11種類あり、Apobec1やAIDもその一つ メチルシトシンがAID/Apobec1などのデアミナーゼの作用でチミンに変換され、その結果、相補DNA鎖とG::Tミスマッチ状態になる。@DNA脱メチル化 Apobec1 APOBECファミリーの中で最初に命名されたファミリーメンバー ファミリーの名前はこのメンバーに由来する。 ApoB100のRNA編集を行う酵素 ApoB100のプレmRNAのアミノ酸翻訳部位の中央付近にはAPOBEC1とその共益タンパクが結合できるRNA配列があり、APOBEC1はその近傍のある位置のシトシンをウラシルに変換する。その結果CAGがUAGとなりストップコドンが作られる。これをApoB RNA編集と呼び、RNA編集型mRNAは、ApoB48というC末端が欠損したタンパクに翻訳される。 一方RNA編集されなかったmRNAはApoB100というタンパクに翻訳される。 ApoB100とApoB48は、両方とも脂質の輸送に関わるが、その役割は全く異なる。従ってAPOBEC1は、mRNAレベルで遺伝情報を改編しゲノム遺伝情報にない新しい機能タンパクを作る活性があると言える。 Activation-induced cytidine deaminase：AID 遺伝子名はAICDA Apobec1に次いで単離されたデアミナーゼ 1999年に、村松等により活性化Bリンパ球に限局して発現する遺伝子として単離されたAPOBECファミリーの一つ 抗体遺伝子座のクラススイッチ組換え、somatic hypermutation、gene conversionの引き金を引く活性が知られている。 大部分の常染色体劣性遺伝型のHyper-IgM syndrome type 2という先天的クラススイッチ欠損症は、この遺伝子の変異で起こる。進化的には無顎魚類まで遡れるとされ、APOBECファミリーのfounderと考えられている。

  
  　→プラダー・ウィリー症候群：PWS
  
  

  完全長cDNA　full-length cDNA 分子生物学の実験手法で、合成直後のmRNAが5'末端に三リン酸構造を持つことを利用し、mRNAの本来の5'末端までを完全に含むcDNA分子、またはそのライブラリ 相補的DNA、ゲノムから転写されるmRNA（タンパク質へと翻訳される）を出発材料として、mRNAを逆転写することによって得られる。したがって，完全長cDNAは、ゲノムのDNA塩基配列のうち，タンパク質として翻訳される正確な領域を指すことになる。“遺伝子”もタンパク質として翻訳される塩基配列領域のことを指すが、遺伝子という言葉は、コンピュータで予測されただけの場合など、概念を意味するニュアンスで用いられることが多い。 一方、完全長cDNAは、物質そのものを指す物理的なニュアンスで用いられる。また、遺伝子では成熟mRNAができる前に取り除かれるタンパク質をコードしない挿入配列（イントロン）を含むが、cDNAでは含まない。 キャップトラッパー法は完全長cDNAを作製するために開発された理研の独自技術

  cDNAライブラリー　cDNA Library ある組織のmRNAをもとにcDNAを作製し、それをλファージやプラスミドに組み込んで作ったライブラリー mRNAの組成が組織や成長段階により異なるので、それぞれ特有のライブラリーができる。

  マウスエンサイクロペディアプロジェクト Mouse Encyclopedia Project 1995年から理化学研究所において進められてきた完全長cDNA計画で，RISA system（Riken Integrated Sequence Analysis System）、包括的完全長cDNAライブラリー作製などの一連の技術開発から、マウスの完全長cDNAのコレクションとそのシーケンスや発現解析を行い、2005年までに約10万クローンが高度に機能注釈付けされた。

  
  

  リボソーム ribosome あらゆる生物に存在する、細胞内でのタンパク質生合成の場 主にRNA（リボソームRNA）とタンパク質（リボソームタンパク質）から構成されている。 原核細胞：リボソームは細胞質に遊離の状態で存在する。 真核細胞：リボソームは小胞体膜に結合し、粗面小胞体を形成する。 リボソームの構成 リボソーム粒子 粒子構成 rRNA rタンパク質 70Sリボソーム（原核生物） 50Sサブユニット 5S, 23S 34種 30Sサブユニット 16S 21種 70Sリボソーム（古細菌） 50Sサブユニット 5S, 23S 40種 30Sサブユニット 16S 28種 80Sリボソーム（真核生物） 60Sサブユニット 28S, 5.8S, 5S 46種 40Sサブユニット 18S 32種 リボソームRNA ribosomal RNA：rRNA リボソームRNAはリボソームを構成するRNAであり、RNAとしては生体内でもっとも大量に存在する(7~8割程度)。 原核生物では沈降係数に由来する命名で23Sと5Sがリボソーム大サブユニット（50Sサブユニット）に含まれる。 真核生物の大サブユニット（60Sサブユニット）には一般に28Sと5.8S、5S rRNA、小サブユニット（40Sサブユニット）には18S rRNAが含まれるが、種によってその数字には若干の違いがある。 5S ribosomal RNA：5SrRNA 細菌などの原核生物の30Sサブユニットは16SのrRNA分子と21種類のタンパク質を含み、50Sサブユニットは23Sと5Sの2種類のrRNAと32種類のタンパク質を含んでいる。 120ヌクレオチド ヘアピンループ構造 5SrRNAはRNAポリメラーゼIIIにより転写される。 沈降係数　Svedberg unit S：沈降係数 沈降係数は、超遠心で物質が落ちる速度を調べることにより、その物質の大きさを調べるという操作をしたときの、落ちやすさ、落ちる速さを表している。 粒子の沈降係数sは、沈降過程、特に遠心分離におけるその挙動を特徴付けるために用いられる量であり、粒子に印加される加速度aに対する沈降速度vt（m/s、終端速度としても知られている）の比として定義される。 　　S=vt / a リボソームタンパク質　ribosomal protein 通常リボソーム表面に存在して折りたたまれたrRNAの隙間を埋めている。 リボソームタンパク質の主な役割はRNAコアの安定化である。 この他、翻訳の開始・終結地点の決定、翻訳の制御・維持などもタンパク質が行っている。 Translating Ribosomal Affinity Purification：TRAP法 リボソームを構成するタンパク質を細胞種特異的に標識し、そのタンパク質に結合している物質を結合したまま取り出す手法 Fos-Trap 活性化した神経細胞を、一過性に発現するFos遺伝子座を利用して、標識したり、遺伝子発現させたりするシステム

  リボソーム阻害剤　ribosome inhibitors　←→ペプチジルトランスフェラーゼ リボソームや翻訳を阻害する薬剤は生物のタンパク質の合成を停止させるために毒性を示す。 リボソーム阻害剤は病原細菌の増殖停止を目的にした感染症の化学療法薬にも利用されている。真正細菌とヒトなどの真核生物ではリボソームの構造が異なるため、真正細菌のリボソームにのみ特異的な阻害剤は、病原細菌に対する毒性は高いがヒトに対する毒性が低い、選択的治療薬として働くためである。 アミノグリコシド系抗生物質（ストレプトマイシン、ネオマイシンやテトラサイクリン、クロラムフェニコール）、アニソマイシンやマクロライド系抗生物質など 毒物のリシンはリボソームを不活性化することで毒性を発揮する。

  伸長因子　Elongation Factor：EF RNAからタンパク質を合成する「翻訳」において、ポリペプチド鎖の伸長を促進するタンパク質 EF-Tu(EF-1)はアミノアシルtRNAをリボソームのA部位に正しく供給し、EF-G(EF-2)は、次のtRNAが入れるように、リボソームのA部位の場所を空ける。 細菌 真核生物 はたらき EF-Tu EF-1 アミノアシルtRNA、GTPと結合し、リボソームのA部位にアミノアシルtRNAを供給する。 EF-G EF-2 GTPと結合し、リボソームのA部位に結合・遊離して次のtRNAのための場所を空ける。 ジフテリア毒素はEF-2を不活性化させることでタンパク質の合成を阻害する。

トランスクリプトーム　transcriptome　←→マイクロアレイ/RNA-Seq/CAGE法　参考1 細胞内における遺伝子転写産物（mRNA）全てを要素とする集合 「ゲノム」に対し、細胞内の全転写産物（全RNA）を「トランスクリプトーム」と呼ぶ。 転写を意味するTranscriptionとGenomeを組み合わせて作られた造語 ゲノムは原則として同一個体内のすべての細胞で同一だが、トランスクリプトームでは状況が異なり、同一の個体にあっても組織ごとに、あるいは細胞外からの影響に呼応して固有の構成をとる。 トランスクリプトームの大半はタンパク質の情報を持たないノンコーディングRNAであり、エピジェネティック制御やタンパク質合成制御、幹細胞性の制御など様々な機能に関わっている。 シークエンス解析によってDNA配列上で遺伝子と推定された部分について、細胞レベルでmRNA量を測定・解析し、生体細胞内における遺伝子の発現状況を網羅的に把握することを目的としている。 トランスクリプトミクス　transcriptomics トランスクリプトームを扱う学問 トランスクリプトミクスは生命を司る物質流転（メタボローム）を探求する上で残された重要な分野である。 シングルセルトランスクリプトーム解析、single cell transcriptomics：SCT　←→シングルセルRNAシーケンス マイクロエマルジョンごとに cell を封じ込め、その中でそれぞれ固有の分子バーコードを付加してライブラリー化する。 個々のcell 由来のトランスクリプトに固有のバーコードが付くので、解析結果として cell ごとのトランスクリプトーム情報が得られる。 メタボローム：metabolome 生物実験サンプル内で見つかった低分子化学物質の総体を指す呼称 メタボロームはタンパク質、RNA、DNAそして様々な階層の概念を含む。それはまた経路ネットワークを形成する小さな連携（回路）から構成される。広い見地に立てばメタボローム研究の成果は、産業上の価値がある代謝産物を生産する代謝工学技術を確立するとも言える。 生体内のメタボロームは一次代謝産物と二次代謝産物に分類することができる（特に植物もしくは微生物に言及する場合） 一次代謝産物は正常な成長、発達、複製に関わる。 二次代謝産物は直接 成長、発達、複製に関わることはないが生態学的に重要な機能を持つことがある（色素、抗生物質など）。 メタボローム解析 metabolomic analysis ＝ メタボロミクス　metabolomics メタボロミクスは分子生物学の一研究分野で、新陳代謝の実態および細胞、組織、器官、個体、種の各階層でそれぞれ微妙に異なる代謝経路の多様性の総体をバイオインフォマティクス的手法を基に研究する。 現在では細胞の働きを包括的に理解しようとするとき、これまでにも盛んに研究が行われてきているDNA 配列の網羅的解析（ゲノム解析）やタンパク質の網羅的解析（プロテオーム解析）に加えて、代謝物質の網羅的解析（メタボローム解析）が重要であると言われている。生命のロバストネスにより、マイクロアレイ解析で変化が観察されても、表現型に最も近いメタボローム解析をしてみると変化が見られないこともあるからだ。 ロバストネス、ロバスト性　robustness ある系が応力や環境の変化といった外乱の影響によって変化することを阻止する内的な仕組み、または性質のこと。 「頑強な」という意味の形容詞 "robust" が語源であり、他に頑強性、強靭性、堅牢性、強さ、などと呼称されることもある。 生物学におけるロバストネス：進化については諸説あるが、生物は種の生存のために生育環境の変化に対応して形態・形質を変化させ対応してきた。これは、世代交代を利用したロバストネスの現れ方の一つである。個体レベルでみると、免疫系や恒常性（ホメオスタシス）がロバストネスの典型的な例である。 プロテオーム：proteome　←→プロテアソーム/トランスクリプトーム ある細胞、組織に発現している全てのタンパク質の集合 1994年にできた「ゲノム」と同じレベルで使用される造語 タンパク質を意味する protein と「全体」を意味する -ome から作られた。タンパク質とプロテオームの関係は、遺伝子（gene）に対するゲノム （genome）のそれと対比できる。 ゲノムがある生物の持つ全ての遺伝子のセットを表すのに対して、プロテオームはある生物が持つ全てのタンパク質のセット、またはある細胞がある瞬間に発現している全てのタンパク質のセットを意味する。 一般にゲノムは同一生物種内では変化しないが、プロテオームは細胞の状態によって大きく変化する。遺伝子は情報であり、機能するためには発現する必要がある。タンパク質は遺伝子機能の多くを担っている分子であり、プロテオーム解析は生命現象を知る上で重要であると考えられている。 プロテオーム、トランスクリプトームは細胞や組織、そして時間毎にそのプロファイルが変化している。各種疾患モデル動物や、疾患細胞において、体系的かつ網羅的に遺伝子発現を解析することで、病態に特異的な遺伝子や分子の発現パターンを調べ、創薬におけるターゲット遺伝子やターゲット分子を同定することが可能となる。 ヒトゲノムに含まれる遺伝子数は2万〜2万5千個と推定される一方、ヒトのプロテオーム中のタンパク質総数は100万個以上と推定されている。 5%のプロテオームには、翻訳後修飾を果たす酵素が200種以上含有されると推定されている。これらの酵素には、キナーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、またはT4 DNAリガーゼ - 官能基、タンパク質、脂質または糖などを、アミノ酸側鎖へ追加あるいはアミノ酸側鎖から除去する；プロテアーゼ - ペプチド結合を切断し、特定配列または調節サブユニットを除去する。 プロテオーム解析を行うとともに、タンパク質の立体構造情報を活用すると、それら翻訳後修飾による多機能性が数多く示唆されるようになった。 プロテオーム解析 proteomic analysis ＝ プロテオミクス　proteomics←→バイオインフォマティクス/ゲノミクス/トランスクリプトミクス/メタボロミクス 構造と機能を対象としたタンパク質の大規模な研究のこと。 タンパク質は細胞の代謝経路の重要な構成要素として生物にとって必須の物質である。 「プロテオミクス」という言葉は、遺伝子を網羅的に研究する「ゲノミクス」という言葉と、タンパク質を意味する英語「プロテイン」とを合わせて作られた造語である。 多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用しており、プロテオミクス研究の目標の一つはこのタンパク質間相互作用を明らかにすることである。これは、新規に発見されたタンパク質の機能を推定する手がかりにもなる。これまでに多くの研究手法が考え出されてきた。 伝統的な方法の一つには酵母を使ったTwo-hybrid法があり、新しく開発された方法にはマイクロアレイ、アフィニティークロマトグラフィー、質量分析法などがある。 →翻訳後修飾　post-translational modification：PTMs

メタゲノム解析 「メタ」とは、「超越」を意味するメタ（meta-）に「ゲノム」を融合した造語であり、微生物群集を培養することなくそのままゲノムを精製して直接、シークエンスすることで網羅的に解析することをメタゲノム解析とよぶ。 ここでいう「網羅的」とは、サンプル中の微生物を単離したり培養することなくすべての細菌DNAを混合物として抽出し、菌株レベルではなくDNA集合体を網羅した状態で塩基配列を解読することである。その結果、培養法が不明で培養できない微生物のゲノム配列も得ることができ、バイオインフォマティクスに基づく解析で既知ではない細菌やその存在比率を推定することもできる。

Weighted Gene Correlation Network Analysis：WGCNA ゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルを用いて、ある遺伝子と他の遺伝子の発現パターンの類似性を、すべての発現遺伝子の組み合わせについて評価し、発現パターンの類似性を基準として遺伝子間のネットワークを抽出する手法 遺伝子発現量の相関を利用して、互いによく似た発現変動をする遺伝子同士のクラスターを発見する手法 遺伝子同士の発現パターンの類似性に基づいて、類似性の高い遺伝子の集まりを数十個程度の「モジュール」に分類することができる。

⭐︎遺伝子関連酵素　←→酵素

│DNAポリメラーゼ　 │RNAポリメラーゼ
│DNA-ligase 　→DNA ligase I　→TdT│TDG
│ヘリカーゼ/DNAヘリカーゼ　T抗原/MCM 　→DNA helicase B
│逆転写酵素　インテグラーゼ │制限酵素
│ヌクレアーゼ /DNase　→ジンクフィンガーヌクレアーゼ/TALEN/Cas9ヌクレアーゼ）
│ニッカーゼ │Dicer/DNAトポイソメラーゼ/RAG/DNA依存性プロテインキナーゼ
　→ZFNs/TALEN　→トランスポザーゼ
　→Cre
　→→チミジンキナーゼ/β‐ガラクトシダーゼ/アルカリフォスファターゼ/
　→→DNA helicase B 　→DNAメチル基転移酵素（DNMT）/TET 　→HDAC 　→ユビキチン転移酵素 　→FUT



DNAポリメラーゼ　DNA polymerase 1本鎖の核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列を持つDNA鎖を合成する酵素の総称 一部のウイルスを除くすべての生物に幅広く存在する。 DNA依存性DNA ポリメラーゼ　DNA‐dependent DNA polymerase DNA を鋳型としてDNA を合成する DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ DNA複製やDNA修復において中核的な役割を担う酵素である。 DNAプライマーゼ　DNA primase DNA依存性RNAポリメラーゼの一種 DNA複製においてRNA断片（プライマー）を合成する酵素 DNAポリメラーゼは合成中のDNA鎖の3'末端の水酸基に新たなヌクレオチドを付加する活性を持ち、これによってDNA鎖は5'→3'の方向に伸長する。一からDNA合成を開始できるDNAポリメラーゼは知られておらず、ヌクレオチドを付加するためのプライマーが必要である。 通常のDNA複製の際には、DNAプライマーゼが短いRNA鎖を合成し、これがプライマーとして用いられる。 DNAプライマーゼは複製フォークにおいてDNAヘリカーゼに結合し、ラギング鎖に対して11塩基ほどのプライマーを合成し、岡崎フラグメント合成の足がかりとなる。DNAを合成するのはDNAポリメラーゼであるが、この酵素は既にある核酸断片を延長することしかできないことから、DNAプライマーゼによるプライマーの生成はDNA複製において必須である。 DNAプライマーゼによって合成されたRNAプライマーは複製の進行とともに除去される。直鎖状染色体の最も末端部分（テロメア）では、プライマーが除去されたのち複製ができない。このため複製の度に染色体が短くなっていくという「末端複製問題」が提起されたが、テロメアを合成する酵素テロメラーゼが発見されたことで一部解決した。 RNA依存性DNAポリメラーゼpolymerase RNAを鋳型としてDNAを合成する。 セントラルドグマの範疇から逸脱する位置にある酵素で、逆転写酵素やテロメラーゼを含む。 DNAポリメラーゼは配列の類似性に基づき以下の7つのファミリーに分類されている。 Family A DNA複製やDNA修復に関わる酵素が含まれる。 複製系の酵素としては、非常によく研究されたT7 DNAポリメラーゼや、ミトコンドリアのDNAポリメラーゼ γ がある。 修復系の酵素としては、大腸菌のDNAポリメラーゼIや、Thermus aquaticusやBacillus stearothermophilusのpol Iなどがあり、除去修復や岡崎フラグメントの処理に関わっている。 Family B ほとんどが複製系の酵素で、真核生物のDNAポリメラーゼα, δ, εや、DNAポリメラーゼζなどを含む。 原核生物ではDNA複製に必須なDNAポリメラーゼが1つであるのに対して、真核生物では3つのDNAポリメラーゼ (α、δ、ε) が必要がある。　参考1/2 それ以外にT4・Phi29・RB69などのファージのDNAポリメラーゼも含む。 リーディング鎖とラギング鎖の両方の合成に関わる。 このファミリーの酵素は強い3'-5'エキソヌクレアーゼ活性があり、複製が正確なことが特徴であるが、αとζに関しては例外で校正活性を持たない。 Polα ラギング鎖を合成している。 唯一プライマーゼと複合体を形成して いて、新生DNA鎖の合成を司っている。 Polδ ラギング鎖を合成している。 DNAヘリカーゼに結合 PCNAはPolδのコファクターとして機能し、リーディング鎖のDNA複製に関与するホモ三量体タンパク質（261アミノ酸；29kDa）、S期のマーカー Polε リーディング鎖を合成している。 T4 DNAポリメラーゼ　←→平滑末端クローニング/blunt end ligation/T4 DNAリガーゼ T4ファージ由来のDNAポリメラーゼ 鋳型ssDNAとプライマーssDNAの存在下、プライマーの3'ヒドロキシル基に相補鎖を合成する（5'→3'合成活性）ポリメラーゼ 同時にssDNA特異的な3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持っている。 DNAフラグメントの末端の平滑化に用いられる。 T4ファージ　T4phage 大腸菌を宿主とするT偶数系ファージの代表で、糖で修飾された環状の二本鎖DNAをゲノムにもつ。 分子生物学の初期から研究材料として用いられていてT4ファージ由来のT4 DNAリガーゼ、T4 DNAポリメラーゼやマーカーなどの遺伝子組換実験用の酵素が組み換え体から作られる。 Family C 基本的には細菌の染色体複製に関わる酵素である。 大腸菌のDNAポリメラーゼIIIのαサブユニットはヌクレアーゼ活性がなく、別のαサブユニットが3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を提供している。 Family D まだよく研究されていないが、全てが古細菌のEuryarchaeotaから見出されており、複製系の酵素だと考えられる。 Family X 真核生物のpol β、pol σ、pol λ、pol μなど、また末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT)を含む。 pol βは塩基が欠落した箇所を修復するのに必要である。 pol λとpol μはDNA二重鎖切断を修復する非相同末端結合に関わる。TdTはリンパ組織におけるVDJ組換の際に数塩基を追加して免疫学的多様性を増大させるのに関わっている。 出芽酵母の唯一のfamily XポリメラーゼであるPol4もまた、非相同末端結合に関わっている。 Family Y 無損傷のDNAに対する忠実度が低く、逆に損傷を受けたDNAでも複製できる点にある。損傷乗り越え複製(translesion sythesis; TLS)によってエラー無しに、もしくはエラーを無視して無視して複製できるようになるが、後者の場合変異率は上昇する。 色素性乾皮症のバリアント型(XPV)の患者は、UV損傷をエラー無しに修復できるPol ηに変異があり、変わりにエラーを無視するPolζ（これはfamily Bのポリメラーゼである）が働くため、発がんしやすい傾向がある。 ヒトには他にPol ι・Pol κ・Rev1というメンバーが知られている。大腸菌ではPol IV (DinB)とPol V (UmuDC)が知られている。 Family RT RNA依存性DNA ポリメラーゼであり、レトロウイルスや、真核生物のテロメラーゼが該当する。 耐熱性DNAポリメラーゼ　Taq DNA polymerase　←→PCR 好熱菌 Thermus aquaticus が産生するDNAポリメラーゼ（EC.2.7.7.7） 熱水噴出孔に生息しているThermus aquaticusに因んでTaqと名づけられた。 90°C以上の高温でも比較的安定な耐熱性DNAポリメラーゼの発見により、PCR法はとても簡単になった。 タンパク質は熱に弱いので、高温でタンパク質の変性する。DNAを「2本鎖→1本鎖」にする過程で、従来のDNAポリメラーゼが失活してしまうので、サイクル毎にDNAポリメラーゼを補充しなければならなかった。 耐熱性DNAポリメラーゼは約94°Cの高温でも活性を失わないため、DNAポリメラーゼを一回入れるだけで済むようになった。 polI型ポリメラーゼ 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（Proof reading活性）を有さない Thermus aquaticus由来一本鎖 DNA結合タンパク Thermus aquaticus single-stranded DNA binding protein ：SSB DNA結合タンパク SSBは、耐熱性タンパク質で、単鎖DNAに結合し二本鎖DNAにはほとんど結合しない。DNA複製やDNA組換えに重要な役割を果たす。 テルムス・アクウァーティクス　Thermus aquaticus　参考1 グラム陰性桿菌好気好熱性の真正細菌 学名はラテン語とラテン化されたギリシャ語で、「水中に棲む、熱を好む菌」といったほどの意味がある。 1969年にイエローストーン国立公園から発見された。増殖温度は40-79℃で、当時としては非常に高かった。至適増殖温度70-72°Cは、それまで知られていたGeobacillus stearothermophilus（55-60°C）よりも10°C以上高いものであった。 形態は0.5-0.8μm×5-10μmの細長い桿菌で、鞭毛を持たず、運動性はない。トリプトンや酵母粉末などを主体とする、中性からややアルカリ性の培地でよく増殖する。糖類、アミノ酸、有機酸などを吸収して好気・従属栄養的に増殖する化学合成従属栄養生物である。 分布域は非常に広く、世界中のかなり広範囲の熱水系から分離されており、陸地海洋双方の熱水噴出孔、温泉、人工熱水環境など広い熱水環境に及んでいる。 高い好熱性から産生するタンパク質の耐久性も高く、多くの酵素類が実用化されている。特に、DNAポリメラーゼのTaqポリメラーゼ、制限酵素のTaqIは広く知られている。 ブレンドTaq® Blend Taq® Taq DNA polymeraseおよびPfu-X DNAポリメラーゼの混合物 校正機能付き(Proof reading活性を有する)α型ポリメラーゼ クレノウ断片 Klenow fragment　←→サンガー法　参考1/2 大腸菌のDNAポリメラーゼIをタンパク質分解酵素スブチリシンで部分分解して得られる断片のうち、大きな方の断片である。 DNAポリメラーゼIが持つ3種の活性（DNAポリメラーゼ、5'→3'エキソヌクレアーゼ、3'→5'エキソヌクレアーゼ）のうち、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が失われている。 Hans Klenow（デンマークの生化学者）とHenning Jacobsenが1970年に報告したことに因んで名づけられた。 大腸菌からDNAポリメラーゼIを精製する手法は1969年にJovinらが確立していたが、クレノウがこれを追試したところポリメラーゼ活性を持つ2種類のタンパク質が得られた。1つはJovinのポリメラーゼと同じだと思われたが、もう1つは分子量約7万と小さかった。この小さなタンパク質にもDNAポリメラーゼ活性があったが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はなかった。そこで大きな方のポリメラーゼをスブチリシンで処理したところ、同じく分子量約7万で5'→3'エキソヌクレアーゼ活性のない断片が得られた。 クレノウ断片はPCRが開発された当初に使われたポリメラーゼでもあったが 、その後はTaqポリメラーゼなどの耐熱性酵素に取って代わられた。

RNAポリメラーゼ　RNA polymerase リボヌクレオチドを重合させてRNAを合成する酵素 DNAの塩基配列を読み取って、相補的なRNAを合成する酵素で、遺伝子発現（セントラルドグマ）の第一段階をつかさどる生命活動に必須の酵素 複数のタンパク質（サブユニット）が集合してできた巨大な複合体で、細菌からヒトまで共通した“カニのはさみ”のような形をしている。 中央にできた溝にDNAを挟み込み、約10塩基対のDNAをほどいて「転写バブル」を形成し、一方の鎖を鋳型にしてRNAを合成する。 RNAポリメラーゼによってDNAから合成されるRNAの方向は5´→3´である。転写はDNAのプロモーターにRNAポリメラーゼが結合することで開始する。 DNA依存性RNAポリメラーゼ DNAの鋳型鎖(一本鎖）の塩基配列を読み取って相補的なRNAを合成する反応(転写)を触媒する中心となる酵素 真核生物の場合、RNAポリメラーゼはPolI、PolII、PolIIIの３種類存在し、３つのクラスのプロモーターが存在している。 PolIが働くクラスIプロモーターからはrRNA、PolIIが働くクラスIIプロモーターからはmRNA、PolIIIが働くクラスIIIのプロモーターからはtRNAを中心とする低分子RNAが転写される。 RNAポリメラーゼI　Pol I 35S rRNA前駆体を転写するRNAポリメラーゼI 細胞内局在：核小体 Pol Iが働くクラスIプロモーターからはrRNAが転写される。 RNAポリメラーゼII　Pol II 真核生物で、DNAを鋳型にしてmRNAやsnRNA遺伝子の多くを転写するRNAポリメラーゼ 細胞内局在：核質 真核生物の核内でメッセンジャーRNA（mRNA）の転写を担う酵素 多数のサブユニットからなる巨大なタンパク質複合体 転写の過程においてPol IIは、さまざまなタンパク質と結合することでさらに巨大な複合体となって機能している。 Pol IIが働くクラスIIプロモーターからはmRNAが転写される。 RNAポリメラーゼIII　Pol III tRNAとU6 snRNA、5SrRNA前駆体等を転写するRNA ポリメラーゼIII 細胞内局在：核質 Pol IIIが働くクラスIIIプロモーターからはtRNAを中心とする低分子RNAが転写される。 RNAを鋳型にRNA を合成するRNA依存性RNAポリメラーゼもあり、多くのRNAウイルスで重要な機能を果たす以外に、microRNAの増幅過程にも利用される。 ポリA合成酵素　ポリAポリメラーゼ　ポリアデニル酸ポリメラーゼ　polyA polymerase ポリAの尾を作るのに関わっている酵素 ポリ(A)シグナルを認識し、mRNAの３’末端にポリ（A)を合成する酵素

DNAリガーゼ、DNAライゲース DNA ligase　←→DNA ligase I ＝ポリデオキシリボヌクレオチドシンターゼ、ポリヌクレオチドリガーゼ DNA鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素 生体内では主としてDNA複製とDNA修復に寄与している。 遺伝子工学で組換えDNAを作るために頻繁に利用されている。 一般的なDNAリガーゼは、二重らせん構造の中で隣り合う3'-水酸基と5'-リン酸基の間をリン酸ジエステル結合でつなぐ。 DNAの3'末端（アクセプター）と、DNAの5'末端（ドナー）との間にリン酸ジエステル結合をつくる。よく知られている真核生物やファージの酵素では反応にATPを必要とする。 ATPが酵素の活性中心のリジン残基に結合してAMPとなり、ピロリン酸が放出される。 AMPがDNA5'末端のリン酸基に転移され、ピロリン酸結合を生じる。 5'末端のリン酸基と3'末端の水酸基との間にリン酸ジエステル結合を生じ、AMPが放出される。 DNA ligase I：LIG1 DNA複製に関わる因子の一つ。DNAの複製のときに、岡崎フラグメントという短いDNA断片をつなげる酵素としての重要な役割を持つ。この酵素が岡崎フラグメントをつなげることでDNAの複製が完了する。 S期後期からG2期初期に発現し複製されたDNAの結合に関与する。 T4 DNAリガーゼ　T4 DNA Ligase　←→T4 DNAポリメラーゼ T4ファージのDNAリガーゼ 効率は低いもののDNA/RNAハイブリッドに対して作用することもでき、このときDNAリガーゼだけでなくRNAリガーゼとしても機能することができる。 T4 DNAリガーゼはミスマッチ塩基を含むようなDNAに対して作用することができ、また相補部位のない独立したDNA分子2つを結合することが出来るなど、二重らせん構造という観点で許容度が高い。 非常に効率は低いが、一本鎖DNAも結合することができる。 T4 DNAリガーゼは、隣接したDNAの5'端のリン酸基と3'端の水酸基をのホスホジエステル結合によって連結する酵素で、Mg2+とATPを要求する。 T4 DNAリガーゼ平滑末端及び突出末端の2本鎖DNA、またはニックの入った2本鎖DNAに作用するが、RNAとRNAや、RNAとDNAにはほとんど作用しない。

末端デオキシヌクレチドトランスフェラーゼ、terminal deoxynucleotidyl transferase ：TdT 一本鎖または二本鎖DNAの3’-OH末端にデオキシヌクレオチドを重合する反応を触媒する酵素 プライマーとなるには最低3塩基以上のオリゴデオキシヌクレオチドが必要である。 通常TdTは多数のデオキシヌクレオチドをDNA鎖3 '末端に付加するが、1〜3ヌクレオチドの取り込みしか起こらないように反応を最適化することができる。 TdTは鋳型を必要とせずDNA配列による影響も受けないが、DNA構造は重要な要素となる。 TdTは一本鎖DNAの3'末端に対して最も高い活性を示すが、二本鎖DNAの3'オーバーハングに対しても低い効率で修飾することが可能 TdTは平滑末端または5 'オーバーハングを有する二本鎖DNAに対しても低い活性を示す。 TdTで修飾するDNAテンプレートとしては、未標識の一本鎖PCRプライマーや、3 'オーバーハングを有する二本鎖の制限エンドヌクレアーゼフラグメントなどが一般的 TdT活性とは2本鎖DNAの平滑末端の3'末端にヌクレオチドを1つだけ付加する活性 PCR反応で用いられるTaqなどがTdT活性をもっている。 平滑末端の3'-OHにヌクレオチドを1つだけ付加するため、PCR産物も3'突出となる。基質としてdNTPを用いてもアデニンが選択的に付加される。 平滑末端同士をつなぐブラントライゲーションの場合は、TdT活性による突出末端がライゲーション効率を落としてしまうため、T4 DNAポリメラーゼなどで末端の平滑化を行うと良い。 一方、Tベクターを用いたTAクローニングは、この突出したAを活用してライゲーションする方法である。 オーバーハング 上部が下部よりせり出した構造のこと 分子生物学では、dsDNAやdsRNAの突出している部分、あるいは突出している部分の配列をオーバーハングと呼ぶ。 ベクターとインサートをリガーゼでライゲーションする場合、相補的なオーバーハングを持つ２つの末端はライゲーションの特異性と効率が高い。インサートの向きを決めたい場合などには末端を異なる２種類の制限酵素で消化する。

チミンDNAグリコシラーゼ　Thymine DNA glycosylase：TDG　←→DNA脱メチル化/APOBEC T/Gミスマッチ部位を認識し、N-グリコシド結合を切断してチミンを除去する酵素 脱塩基部位は塩基除去修復系により修復される。 5caCや5hmUを除く活性も報告されている。

ヘリカーゼ、ヘリケース　helicase 核酸のリン酸エステル骨格に沿って動きながら絡み合う核酸をほどく酵素の総称 すべての生物に必須な酵素 DNA複製、DNA修復、DNA組換え、転写、翻訳、スプライシングなど、遺伝情報を扱う様々な過程で対合している核酸をほどく必要がある。 ATPの結合と加水分解によって起こるコンホメーション変化により、二本鎖DNAを巻き戻すモータータンパク質 ATPやGTPを加水分解して得られるエネルギーを使って塩基間の水素結合を解消し、DNAの二重らせんや二次構造を取ったRNAなどをほどく働きをしている。 ヘリカーゼは、片方の鎖に沿って種類毎に決まった方向に動きながら働く。 ヘリカーゼは1976年に初めて報告され、大腸菌のtraI遺伝子の産物である。1978年にはユリから真核生物で初のヘリカーゼが報告されている。1967年には大腸菌のRepタンパク質が見つかっているが、これがヘリカーゼだと明らかになるのは1979年になってからのことである。 DNAヘリカーゼ　←→DNA helicase B DNAの2本鎖をほどく酵素 DNA複製フォークの進行に伴う超らせんを解消する酵素 DNA複製ヘリカーゼは一般に、DNAの二重らせんの一方の鎖を囲むように1個の六量体を形成し、その鎖に沿って動きながら相補鎖を剥がすように外して、DNAらせんをほどく（立体排除と呼ばれる）。 必須複製開始タンパク質　replication initiator protein：Rep 大腸菌を宿主とするColE2プラスミドの複製開始因子 分子量が小さいにも関わらず、たった一分子でDNAの2本鎖をほどき、RNAプライマーを合成し、DNA合成酵素を呼び込むというユニークなタンパク質 ColE2プラスミドの複製系では、Repが複製開始点に特異的に結合してプライマーRNAを合成し、宿主大腸菌のDNA合成酵素Iがこれを利用してDNA合成を開始する。 RNAヘリカーゼ RNAの二次構造をほどく酵素 　→RIG-I DNAトランスロケース 構造上ヘリカーゼに類似しているがDNA上を動くだけで核酸をほどかない酵素 T抗原　T antigen：T-ag がん抑制経路にかかわるp53やRBを妨害する。 ラージT抗原：LTag　参考1 SV40 large T antigen、Simian Vacuolating Virus 40 TAg サルSV40のDNA複製ヘリカーゼ DNA型腫瘍ウイルスであるシミアンウイルス40（SV40）がコードするタンパク質 LTagは、腫瘍抑制因子（pRBやp53など）やその他の重要な細胞タンパク質の機能を変化させることによって細胞を悪性転換し、動物に腫瘍を発生させる。 LTagは、ウイルスゲノムの複製起点をゆがめ、融解してDNA二本鎖をほどく分子装置でもある。したがってLTagは、真核生物のMCM（ミニ染色体維持）複合体の機能的相同体といえる。 DNAヘリカーゼ活性をもつ。 X線構造解析からp53結合表面が同定でき、六量体形成の構造基盤が明らかになる。六量体の中央には、並はずれて大きな空洞を持つ正電荷を帯びた長いチャネルがあり、これが一本鎖DNA、二本鎖DNA両方に結合する。この六量体は二層になっており、層と層をつなぐαヘリックスを介してそれぞれが相対的に回転することでチャネルが伸び縮みできる。この動きが「絞り」のような働きをして、複製フォークで複製起点をゆがめて融解し、DNAをほどくのに使われるらしい。 2個の六量体が重なり合った形で機能し、中央の穴を通る二本鎖DNAを少しずつ押し動かして、一本鎖DNAを横方向へはみ出させると報告されている。* 六量体2つが重なった構造を形成し、その中央にDNAの二重らせんが通って、ほどけた一本鎖DNAが横に押し出されると考えられていた。 * シミアンウイルス40　simian Virus 40：SV40　←→COS細胞 アカゲザルなどから分離された腫瘍ウイルス：アカゲザルのポリオーマウイルス ポリオワクチンを産生していたアカゲザル腎臓細胞に感染しているウイルスとして発見された。 高等動物細胞用のベクターや発がん機構の研究に利用される。 SV40は霊長類の細胞に感染してウイルスを取り込ませ、細胞内にDNAの環を放出する。 SV40は環状のゲノムであり、細胞内において一握りのヌクレオソームを傷つける「小型染色体」として見出される。 カプシドに収まるために、たった数種の機能に関する遺伝情報しかコードできない。T抗原と３種類のカプシドタンパク質　VP1、VP2、VP3をコードする領域がある。 SV40の研究から、最初にエンハンサーが発見された。 ミニ染色体維持タンパク質　minichromosome maintenance protein ミニ染色体維持ヘリカーゼ　minichromosome maintenance replicative helicase ミニ染色体維持複合体　minichromosome maintenance comple：MCM複合体 ミニ染色体　mini chromosome 突然変異や遺伝子組み換えを利用し、本来の染色体のかなりの部分を欠失して小型化した（させた）染色体 生育に最低限必要な遺伝子領域を決定するなどの目的で作られる。 ゲノムDNA複製に必須のDNAヘリカーゼ 真核生物MCMは、ヘテロヘキサマーを形成する6つの遺伝子産物、MCM2〜7からなる。 MCMヘリカーゼはDNA複製において中心的な役割を果たし、複製フォークで種々のタンパク質と相互作用しつつ、巨大な複製フォーク複合体を形成し、複製フォークの進行と安定な維持を担っている。 細胞分裂の重要なタンパク質として、S期開始およびS期停止チェックポイントなどの様々なチェックポイント経路の標的でもある。 MCMヘリカーゼの負荷および活性化の両方が厳密に調節され、細胞増殖サイクルに結合される。 MCM機能の調節緩和は、ゲノム不安定性および様々ながん腫に関連している。 真核細胞では染色体の恒常性を保つため、MCM複合体が1細胞周期につき1度だけクロマチン上に結合することにより、複製開始点がライセンス化される。 真核細胞ではゲノムを安定に維持するために、細胞が有糸分裂を完了したあとにのみDNA複製が許可され、DNA合成（S期）は細胞周期ごとに1回だけ行われるようになっている。このDNA複製を許可する分子機構（ライセンス化）の制御には、MCMタンパク質のクロマチンへの結合を仲介するタンパク質Cdc6（分裂酵母ではCdc18）が必要だと考えられている。

逆転写酵素 reverse transcriptase　←→RT-PCR/CAGE法 RNAを鋳型して、その遺伝情報をDNAに転写する酵素 RNA依存性DNAポリメラーゼ マイクロアレイ解析や遺伝子の機能解析に必須である。 逆転写反応 reverse transcriptionを触媒する酵素 レトロウイルスは逆転写酵素を持っていて、自身のRNA遺伝子をDNAへと変換して宿主ゲノムへと侵入する。 1970年、Howard Martin Temin（1934年〜1994年　米国の遺伝学者、ウィスコンシン大学マディソン校、Renato Dulbeccoの弟子）とDavid Baltimore（1938年3月7日〜　米国分子生物学者、マサチューセッツ工科大学、ソーク研究所でRenato Dulbeccoの指導を受けた。）がそれぞれ別の研究から逆転写酵素を発見し、1975年にノーベル生理学医学賞を受賞した。 逆転写酵素は一本鎖RNAを鋳型としてDNAを合成（逆転写）するもので、レトロウイルスの増殖に必須の因子として発見された。 それまで、DNAはDNA自身の複製によって合成され、遺伝情報はDNAからRNAへの転写によって一方向にのみなされると考えられていた（セントラルドグマ）が、この酵素の発見により遺伝情報はRNAからDNAへも伝達されうることが明らかとなった。 インテグラーゼ、インテグレース　integrase 部位特異的組換え酵素：細菌に感染するウイルス（バクテリオファージ）がコードしている遺伝子組換え酵素 逆転写酵素 レトロウイルス（HIVを含む）により産生される酵素であり、感染細胞のDNAにレトロウイルスの遺伝物質を取り込ませることを可能にする。 インテグラーゼは二本鎖DNAに組み込まれたウイルス（プロウイルス）によっても同じ目的のために産生される。 インテグラーゼはプレインテグレーション複合体（PIC）の重要な要素の1つである。 モロニーマウス白血病ウイルス 逆転写酵素：MMLV RT　←→モロニーマウス白血病ウイルス トリ骨髄芽球症ウイルス 逆転写酵素：AMV RT　←→

ヌクレアーゼ nuclease 核酸分解酵素の総称 デオキシリボ核酸ないしリボ核酸の糖とリン酸の間ののホスホジエステル結合を加水分解する。 エキソヌクレアーゼ　exonuclease 核酸の切断される位置の塩基配列に高い特異性がない酵素 核酸分子の末端から順々に切断を行う酵素 ポリヌクレオチドを5′末端もしくは3′末端から順次加水分解していくヌクレアーゼ DNAのリン酸化エステル結合の加水分解を触媒することにより、一本鎖DNAの3’-OH末端から5’-モノヌクレオチドを遊離させる3’→5’エキソヌクレアーゼである。 エンドヌクレアーゼ　endonuclease 核酸の切断される位置の塩基配列に高い特異性がない酵素 核酸分子の中間を切断する酵素 ニッキングエンドヌクレアーゼ 核酸鎖を両端ではなく内部のリン酸ジエステル結合を加水分解することで切断する酵素 配列特異性のある制限酵素や、特異性のないDNaseIなどが含まれる。 デオキシリボヌクレアーゼ deoxyribonuclease：DNase　→Cas9 ヌクレオチド結合を切る酵素 デオキシリボ核酸ののホスホジエステル結合を切断して、オリゴヌクレオチドないしモノヌクレオチドに分解する一群の酵素の総称 エキソデオキシリボヌクレアーゼ　exodeoxyribonuclease DNA鎖の末端からヌクレオチドを削っていく酵素 デオキシリボヌクレアーゼI DNase I、EC 3.1.21.1 1本鎖DNAおよび二本鎖DNAを分解し5’リン酸基を含むモノヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドを生じる反応を触媒する酵素 エンドデオキシリボヌクレアーゼ　endodeoxyribonuclease DNA鎖の内部で切断したり、ニックを入れる酵素 DNAの分解・除去を目的として使われる。 デオキシリボヌクレアーゼII, EC 3.1.22.1 3'側ののホスホジエステル結合を分解するものと5'側から分解する酵素 リボヌクレアーゼ ribonuclease：RNase リボ核酸を分解してオリゴヌクレオチドあるいはモノヌクレオチドにする反応を触媒する酵素 あらゆる生物に遍く存在する酵素で、内部からRNAを分解するエンドリボヌクレアーゼ、外側から分解していくエキソリボヌクレアーゼの2種に分類される。 塩基を識別して分解を行う基質特異性の高いものもあり、種類は多様である。主なものとして塩基の種類を問わないリボヌクレアーゼT2やピリミジン塩基のある部分だけ切断するリボヌクレアーゼA、グアニンの部分のみを分解するリボヌクレアーゼT1などがあげられる。 mRNAなどの必要なRNAはリボヌクレアーゼインヒビターによってリボヌクレアーゼによる分解をまぬがれている。 小さく安定で結晶化しやすいため、生化学研究において重要な酵素とされてきた。 リボヌクレアーゼは一次構造が最初に特定された酵素として歴史に残っていて、これを決定した三人の化学者はノーベル化学賞を受賞している。 Christian Anfinsen（1916/3/26〜1995/5/14, アメリカの生化学者）、Stanford Moore（1913/9/4〜1982/8/23, アメリカ人の生化学者）とWilliam Howard Stein（1911/6/25〜1980/2/2, アメリカ人の生化学者）「リボヌクレアーゼの研究、特にアミノ酸配列と生物学的な活性構造の関係に関する研究」によって、1972年にノーベル化学賞を受賞した。 　Christian Anfinsenはアミノ酸配列が折りたたまれたタンパク質の構造を決めていることを示した。 　Stanford MooreとWilliam Howard Steinは特有のアミノ酸配置が酵素の触媒中心に使われていることを示した。 Robert Bruce Merrifield（1921/7/15日〜2006/5/14 アメリカの化学者）初めて合成した。1984年にノーベル化学賞を受賞した。 Sidney Altman（1939/5/7〜　カナダ生まれの分子生物学者）とThomas Robert Cech（1947/12/8〜　アメリカの分子生物学者、生化学者）はRNAの触媒機能の発見により1989年にノーベル化学賞を受賞した。RNA分子が触媒活性を持つことが、AltmanとCechによって独立に相次いで発見された。Altmanは、RNase PのRNA成分が活性を担っていることを明らかにし、一方、CechはテトラヒメナのグループIイントロンが自己切断を起こすことを発見した。 RNase A EC 3.1.27.5 エンドリボヌクレアーゼ 研究に広く使用されるRNaseである。 RNase A （たとえばbovine pancreatic ribonuclease A: PDB 2AAS）は研究室で一般に用いられる酵素の中で最も丈夫なもののひとつであり、RNase Aを精製する方法の一つに、細胞の抽出物を煮沸しRNase A以外のすべての酵素を変性させるというものもあるほどである。 RNase Aは一本鎖RNAの配列に特異的であり、一本鎖のC残基またはU残基（ピリミジン残基）の3'末端を切断して、3'末端リン酸化物を生じる。 RNase H EC 3.1.26.4 DNA/RNAハイブリッド二本鎖を形成しているRNAを切断し、一本鎖DNAを生じるリボヌクレアーゼである。 RNase Hは非特異的なエンドヌクレアーゼであり、加水分解によってRNA切断を触媒する。酵素に結合した二価金属イオンはその活性を助ける。RNase Hは5'末端リン酸化物を生じる。 RNase I EC number 3.1.?? エンドリボヌクレアーゼ RNase I は1本鎖RNAの3'末端で全てのジヌクレオチド結合を切断し5'-ヒドロキシル末端, 3'-リン酸末端を作る。このとき中間産物として2',3'環状モノリン酸が生じる。 リボヌクレアーゼインヒビター　Ribonuclease inhibitor：RI 450残基、49kDa、等電点4.7のタンパク質 ロイシンリッチリピートを持ち、特定のリボヌクレアーゼと非常に強固な複合体を形成する。細胞内に0.1%程存在する主要細胞内タンパクであり、RNAの寿命の制御に重要な役割を果たす。 リボヌクレアーゼは特にがん細胞に対して毒性、増殖抑制効果を示すため、がん治療薬としての研究が続けられているが、RIはどこにでも存在し、RIと結合したリボヌクレアーゼは効果がないことから、これを回避する手段が不可欠となる。 →ジンクフィンガーヌクレアーゼ/TALEN/Cas9ヌクレアーゼ

制限酵素 restriction enzyme, restriction endonuclease 2本鎖のDNAを切断する酵素 原核生物や、一部の真核細胞が持つ防御系の一つで、DNAの特定配列を認識する酵素 制限酵素はDNA中にあるそのパターンを認識し、その付近あるいはその配列の内部で切断する。 DNAの特異的な塩基配列を認識して切断するエンドヌクレアーゼ 制限酵素の「制限」とは：感染したファージの外来DNAは切断するが、自身のゲノムDNAにはメチル化などの修飾が起こっていて、自身のゲノムDNAの切断が制限されているという意味。制限酵素はバクテリアがファージから自らの身を守る、防御機構を司る分子である。 様々なDNA配列に対する制限酵素が知られていて、遺伝子組換え技術の中核となる酵素 必須因子や切断様式により3種類に大別されるが、そのうちのII型酵素が遺伝子組み換えに多用される。 切断された切り口には2種類あり、その形状により平滑末端と粘着末端と呼ばれる。 制限酵素に関するこの先駆的な業績に対し、Daniel Nathans、Hamilton Smith、Werner Arberは1978年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。 I型制限酵素 特定の配列を認識して、そこから400〜7000bp離れた適当な場所を切るヌクレアーゼ R・M・Sの3種のサブユニットから成っていて、Rが切断活性、Mがメチル化活性、Sが配列特異性を担っている。 特異的な認識部位でDNAに結合し、メチル化されていないDNAに対してはATP要求性のヌクレアーゼとして、片鎖がメチル化されているDNAに対してはS-アデノシルメチオニンを要求するメチラーゼとして働く。認識部位が特異的であるのに対し、二本鎖DNAの切断部位は認識部位から様々な距離（400〜7000bp）で起こる。 切断部位に再現性が乏しく、またDNAのメチル化を引き起こすため、遺伝子工学には使えない。 遺伝的相補性によりAからDのサブタイプが定義されている。 メチラーゼ　Methylase, Methyltransferase, MTase　←→DNMT 大腸菌などのバクテリアにおける制限修飾系として知られる酵素のうち、メチル化修飾を行う酵素 遺伝子工学実験で用いられるのは、核酸の特定の塩基配列を認識し、特定部位をメチル化するTypeIIの制限修飾系メチラーゼである。 制限修飾系、R-M系　restriction-modification system 生体防御系の一つで下等生物にみられる修飾系 自身のDNAをメチル化などで修飾する修飾酵素と、DNAの特定配列を認識切断するが、修飾を受けた部位は切断しない制限酵素の組み合わせから成り、外部から侵入したDNAを選択的に切断分解する。 II型制限酵素　Type II restriction endonucleases 遺伝子工学の実験に広く利用されている制限酵素 特定の配列を認識して特定の位置で切断するヌクレアーゼ 通常はメチラーゼとは独立している。 酵素反応には、Mg2+が必須で、切断点は認識部位内かそのごく近傍に限定されている。 II型制限酵素によって認識される塩基配列のパターンの多くはパリンドローム(回文)になっていて、5'端側から読んでも、その相補鎖の5'端から読んでも同じ配列になっている。この酵素の発見によりDNAの加工ができるようになり、遺伝子組み換え実験が可能となった。 IIS型 Type IIS 2本鎖のうち、少なくとも片方が認識部位より外側で切断する酵素 FokI 　←→TALEN 非回文配列を認識して、認識配列から離れたところを特異的に切断する酵素 海洋性細菌Flavobacterium okeanokoitesからクローニングされた、FokI遺伝子を有するE. coli株由来の制限酵素 EcoRI　（pronounced "eco R one"） 最も代表的なII型制限酵素 Paul Delos Boyer（1928〜　カリフォルニア大学の生化学者、「アデノシン三リン酸 (ATP) の合成の基礎となる酵素機構の解明」により1997年にノーベル化学賞受賞）の研究室で、1972年に大腸菌から単離された制限酵素 大腸菌（Escherichia coli）のR株から見つかった1番目の制限酵素ということで、「EcoRI」と命名された。 認識部位 切断様式 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G ---- AATTC---3' 3'---CTTAA ---- G---5' Hind III　ヒンディースリー　←→DNA分子量マーカー II型制限酵素の一種で、EcoRIと並び、制限酵素としては最も代表的なものの一つ ヘモフィルス-インフルエンザ菌のd株（Haemophilus influenzae d）から単離され、この菌株名より命名された。 遺伝子中の　5'-AAGCTT-3'　という6塩基配列を認識し、AとAの間に切れ目を入れ、切り口に粘着末端を作り出す。 認識部位 切断様式 5'-AAGCTT-3' 3'-TTCGAA-5' 5'-A ---- AGCTT-3' 3'-TTCGA ---- A-5' MmeI Methylophilus methylotrophus (W.J. Brammar)からクローニングされたMmeI遺伝子を有する大腸菌由来 エンドヌクレアーゼ認識部位 TCCRAC(20/18) XmajI AvrII C/CTAGG TaqI　←→Taqポリメラーゼ II型制限酵素の一種 高度好熱細菌 Thermus aquaticus から1978年に単離された、耐熱性酵素 遺伝子中の　5'-TCGA-3'　という4塩基配列を認識し、TとCの間に切れ目を入れ、切り口に粘着末端を作り出す。 III型制限酵素 認識配列から２〜30bp離れた、これも適当な部位を切断するヌクレアーゼ ModとResと呼ばれる2つのサブユニットから構成されており、Modが配列の認識とS-アデノシルメチオニンを用いたメチル化を行う。 ResはDNA切断に必要なサブユニットだが、単独ではヌクレアーゼ活性を持っていない。 認識配列は逆位反復になっている必要があり、その両方がメチル化されていない場合のみ片方から約25bp離れた位置をATP要求的に切断する。

ニッカーゼ nickase　←→ニック/Cas9 Nickase 2本鎖DNAの片鎖にnickを入れるDNA切断酵素

Dicer miRNAやsiRNAなどの小分子RNAの生成において中心的なRNA切断酵素

DNAトポイソメラーゼ　DNA topoisomerases　←→トポイソメラーゼ阻害薬 2本鎖DNAの一方または両方を切断し再結合する酵素の総称 環状の2重鎖DNAでは、2本の鎖は位相幾何学（トポロジー）的には結び目があるのと等価であり、ねじれ数（リンキング数）の異なるDNA、つまりトポアイソマー（トポロジーの異なる異性体）は、DNA鎖を切らない限り互いに変換できない。 トポイソメラーゼはこの変換（topoisomerization）を触媒する異性化酵素という意味で命名された。 抗がん剤や抗生物質のターゲットとしても知られる。 Ⅰ型トポイソメラーゼ　type I topoisomerase DNAの二重らせん構造のうち1本を切断し、再結合に関与する。 Ⅰ型トポイソメラーゼの反応では、DNAの2本鎖のうち一方が切断されその切れ目の間をもう一方の鎖が通過する。 切れ目が再結合すると、リンキング数は一つ変化する。反応はATPを要求しない。 I 型トポイソメラーゼは、主に複製や転写の際に生じるDNA超らせんを緩和する働きをもつ。 ⅠI型トポイソメラーゼ　type II topoisomerase：topo II　←→II型トポイソメラーゼ阻害薬 DNAの二重らせん構造の両方を切断し再結合に関与する。 II型トポイソメラーゼの反応では、2本鎖が同時に切断されその切れ目の間を別の2本鎖が通過する。切れ目が再結合すると、リンキング数は二つ変化する。反応は ATPを要求する。 II 型トポイソメラーゼは、DNA超らせんの緩和に加えて、複製後に生じる娘2重鎖DNA間の絡まりカテナンの解消も担う。 真核生物のtopo II は、抗がん剤のエトポシドやテニポシドのターゲットとなる。 DNAジャイレース、DNAギラーゼ　DNA gyrase 細菌が持つDNAトポイソメラーゼII型の1種である。 II型なのでDNA二本鎖の両鎖を切断することにより鎖を回転させねじれをとる働きをする。細菌のDNA複製には欠かせない酵素の1つである。 大腸菌を含む多くの細菌はDNAジャイレースを有する。 DNAジャイレースは負のDNA超らせんを導入する活性をもち、キノロン系抗生物質のターゲットとなる。

DNA組換え酵素　DNA recombinant enzyme →DNA組換え酵素 Creリコンビナーゼ 遺伝子再構成活性化遺伝子　recombination activating gene：RAG　←→RAGマウス 責任遺伝子は第11染色体上にあり、 常染色体劣性遺伝 リンパ球前駆細胞に特異的に発現するDNA組換え酵素で、RAG1とRAG2の2種類が存在する。 1988年から1990年にかけ遺伝子再編成に関与する２つの遺伝子がDavid Baltimore博士（1938年3月7日〜　米国分子生物学者、マサチューセッツ工科大学、1975年にノーベル生理学医学賞受賞）のラボの二人の医学部学生により同定され、Recombination activation gene（RAG）1、2と命名された。 この2つの遺伝子は種の系統樹的には硬骨魚類以降に突然出現すること、イントロンを持たないこと、さらに極めて近接した染色体上に存在していること（約18kbしか離れていない。）、トランスポゼースの活性を有していることから、進化の過程で我々の細胞の中に入り込んだトランスポゾン由来の遺伝子ではないかと考えられている。 Immunoglobulin:IgとTCR（T細胞受容体）の発現には、これらをコードする遺伝子の再構成が必須であり、RAG1とRAG2はこの過程で分子複合体として重要な役割を果たす。RAG2はリンパ細胞にだけ存在する。 RAG1/RAG2完全欠損 完全欠損では抗原受容体遺伝子の再構成が行われないため、B細胞、T細胞がともに欠如し、NK細胞のみが検出される重症複合免疫不全症（B- T- NK+ SCID）を発症する。 RAG1/RAG2の活性が残存するタイプの遺伝子変異（hypomorphic mutation） 部分的に残存するRAG活性により、クローンサイズの小さい、多様性が著しく制限されたB細胞とT細胞の分化が起こる。 その結果、限られたT細胞クローンの著しい活性化と増殖、Th2に偏ったサイトカイン産生、さらにB細胞クローンによるIgE産生の亢進などが起こり、Omenn症候群と呼ばれる特徴的な臨床像を呈する免疫不全症が発症する。 TCR遺伝子、および免疫グロブリン遺伝子のV, D, Jの各遺伝子セグメントに隣接する特異的な塩基配列を認識して切断する。　←→V(D)J遺伝子再構成 これらの遺伝子の再構成に必須であり、その変異、欠損はT細胞、B細胞を欠損する免疫不全症を引き起こす。

DNA依存性プロテインキナーゼ　DNA-dependent protein kinase：DNA-PKcs　←→PK　参考1 分子量約300kの単一ポリペプチド鎖からなり、弛緩型の２本鎖DNAに寄って活性化される特異なセリン・スレオニンキナーゼ DNA-PKCはs53, Sp1, SV40T抗原, c-Myc, TFIIDなどの複製・転写制御因子や、複製転写酵素であるDNAリガーゼI、RNAポリメラーゼII、sI, IIなどがDNA-PKCのin vitroにおける基質となる。 Protein Kinase, DNA-Activated, Catalytic Polypeptide：Prkdc遺伝子 DNA依存性プロテインキナーゼ 免疫不全のSCIDマウスはPrkdc遺伝子の変異により、機能的T細胞およびB細胞を欠くことで、重度の免疫不全を呈する。

ペプチジル転移酵素、ペプチジルトランスフェラーゼ　peptidyl transferase mRNAからタンパク質への翻訳において、リボソーム上でペプチドが結合したペプチジルtRNAから次のアミノアシルｔRNAへとペプチドを転移させ、タンパク合成を進行させる酵素 リボソームの大サブユニットにペプチジル基転移酵素活性がある。 アニソマイシンやクロラムフェニコールはペプチジルトランスフェラーゼなどを阻害することによって、タンパク質およびDNA合成を阻害する。

⭐︎培養細胞株　cell line、Cell strain

• 細胞系のことを指す。数代にわたり継代が可能なものを細胞系（Cell Line）と呼ぶ。
• Cell Lineの中から無限の増殖能を獲得している細胞を樹立細胞系（Establish Cell Line）、さらに細胞系から選択培地などでクローニングで得られた細胞であり、特別な性質などが安定的に保持されているものを細胞株（Cell strain）と呼ぶ。

  Caco-2細胞　Caco-2 cell ヒトの結腸がん由来の上皮細胞株 多孔性のメンブレンフィルター上に培養すると、小腸の円柱上皮細胞に似た刷子縁やタイトジャンクションの形態学的特徴を示し、P糖タンパク質（P-glycoprotein）やペプチダーゼなどの代謝酵素も発現する単層の細胞層を形成する。 化合物の透過性は、単層培養した細胞を透過してきた化合物量をLC-MSやLC-MS-MS　(LC-tandem mass spectrometry )などを用いて微量測定することにより計算できる。 Caco-2細胞での透過係数（apparent permeability coefficient；Papp）は腸管吸収やバイオアベイラビリティと相関するとされていて、薬物の消化管膜透過性のスクリーニングに有用である。 薬物代謝酵素であるCYP3A4は、生体内の消化管上皮細胞では多く発現しているがCaco-2細胞では少ない。

  CHO - チャイニーズハムスター卵巣細胞　Chinese Hamster Ovary バイオ医薬品作成のための汎用されている宿主細胞となっている。 　→組み換え型t-PA：rt-PA

  COS細胞 COS-1はCV-1 origin, SV40の略：CV-1細胞の複製開始点欠損SV40によるトランスフォーマント SV40のラージT抗原を発現する。 Yakov Gluzman Yakov Gluzman（Cold Spring Harbor）が1980台初頭に確立した株　Gluzmanは、CV-1にサルを宿主とするポリオーマウイルスSV40の変異株を感染させて　形質転換することで、変異型ウイルスの増殖に使える宿主細胞を作出して得られた株 高等動物細胞用のベクターや発がん機構の研究に利用される。 リポフェクションなど、簡便な操作で短期間のうちに組み換えタンパク質を大量に発現させる動物細胞株として広範に用いられているが、組み換えタンパク質を一過性に大量発現した後に急速に死滅することが特徴である。 グルツマンの研究で得られたCOS株にはCOS-1、COS-3、COS-7の3種類があり、中でもCOS-7は研究材料としてよく使われている。

  CV-1細胞 CV-1 Line, CV-1 monkey kidney cell line アフリカミドリザルの腎臓 Cercopithecus aethiops monkey kidneysの細胞から樹立された細胞株 ウィスター研究所の Jensen FCらは1964年に、ヒトの線維芽細胞と正常なサルの細胞にRSVを感染させ、感染の効果を確かめる研究を行った。

  フレンド白血病細胞　Friend leukemia cell フレンド白血病はマウス急性白血病原性レトロウイルスであるフレンドウイルスによって引き起こされるマウス赤芽球性白血病であり、フレンド白血病のマウスから樹立された細胞がフレンド白血病細胞である。 DMSOやTSAなどにより赤芽球様細胞へ分化する。 マウスフレンド細胞　MELC　参考1 マウスフレンド細胞どいくつかの白血病細胞株でヘモグロビン合成を誘導し、正常赤芽球系細胞の増殖を促進する。 骨髄で発見されている。

  HEK293細胞、ヒト胎児腎細胞293　Human Embryonic Kidney 胎児腎細胞由来、アデノウイルス5型による形質転換株 1973年にオランダのライデン大学のAlex van der Ebの研究室において、ヒト胎児の腎細胞に アデノウイルス5型を切断したDNAをトランスフェクションさせることにより開発された。ポスドクであったFrank Grahamが、ヒト胚性腎臓細胞へアデノウイルス5（Ad5）DNAをトランスフェクションしていて、それが彼の293回目の実験だったため、細胞の起源であるヒト胚性腎臓細胞（Human Embryonic Kidney cell）の頭文字であるHEKと合わせてHEK293と名付けられた。アデノウイルス遺伝子をHEK細胞のゲノムに組み込むことで、組換えタンパク質を効率的に産生できるようになった。 ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株 組換えタンパク質生産や組換えアデノウイルス作製や増幅のための宿主などさまざまな用途にて利用されている。

  hTERT RPE-1 細胞 ヒト網膜色素上皮の初代培養細胞にヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT, human TElomerase Reverse Transcriptase) を導入し不死化した、正常二倍体に相当する染色体数（46 本）からなる細胞株 初代細胞のin vivo の性質をできるだけ保ちながらも、細胞株のような増殖能を獲得している細胞株 hTERT によるテロメア延長で細胞老化を防ぐことにより、染色体やチェックポイント遺伝子の過剰な変異を避ける意図がある。 一次繊毛の研究には、hTERT-RPE1細胞が頻用される。

  HL-60 - ヒト白血病細胞由来

  HeLa細胞 - ヒト子宮頸がん由来 世界で初めて樹立されたヒトの細胞株（生体外で一定の性質を持って長期間培養できる細胞） 子宮頸がん由来の細胞で、世界中でさまざまな研究に利用されている。 患者である黒人女性の名前（Henrietta Lacks）に由来する。

  MC3T3-E1細胞 マウス頭蓋冠由来 骨芽細胞へと分化誘導されると、アルカリホスファターゼ：ALPを発現する。 POEM=ネフロネクチンはMC3T3-E1細胞から見つかった。

  MDCK - イヌの腎臓上皮 - 上皮の細胞生物学

  Human Glial Hybrid Cell Line: MO3.13, Human 初代オリゴデンドロサイト表現型を表すヒト－ヒトハイブリッドセルライン 6 チオグアニン抵抗性のヒト胎児横紋筋肉腫RD の変異体とレクチン依存型ポリエチレン・グリコール法によってヒト（Adult）オリゴデンドロサイトを細胞融合して作製された。 由来の親腫瘍株と対照的に、M03.13 はガラクトシルセレブロシド（GS）、PLP、およびGFAPに対する細胞内免疫活性を示す。

  Neuro2A: N2a　　←→neuroblastoma　参考1/2/3 Mouse Albino neuroblastoma由来 albino strain A mouseの脊髄に自然発症した腫瘍C1300由来の神経芽腫 神経細胞の分化の研究に用いられる。 レチノイン酸投与により神経突起が伸張する。参考1

  NG108 マウスのneuroblastoma（神経芽細胞腫）とラットのglioma（神経膠腫）のハイブリッド細胞（融合細胞）

  NIH-3T3細胞 マウスの胎児皮膚から分離した培養細胞 NIH Swissマウスから採取され、3日ごとに50mmディッシュに3×105の密度で撒き直して樹立する（3 days, transfer, inoculum 3 x 105 cells/50mm dish）のでこの名がついている。 マウスの正常細胞は培養液における分裂は10回程度で、それ以上は増えない。この細胞は正常細胞の性質と、がん細胞のように無限に分裂する性質を併せ持っていることで有名 1980年代にはDNAによる形質転換手法による発がん遺伝子の探索に広く利用された。

  NSC-34 マウス神経芽腫とマウス脊椎細胞とを融合したハイブリッドセルライン NSC-34細胞は運動ニューロンに毒性であることが知られているいくつかの化学物質の選択培養に基づいて開発された細胞 NSC-34細胞は電位依存性イオンチャネル、細胞骨格形成、組織、および軸索内輸送に影響する薬剤に反応する。 様々なイオンチャネルの阻害剤に対する潜在的な感度は第一の運動ニューロン培養と同様。したがって、不活化モーターニューロン様細胞には、神経毒性研究のモデルとして有用性がある。 培養は細胞分裂能力を持つ、小さく未分化な細胞と、より大きい多核性細胞の二つを含む。 これらの細胞はコリンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルコリン結合、貯蔵、解離および神経フィラメントの三量体タンパク質を含む運動ニューロンの多くの特性を示す。

  PC-12 理化学研究所細胞バンクが提供している神経系の細胞株 ラットの褐色細胞腫に由来する細胞株 神経成長因子添加により分化して神経突起を伸ばすという分化能を有する細胞 神経系の研究分野で汎用されている。

  S2 - ショウジョウバエ - 組み替えタンパク発現

  Sf9 - Spodoptera frugiperda (蛾)- 組み替えタンパク発現

  U937細胞 - ヒト単球の細胞株 マクロファージ細胞株、ヒトリンパ腫由来細胞株　human histiocytic lymphoma cell line 性質が樹状細胞と類似していて、その代用として用いられることが多い。 アニソマイシンはU937細胞をアポトーシスに誘導する。

  →STO細胞

  ベロ細胞、ヴェーロ細胞　Vero 　参考1 アフリカミドリザル腎臓 - ウイルス感染実験、ベロ毒素活性測定 1962年5月27日に、千葉大学医学部細菌学教室の安村美博先生によって健康な成体のアフリカミドリザルから分離・樹立された腎臓上皮細胞 Veroはエスペラント語の緑を意味する「Verda」と腎臓を意味する「Reno」の合成語。同じくエスペラント語で「Vero」は真理を意味する言葉でもある。 インターフェロンを作らない細胞系 この細胞株は、1964年6月15日に清水文七先生（千葉大学微生物学第一教室　名誉教授）によって93世代目のものが、アメリカ国立アレルギー感染症研究所 (NIAID) の熱帯ウイルス学研究所にもたらされた。 その後、研究者たちの手によってさまざまな研究室に分与され、世界中で広く使われるようになった。 ベロ細胞株はアメリカ細胞バンク (ATCC) に付託され、CCL81という番号が付けられている。

  
  
  

  フィーダー細胞 feeder cell 細胞を培養する際に、目的とする細胞の増殖や分化に必要な環境を整えるために補助的に用いられる細胞 ES細胞の培養ではフィーダー細胞としてマウス胚線維芽細胞：MEFが用いられる。 栄養細胞 ES細胞を継代する場合には、フィーダー細胞とES細胞とを分離する必要がある。フィーダー細胞は、マイトマイシンによって増殖性が止められていて接着能が元気な細胞より弱いので、トリプシン処理によって、ES細胞より早く剥がすことができる。 化学固定化したフィーダー細胞がマウスiPS細胞の培養にも適用可能　* マウス胚線維芽細胞　mouse embryonic fibroblasts：MEF MEF フィーダー細胞　MEF Feeder Cells マウスやヒトの胚性幹細胞（ESC）、または未分化状態の多能性幹細胞（iPS細胞）を維持するためのフィーダー細胞として機能し、幹細胞研究において非常に重要な役割を果たしている。 MEFにES細胞を加える前にマイトマイシンC等で処理することにより、有糸分裂を不活化する必要がある。 MEFは　多能性を持つ状態へ変化したり、機能性ニューロンや心筋細胞といった複雑で成熟した様々な細胞に直接分化転換することができる。したがって、発生学的モデリング、神経学的モデリング、心疾患モデリング、創薬および再生医療の研究にMEFを活用することができる。 様々な遺伝子組換えを行ったモデルマウスから分離したMEFを、増殖の制御やDNA損傷に対する応答を研究する目的で利用することができる。 STO細胞　Sandos inbred mouse (SIM)-derived 6-thioguanine- and ouabain-resistant (STO) cells　(ATCC,CRL-1503)　参考1/2 SIMマウスの胚線維芽細胞：MEFsから樹立 Dr. Alan Bernstein により分離されたSIMマウス線維芽細胞のチオグアニンおよびウアバイン抵抗性亜系 奇形がん腫やマウスのES細胞のフィーダー細胞として利用される。 STO細胞は容易に細胞を増やすことが可能であり、ほぼMEFと同様に問題なく培養できる場合もあるが、ES/iPS細胞との相性の問題があったり、4日間以上の培養には耐えられないなど、難しい点もある。 ネオマイシン抵抗性：neor発現ベクターおよびLIF発現ベクターを安定的に組み込んだSTO細胞(SNL細胞、あるいはSNL 76/7 STO細胞、ECACC 07032801) は、山中らのグループによるヒトiPS細胞培養に使用されている。

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⭐︎培地　Culture medium 参考1

LB培地　LB medium, Lysogeny broth 特に分子生物学の分野で大腸菌などの培養に使用されることが多い。 元々ファージによる赤痢菌の溶原化の研究の為に作られた培地であるが、後に多くの細菌の培養に適していることがわかり、分子生物学の分野では教科書にも掲載されるほどポピュラーな存在となる。 大腸菌群などの検査に用いられる乳糖ブイヨン（Lactose Bouillon）培地もLB培地と呼び習わすことがあるが、別物である。 1951年にはじめてこの培地を報告したGiuseppe Bertani *（当時Salvador Edward Luria（イタリアの微生物学者で、ファージの研究の草分け）の研究室にいた）によれば、LBという名称は"Lysogeny Broth"（溶原培地）の頭文字である。しかしルリアとベルターニの頭文字を取ったものとされていることが多く、ルリア培地 (Luria Broth) 、ルリア・ベルターニ培地 (Luria-Bertani medium) などと書かれることもある。 polypeptone 10 g yeast extract 5 g NaCl 10 g （agar 15 g）（pH 7.4） 　 1 Lautoclave

L-15培地 1963年にLeibovutzによって発表された培地で、CO2を使用しなくてもpH調整ができるように考案されてた。 5%CO2下で培養を行なうと培養液が黄色くなりますので注意が必要

Minimum Essential Media：MEM イーグル最小必須培地 Eagle's minimal essential medium：EMEM Harry Eagle（1905〜1992 米国の病理学者）が1959年にマウス L細胞やHeLa細胞でアミノ酸、ビタミン、糖質、無機塩類などの栄養要求性を調べて開発 生体由来の内容物を含まず、人工的に塩・アミノ酸・グルコース・ビタミンを混ぜた画期的な細胞培養培地 これにより、胚エキスや血漿を使う必要がなくなり、それまで世界中で大きな問題であった細胞培養のコストが劇的に改善された。 EMEMの成分 アミノ酸（L-アルギニン、L-シスチン、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン、L-フェニルアラニン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン） 塩（塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ナトリウム塩化物、リン酸二水素ナトリウム） D-グルコース ビタミン（葉酸、ニコチンアミド、リボフラビン、B12、コリン、イノシトール、パントテン酸、ピリドキシン、サールリン酸、チアミン） カルシウムイオンとマグネシウムイオンがあると、細胞が剥がれにくいので、培養液中にはカルシウムイオンもマグネシウムイオンも豊富に含まれている。 最小必要量のアミノ酸しか含まれていないため、アミノ酸要求性の高い細胞などには、MEM用アミノ酸、MEM用非必須アミノ酸などの補助培地を別途添加して使用 HeLa細胞など多くの株細胞、補助培地を加えて多くの細胞に使用されている。

ダルベッコ改変イーグル培地　Dulbecco's modified Eagle's medium：DMEM 1959年にRenato Dulbecco（1914/2/22〜2012/2/19）はイタリア出身のウイルス学者）らがMEM培地を改変した培地 初代あるいは2代マウス胎児細胞におけるポリオーマウイルスのアッセイ用に開発した。 EMEMの変法：MEMに比べて、アミノ酸量が2倍、ビタミンが4倍量含まれている。さらに、鉄を含む。 オリジナルの組成では1000mg/Lのグルコースを含有し、マウス胚細胞の培地に用いられていた。 様々な種類のDMEMがある。グルコースの濃度により、低グルコース（1.0g/Lグルコース）と高グルコース（4.5g/Lグルコース）の2種類がある。 一般的に低グルコースは5%CO2、高グルコースは10%CO2下で培養する。 ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、チキンなどの多くの細胞で使用されている。 Dulbeccoは1975 年にノーベル生理学医学賞を受賞 ダルベッコのグループは、腫瘊ウイルが正常細胞に感染すると、ウイルス由来の遺伝子が細胞のゲノムに取り込まれ、これが形質転換（細胞レベルのがん化）の原因になることを明らかにした。1986年にはヒトゲノムプロジェクトの立ち上げに加わった。 フェノールレッド含有DMEM フェノールレッド：pH 指示薬 通常の pH7 付近ではオレンジ色、pH6.8 以下では黄色、pH8.4 以上では赤紫 色に変化する。 一般的に多くの細胞はpH7.0付近、つまり中性の条件を好む。 フェノールレッドを入れることで、現在の培地が細胞に適したpHなのかを一目で判断でき、いつ培地交換をすればいいのかがわかる。 細胞培養をすると、細胞が乳酸を出すので培地が黄色になる。 D-MEM/Ham's F-12培地 D-MEMとHam's F12培地が1:1に混合された培地

Ham's F10培地 1963年にHamによって発表された培地 ハムスター細胞を中心に検討し、ごく少量のタンパク質（100μg/mL）を補足するだけで高いコロニー形成率が得られるように考察されている。 Ham's F12培地 1965年にHamがF10培地を更に改良し、タンパク質を補足しなくても高いコロニー形成率が得られるように考案された培地 HamはCHO細胞、HeLa細胞、及びマウスL細胞などのコロニー形成を指標として、1965年にF-12培地を開発した。それ以来、F-12は種々の細胞の培養に広く用いられていて、多くの研究者によってその後考案された合成培地の基礎培地として利用されている。

無血清培地　serum-free culture medium：SFM 血清を含まない動物細胞培養用の培地 無血清培地では、血清を適切な栄養成分およびホルモン成分で置き換えることにより、動物血清使用の問題を回避できる。 無血清培地を使用する最も大きな利点の一つは、適切な成長因子の組み合わせを選択することによって、特定の細胞型に選択的な培地の調製が可能となること 　→neurosphere assay

B27サプリメント　B-27 supplement 神経細胞培養用に、初めて市販された無血清サプリメント ラットの海馬および皮質ニューロンを長期培養するために開発された。

ウシ胎児血清　Fetal bovine serum：FBS 　＝Fetal calf serum：FCS ウシの胎児の血液から調製された血清 細胞培養の多くで利用される。 動物細胞は、培地だけでは増殖しないので、血清を添加する必要がある。 血清中に含まれるホルモンの供給源として、培地の緩衝作用の増強、フェノールレッドや各種プロテアーゼからの保護効果がある。 血清の熱非働（動）化処理　Heat Inactivation of Serum 非動化は、血清中の補体成分を失活させるために行う。 血球由来の細胞などは必ず非動化は行うべき。 血清に含まれる補体群を、他の成分（成長因子、免疫グロブリンなど）を失活させないように、56℃で30分間の熱処理によって、不活性化すること。 細胞障害性などの生理活性がある補体を排除したいために行う。



• 細胞の特性を保持したまま分離するには、重力あるいは遠心力により密度勾配媒体中を沈降させる方法が多く用いられる。

  パーコール　Percoll （Percoll」はGEヘルスケアの登録商標） 遠心分離において効率的な密度勾配を作成するための試薬 1978年に Pertoft らによって報告され、以降生化学・医学・細胞生物学等の各分野で利用されている。主に特定の細胞や細胞小器官、ウイルス等を遠心分離で単離するために用いられる。 パーコールは、ポリビニルピロリドン（PVP）でコートされた直径 15-30nm のケイ酸コロイド粒子（含水率23％）からなる。 パーコールは他の密度勾配の基質と比較して粘性が低く、浸透圧が小さく細胞毒性を持たないために実験操作に適している。 ポリビニルピロリドン　Polyvinylpyrrolidone：PVP N-ビニル-2-ピロリドンの重合した高分子化合物 多くの合成高分子化合物と異なり水によく溶解するので、この性質を利用して様々な用途に用いられる。 化粧品や、錠剤の賦形剤や結合剤などとして使われる。 消毒薬のポビドンヨードはヨウ素と結合させた水溶液がである。 インクジェット紙やOHPフィルムのコーティングに用いられる。 接着剤（スティック状糊、切手の糊など）に使われる。

  
  

  単層培養　monolayer culture　←→接着性単層培養 正常の上皮細胞などを培養する方法で、培養器上で細胞が上下に重ならないようにする培養 最も広く使われている基本的な培養法 正常組織構成細胞は培養系に移すと培養器壁上で単層となって伸展・増殖する。 単層培養などでの増殖は足場依存性増殖と呼ばれ、3次元培養などでの増殖は足場非依存性増殖 培養器壁に付着できなかった細胞は、多くの場合死に至る：アノイキス 細胞は増殖してコンフルエントになると増殖を停止する。これをcontactinhibition（接触阻害）またはdensity-dependent inhibition（密度依存性増殖抑制）という。細胞増殖を維持するには，この少し前に，継代して新しい培養器に移す必要がある。 足場依存性増殖　anchorage-dependent growt 単層培養などでの増殖 正常な細胞は細胞同士や細胞外マトリックスとの「細胞接着」状態で安定して存在できる。そしてその接着した「足場」を文字通り足がかりにして、細胞増殖することができる。 がん細胞は足場がなくても増殖できる。 足場とは、「細胞外マトリックス」「細胞間マトリックス」「細胞外基質」などを指す。主な成分はコラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンやラミニンなどの糖タンパク質 アノイキス　anoikis 壁着できないとアポトーシスに陥る現象 コンフルエント　confluent 細胞が増殖して、培養壁面を覆い尽くす状態 正常な接着性細胞は、コンフルエントに達すると成長を停止（接触阻害）する。 接触阻害、接触阻止　contact inhibition 密度依存性増殖抑制　density-dependent in-hibition 正常な細胞は、同種の細胞や培養容器に接触すると増殖を停止すること 形質転換した細胞ではこの機能は失われている。

  3次元培養、3D培養　three-dimensional culture　　←→neurosphere assay 従来の培養はフラスコやシャーレといった平面での培養であったため、縦方向の培養ができず、細胞が2次元的にしか培養できなかった。しかし、生物の体は一般的には3次元的な立体構造で構成されているため、より生体に近い培養環境を整えるために開発された培養法 細胞接着性の低いU底プレートや、多孔質膜やハイドロゲルなどの足場を利用して細胞の凝集塊（スフェロイド）を形成し、細胞をより生体内に近い3次元的な状態で培養する方法 古くから行われている平面培養（2次元培養）では得られない高い細胞活性がみられることから、薬物の毒性試験やスクリーニング、動物実験の代替となる安全性評価モデルの構築、再生医療など、様々な分野で注目されている培養法 細胞塊、細胞スフェロイド　spheloid, cellular spheroid 体内で細胞は、まわりの細胞や細胞外基質と密接に相互作用することで組織を形成している。 細胞が本来有する機能を十分に発揮させることを目的として、従来の平面的な細胞培養とは異なり、三次元に培養することで作製される細胞塊（細胞スフェロイド）が注目されている。 細胞スフェロイドは、細胞が有する細胞接着能を利用して、細胞同士が接着することで形成される三次元の構造体である。 ドラッグスクリーニングや細胞の機能の評価において、細胞あるいは細胞スフェロイドを使うことで、単層培養細胞と比較して生体に近い結果が得られる。 non-adhesive surface 細胞培養法、spinner flask 細胞培養法、rotary 細胞培養法、hanging drop 細胞培養法、micromolding techniques の利用、centrifugation pellet 法、external force enhancement 法など数多くの細胞スフェロイド作製方法が開発され、それぞれの長所短所が指摘されている。 浮遊培養　suspension culture ディッシュ内で細胞が液体に浮かんだ状態に保つ培養方法 3次元培養の一つ

  
  細胞の培養性（接着性，伸展性）を改善するための、細胞と親和性の高いマトリックスの使用　参考1/1
• 生体内で体細胞が細胞外マトリックス支持体によって支えられていることから、生体外においてこれらを模倣して、より生体内に近い環境で細胞をバウ要するため
• マトリックスをにコーティングした培養容器も市販されている。
• 細胞培養用マトリックス

  I型コラーゲン 細胞接着分子を促進、汎用性が最も高い。 各種正常ならびに形質転換ほ乳類の細胞接着を改善し増殖速度を上げる。

  IV型コラーゲン 細胞接着分子を促進、多能生還細胞培養に使用される。 各種細胞の接着及び分化を促進します。また、PC12細胞の増殖を促進する。

  フィブロネクチン 細胞接着分子の代表、細胞接着を促進 多くの細胞、特に線維芽細胞とその他間葉由来細胞の細胞接着、伸展、増殖ならびに分化を促進する。

  ラミニン 多機能な分子、神経細胞培養に使用される。 各種細胞、特に神経細胞、上皮細胞、筋細胞及び筋原細胞の細胞接着、増殖と分化を促進する。

  ポリ -リジン 神経細胞の接着及び形質転換細胞の分化・接着を促進する。

  PDL/LM（ポリ-D- リジン/ ラミニン） ポリ-D-リジンは陽性荷電の合成アミノ酸鎖で、プラスチック表面及びガラス表面の両方で細胞の付着・接着を強化するための基質として使用されている。 多様な応用例で神経細胞の接着及び分化を促進する。 末梢神経系や中枢神経系ネットワークに関係している様々な細胞の培養に有用であり、神経細胞の接着や分化の促進にも適している。

  PLO/LM（ポリ-L-オルニチン/ ラミニン） 多様な応用例で神経細胞の接着及び分化を促進する。 末梢神経系や中枢神経系ネットワークに関係している様々な細胞の培養に有用であり、神経細胞の接着や分化の促進にも適している。

  LM/HFN（ラミニン/ フィブロネクチン） 多様な応用例で神経細胞の接着及び分化を促進する。 細胞接着を促進し、多くの突起を形成させるインビトロ環境となる。

  マトリゲル マウスの腫瘍由来、細胞機能の維持に効果 基底膜の 3次元モデルで多様な細胞、特に上皮、内皮、及び神経細胞の分化を促進する。 再構成基底膜　マトリゲル　matrigel 細胞外マトリクス：ECM、基底膜マトリックス ラミニン（主成分）、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲンおよび数々の成長因子を含むECMタンパク質が豊富なEngelbreth-Holm-Swarm sarcoma（EHS肉腫）から抽出された、可溶化基底膜調製品 3次元培養に用いられ、神経細胞や血管内皮細胞などの足場を要する細胞分化や、細胞のmigration、がん細胞のinvasionなどの観察に有用である。 血管内皮細胞はマトリゲル上では、tube formationとよばれる生体内で見られるような網目状の管腔構造を形成する。 マトリゲルは氷上では液体であるが、37℃で簡単にゲル化する。 コラーゲンゲルでは平たいシート状になり、マトリゲルでは上から見た時に球体、横から見た時にはお椀をひっくり返したようなドーム状の構造となる。

  
  

  継代　passage　＝split＝subculture 継代培養　successive cultivation; subculture; subcultivation 細胞の培養容器を別のものに植え継ぐこと 培養系から培地を除去し、細胞を新しい培地に移す操作を指し、細胞系および細胞株がさらに増殖することを可能にする方法 一般的には接着細胞をトリプシン処理した後、別の容器に移す。 接着培養系の細胞が培地表面を覆い尽くし、さらに増殖可能な場所が存在しなくなった時、または浮遊培養系の細胞がさらなる成長を支える培地の容量を超えた時、細胞増殖は大きく減退、または完全に停止するので、細胞を継続的に成長が行える最適な密度に保ち、そのさらなる増殖を促すためには、培養系を分割し、新しい培地を供給することが必要である。 正常な接着性細胞は、コンフルエントに達すると成長を停止し（接触阻害）、植え継ぎから回復することに長時間を要するので、コンフルエントに達する前の対数増殖期に植え継ぎをすることが必要である。 形質転換した細胞は、コンフルエントに達した後も増殖を継続することが可能だが、一般に2回の倍化後、劣化する。 浮遊培養細胞も、コンフルエントに達する前の対数増殖期に植え継ぎをすることが必要。浮遊培養細胞は、コンフルエントに達すると凝集し、培養フラスコを振り混ぜると、培地が濁って見える。 数代にわたり継代が可能なものを細胞系をcell line（培養細胞株）と呼ぶ。 継代比率　Split Ratio 細胞の播種密度や増殖性の判断材料となる。 継代比率＝1:2と1:10では、1:10の細胞のほうが増殖性が良い。 同じサイズの容器　2本に植え継ぐ場合の継代比率は　1:2 異なる面積の容器に植え継ぐ場合には、面積比率で考慮する。

  細胞を容器から剥がす　←→培地 接着細胞を容器から剥がすのに使うトリプシンの溶液にはEDTAが入っている。 カルシウムイオンとマグネシウムイオンがあると、細胞が剥がれにくい。 EDTAは、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを捕まえて働かなくすること（キレート）ができる物質で、トリプシンが能力を発揮しやすいようにする。 エチレンジアミン四酢酸　ethylenediaminetetraacetic acid：EDTA 金属キレーション剤の1種であり、EDTA あるいはエデト酸と呼ばれることがある。 カルシウムやマグネシウムなどの2価金属イオンとキレート型化合物をつくるキレート剤 金属イオンをキレートして、金属プロテアーゼの活性を阻害する。 EDTAは4つのカルボン酸と2つの3級アミンを持つため、酸塩基反応にも利用される。 生物学や分子生物学において、酵素の不活性化剤として広く用いられる。 2価金属イオンを必要とする酵素（例えば、DNase I など）は多いため、酵素反応の抑制など、EDTAは遺伝子工学実験には欠かせない試薬 エンドヌクレアーゼの補因子である金属イオンをキレートし、DNAの分解を防ぐために添加されている。 キレート　chelate 複数の配位座を持つ配位子（多座配位子）による金属イオンへの結合（配位）をいう。 このようにしてできている錯体をキレート錯体と呼ぶ。 キレート錯体は配位子が複数の配位座を持っているために、配位している物質から分離しにくい。これをキレート効果という。分子の立体構造によって生じた隙間に金属を挟む姿から、「蟹のハサミ」を意味する chela (ラテン語 chēla、ギリシャ語 chēlē)に由来する

  倍化時間、ダブリングタイム　Doubling Time 細胞集団倍化時間 1つの細胞が2つに分裂、または細胞の集団が2倍の大きさになるのにかかる時間 対数増殖期（LOGフェーズ）：細胞固有のDoubling timeで増殖する期間 増殖曲線の書き方：　5日ぐらいでコンフルエントになる濃度で1週間ぐらい毎日、細胞を回収してカウトする。 対数増殖期の細胞数変化から算出する。 培養時間×log2/増加した細胞数から算出する。 Population Doubling Time:PDTの計算方式： 対数的増殖期にある2点において細胞の計測を行う。 第1点における細胞密度の測定値をＮ とし、第2点における測定値をＮとする。 培養開始から第1点までの時間をｔ とし、第２点までの時間をｔとする。 PDT = (ｔ-t0 ) log2 / (logN-logN0) Passage Number 細胞株が培養中に何回の継代作業を繰り返されたのかを表すが、稀に播種濃度や回収効率に関する関連情報が抜けていたりする。 Population doubling level：PDL 細胞集団が樹立の初期段階から、これまでに何回倍化増幅してきたかを表す細胞集団の累積分裂回数 全体の数値に近づくよう一般的な概算として粗く見積った数値 Population doublingの計算 log（培養終了時の細胞数/培養開始時の細胞数）×3.33

  ATP assay　←→ATP/ATP受容体/レポーターアッセイ ATP測定は、ATP量が生細胞数に比例する原理を利用して、細胞障害、細胞増殖抑制、あるいは細胞増殖効果などの細胞数の増減を判定する目的で使用されている。 すべての生物の細胞内に存在するATPを酵素などと組み合わせて発光させ、その発光量（Relative Light Unit；RLU）を測定する。 培養細胞中のATP量をホタルルシフェラーゼ発光法で測定する。 ルシフェラーゼ発光でATP量を測定する方法は、呼吸系代謝を利用した生細胞検出発色方法と比べ、非常に高感度な測定法であるため、少ない細胞数解析できる。 ATP（アデノシン-5’-三リン酸）　←→ATP 全ての生命体に存在する物質であり、エネルギーの通貨物質として機能している。 ATPは、ルシフェリンと酸素の存在下で、ルシフェラーゼを反応させることにより AMP に変化し、光エネルギーが放出される。この酵素反応は生物発光と呼ばれている。 発光　luminescence　←→蛍光 生物発光　bioluminescence　←→化学発光 生物発光はほとんど熱を伴わないきわめて効率の高い光（効率97％）を生物が発することであり、現在の人工照明、人工的化学発光の効率をはるかに越える有機化合物の酸化反応によるエネルギー放射とみなされる。 発光はある光線が照射されている間だけ光るリン光や蛍光と区別される。 発光量を測定することにより、ATPの量を解析できる。 ルシフェリンとルシフェラーゼによる反応はL‐L反応と呼ばれる。 ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応　L-L反応 熱に安定なルシフェリンと不安定なルシフェラーゼによる反応 L‐L反応は1916年にEdmund Newton Harvey（1887/11/25〜1959/7/21, 米国の動物学者）により発見され、ホタルルシフェリンは1957年にWilliam David McElroyらにより北米産ホタル Photinus pyralisから単離された。 ルシフェリンはATPをAMPとリン酸に分けるとAMPをカルボキシル基に結合する。 酸素でこのAMPを切り離し、二酸化炭素と水を作る。 ルシフェリンにはカルボキシル基に変わり、カルボニル基が残される。 カルボニル基の酸素原子は励起状態にあり、基底状態に戻るときにエネルギーの差が可視光として放出される。 この反応はルシフェラーゼを酵素として引き起こされる。 ルシフェリン luciferin ルシフェラーゼによって酸化されて発光する物質の総称であり、ホタル、深海魚、微生物などが起こす生物発光の源である。 発光素とも言う。 基本骨格はイミダゾピラジノンであり、多くの互変異性体がある。 生合成には、イソロイシン、アルギニン、トリプトファンの三種のアミノ酸が含まれる。 下村脩先生は1957年に初めてウミホタルから抽出したルシフェリンの結晶化に成功した。 ルシフェラーゼ luciferase　BRET 発光バクテリアやホタルなどの生物発光において、発光物質が光を放つ化学反応を触媒する作用を持つ酵素の総称である。 発光酵素 とも呼ばれる。 ホタルルシフェリン-4-モノオキシゲナーゼ（ATP加水分解） (Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing))　参考1 通称：ホタルルシフェラーゼ　firefly luciferase ホタルを化学発光を触媒する酸化還元酵素 1957年に単離・精製され、1961年にその平面構造が決定されている。 ホタルの発光効率は極めて高く、発光量子効率は約0.88であると報告されていた（1960年 McEory）が、その後の検証で約0.41であると報告されている（2008年 安藤）。 ホタルの光は明滅するが、このフラッシュ発光はNOにより制御されていることが提唱され、以下のように考えられている。 神経末端と発光細胞の間にあるNO合成酵素（NOS）が、NOを生産し、発光細胞のミトコンドリアのチトクロムcオキシダーゼの活性を抑える。すると、ホタルルシフェラーゼが局在しているペルオキシソームの中の酸素量が増え、発光反応を促進させる。したがって、ペルオキシソームの酸素量は直接にホタルの発光明滅に関わると考えられる。 ホタルルシフェラーゼの反応は2段階により進行する。まず、ルシフェリンのカルボキシル基がATPのα位のリン酸部位を攻撃し、ルシフェリルAMP中間体を酵素中で一旦生成する。その後、酵素が中間体と反応した後、励起状態状態のオキシルシフェリンが生成し、これが基底状態のオキシルシフェリンに変わる際、そのエネルギーを黄緑色の発光として放出する。 1985年に初めてホタルルシフェラーゼ遺伝子がクローニングされた。これにより、アミノ酸配列が決定し、アシルCoAリガーゼとの相同性が高いことが判明した。アシルCoAリガーゼは、ATP存在下で、脂肪酸のアデニレート体を中間体とし、ホタルルシフェラーゼもまた同様に、同じくホタルルシフェリンをアデニレート化する。 発光反応にATPを介在させることから、ATPの微量検出に用いられる。ATPは多くの生物がエネルギーとして利用することから、ホタルルシフェラーゼを用いて、微生物の検出等の応用例が見られる。また、ATPを添加することで簡易に発光反応を起こすことができることから、in vivoでの実験において、レポーター遺伝子として用いられることも多い。 ホタルルシフェラーゼの発光反応は、ATP のエネルギーを使ってルシフェリンを酸化し、光子を発するので、ATPの検出に使われている。 ルシフェラーゼによる発光法は非常に高感度で、発色法や蛍光法に比べ優れた感度を有している（ホタル-ルシフェラーゼ分子の場合、10-20molesの定量が可能）。 蛍光法とは異なり、基質やレポータータンパク質自体からはシグナルを出さず、酵素反応が起こって初めて光を生じるためバックグラウンドがきわめて低く、高いシグナル/ノイズ比が達成される。 蛍光基質を用いたアッセイの場合、十分な感度を得るためには蛍光産物の蓄積に数時間を要するが、発光基質を用いた場合は通常1時間以内で最高感度が得られる。さらに、ルシフェラーゼを有する生物は限られているため、生体サンプルからのアッセイにも最適 広い直線性（4〜6桁以上）を有しており柔軟性のある理想的なアッセイ系を構築することができる。 ウミシイタケルシフェラーゼ luciferase：Rluc　←→BRET ウミシイタケルシフェラーゼはウミシイタケ（Renilla reniformis）に由来する単量体の発光酵素（36kDa） 分子量約36kDaの単量体タンパク質であり、in vitroにおいて基質セレンテラジン(coelenterazine)と酸素存在下で反応し、その際に青色の発光(480nm)を生じる。 基質であるセレンテラジンの酸化を触媒し光を発生させる。 緑色発光ウミシイタケルシフェラーゼは、天然型のルシフェラーゼと比べて血清中での安定性が高く、緑色帯域にシフトした発光スペクトルを有していて、非常に明るく急速に減衰するフラッシュシグナルを放出する。 NanoLuc®：Nluc　←→NanoBRETTM 分泌型ルシフェラーゼ チッソ株式会社は、2000年に駿河湾に棲息する深海発光エビであるヒオドシエビ（学名：Oplophorus gracilirostris）由来の発光酵素である分泌型ルシフェラーゼのクローニングに成功した。　参考 深海エビ（トゲオキヒオドシエビ[Oplophorus gracilirostris]）由来のルシフェラーゼ プロメガのNanoBRETTMのためのドナー 触媒活性のある19kDaのサブユニットを改変し、さらに本来の基質であるCoelenterazineをもとに作製したFurimazineという新しい基質を用いることで発光強度と安定性を高めた。 発光レポーターとして最適なパフォーマンスを発揮するために作り出されたルシフェラーゼ ホタルルシフェラーゼ (luc2)よりも80倍〜240倍のシグナル（細胞内発現） ホタル/ウミシイタケルシフェラーゼやGFPよりも小さい分子量：19kDa（単量体酵素） 化学発光、ケミルミネセンス　chemiluminescence　←→生物発光 化学反応によって励起された分子が基底状態に戻る際、エネルギーを光として放出する現象である。この中で分子単独が励起状態を形成するものを直接発光と呼び、系内に存在する蛍光物質等へエネルギー移動し、蛍光物質の発光が観測されるものを間接化学発光と呼ぶ。 代表的な化学発光を示す有機化合物の例としてルミノール、ロフィン、ルシゲニン、シュウ酸エステルがある。 ルミノール、ロフィン、ルシゲニンは直接発光である。 シュウ酸エステルは間接化学発光である。シュウ酸エステルの化学発光は過シュウ酸エステル化学発光と呼ばれている。 ルミノメーター 生物発光あるいは化学発光により発光している溶液試料の発光量を測定することによって、ルシフェラーゼアッセイ等のリポータージーンアッセイやATP assay、過酸化水素やスーパーオキシドをはじめとする活性酸素種の測定、機能性食品の抗酸化能測定、ELISAなど様々な用途に広く利用可能な装置 プレートリーダー、マイクロプレートリーダー　Plate reader、Microplate Reader 物理学・化学・生物学の実験や検査などで広く用いられる測定用機器で、マイクロプレートに入れた多数のサンプル（主として液体）の光学的性質を測定するものである。 マイクロプレートの型式（6穴から1536穴まである）に合わせたものがあり、ウェル（穴）ごとにそのまま測定できるようにしてある。 測定モードとしては最も一般的な吸光のほか、蛍光、化学発光、さらに蛍光偏光などがあり、モードが切り替えられる装置もある。 分光光度計のキュベットに代わってマイクロプレートを用いるようにした機器

  Alamar Blue Assay fluorogenic redox indicator 細胞の健康状態は、多数の方法によってモニターすることができる。細胞膜の完全性、DNA合成、DNA量、酵素活性、ATPの存在および細胞の酸化・還元状態は細胞の生存能力および細胞死に関する既知の指標です。 alamarBlue生細胞試薬は、生きている細胞の還元力を利用して、ヒトや動物、細菌、植物ならびに菌類といった様々な細胞系の増殖を定量的に測定し、細胞の健康指標として様々な化学物質の相対的細胞毒性評価の確立を可能にする。 細胞が生存している場合、そのサイトゾル内は還元環境が維持されている。 レサズリン(alamarBlue Reagentの有効成分)は青色で、ほとんど蛍光がなく、ほとんど毒性もない細胞透過性化合物である。 細胞内に入ったレサズリンは、赤色で強い蛍光を発するレゾルフィンに還元される。生細胞内ではレサズリンはレゾルフィンに変換され続け、その細胞周囲の全体的な蛍光と色が強まる。

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⭐︎多型 polymorphism　参考1

• ヒトDNA配列には個人差があり、その差は多型と呼ばれる。
• 同一種に属する生物であっても個々のゲノムの塩基配列は多種多様である。その変化は、表現型に病的影響を与える場合と与えない場合とがあるが、後者で人口の１％以上の頻度で存在する遺伝子の変異を遺伝子多型という。
• 多型を生じる原因は、種内に生じる各種の突然変異：塩基がほかの塩基に置き換わる「置換」、塩基が失われる「欠失」、塩基が入る「挿入」や「重複」および遺伝的組換えなどである。
• 一つの塩基が他の塩基に置き換わっている一塩基多型（SNPs）が遺伝的背景の個別化マーカーとして有用視されている。ヒトゲノムを個人個人で比べると0.1％の塩基配列の違いがあり，全ゲノム中には，300万〜1000万箇所のSNPsがあるといわれている．
• 同義コドンの多型ではアミノ酸配列の変化を生じないため、サイレント突然変異（同義突然変異）となる。遺伝的多型が、非同義突然変異であれば、タンパク質機能の低下や機能欠如、異常タンパク質の出現などにつながる場合もある。特に薬物代謝酵素では、酵素活性の低下や欠如、非定型酵素や異常酵素の出現といった表現型となる。
• 酵素遺伝子の5′上流やイントロンに変異があり、mRNA量や酵素タンパク質量に影響を及ぼす変異もみつかっている。
• 「（遺伝子）変異」と同じ言葉の意味だが、「多型」の場合は、より多くの人間にみられる、傾向がみられる変異、といった感じのニュアンス
  
  

  一塩基多型 single nucleotide polymorphism：SNP　←→一塩基バリアント/コピー数多型　参考1 ある生物種集団のゲノム塩基配列中に一塩基が変異した多様性がみられ、その変異が集団内で1%以上の頻度で見られる時、これを一塩基多型と呼ぶ。 対立遺伝子頻度がこれより低いときに使用するのは基本的に誤りで、そのような物は突然変異と呼ばれる。 ある一つの塩基が別の塩基に置換されて起きるため、一つのSNPには置換前と置換後の二種類の対立遺伝子しか見つからないことが多い。まれに3から4個の対立遺伝子があるSNPもある。 ゲノム上のある位置について周辺の連鎖不平衡の度合いがわかっている（これを連鎖不平衡地図と呼ぶ）と、あるマーカーが標的の表現型と関連があった場合どの程度の範囲で目的の遺伝子が存在しうるか予測できる。この目的に重要なのがSNPsである。SNPsは全ゲノム上にわたり非常に高密度（250-300bp毎）に存在することから、全ゲノムに亘る連鎖不平衡地図作製に必須である。またSNPs自体が表現型を規定する遺伝子多型であり疾患遺伝子そのものでもあり得る。ただSNPsは情報量としては比較的低いため、この弱点を補うためハプロタイプ解析が行われている。ハプロタイプとは近接するアレル間でのアレルの組み合わせのことであるが、連鎖不平衡が存在するとハプロタイプにはある偏りが観測され、そのバリエーションは一つのSNPよりはるかに多い。これと連鎖不平衡地図とを考慮して、効率的にジーンマッピングを行いうる。 SNPの起源は中立進化説がいうように、種の分化後にランダムに発生したものだと考えられている。 30億の塩基配列で形成されている人類が、SNPのようなわずかなDNA配列の差(0.1%、約1000塩基に1個)が、個人間の 薬の効きやすさや、疾患のかかりやすさなどに影響を及ぼしている。 中立進化説　neutral theory of molecular evolution） 分子レベルでの遺伝子の変化は大部分が自然淘汰に対して有利でも不利でもなく（中立的）、突然変異と遺伝的浮動が進化の主因であるとする説。分子進化の中立説、あるいは単に中立説ともいう。国立遺伝学研究所の木村資生 (きむらもとお) によって1960年代後半および1970年代前半に発表されて、センセーションを巻き起こした説である。 中立説は自然選択説との間で論争を引き起こした。

  Copy Number Polymorphism：CNP　←→コピー数多型/遺伝子重複/一塩基多型 コピー数多型は、対象に比較して相対的にコピー数が多い場合と少ない場合がありそれぞれ重複、欠失と呼ばれる。特に集団のなかで1%以上の頻度を持つものをCopy Number Polymorphismと呼ぶ。

  ゲノムワイド相関解析　Genome-Wide Association Study：GWAS　参考1 疾患の感受性遺伝子を見つける方法の1つ ヒトのゲノム全体をカバーするSNPsを用いて、疾患を持つ群と疾患を持たない群とでSNPの頻度に差があるかどうかを統計学的に比較する解析方法

  疾患感受性遺伝子　disease susceptibility gene 単一遺伝子病の原因遺伝子のように遺伝子に変異があると必ず発症するというものではなく、変異があると発症しやすくなったり、逆に発症しにくくなったりする遺伝子

  疾患感受性遺伝子　disease susceptibility gene 単一遺伝子病の原因遺伝子のように遺伝子に変異があると必ず発症するというものではなく、変異があると発症しやすくなったり、逆に発症しにくくなったりする遺伝子

  
  

  ジーンマッピング　gene mapping　参考1 一般には遺伝子の染色体上の位地を同定することである。 医学研究においては疾患や様々な表現型を規定する遺伝子を同定することと同意である。稀なメンデル遺伝形式をとる疾患（原因遺伝子は一つ）については、十分な家系情報とDNAが得られれば、その原因遺伝子の同定は原理上可能で、実際に殆どのメンデル遺伝疾患遺伝子が同定されている。 ポストゲノムといわれる今後の医学研究の目標はこれらの稀な疾患から、１）より頻度が高い非メンデル形式の複雑な遺伝様式（原因遺伝子が複数存在する）を持ったーすなわち遺伝要因と環境要因が絡み合って発症する疾患遺伝子の同定、２）薬剤への反応性（効果と副作用）といった複雑な表現型を規定する遺伝子の同定へと移ってきた。

  連鎖不平衡解析　linkage disequilibrium analysis　参考1 ある遺伝子Aと遺伝子Bがあった時に、そのハプロタイプの頻度がそれぞれのアレル頻度の積からずれるという 確率論的な現象です。分かりやすく言えば、集団の保たれ方(組みかえの無さ)の指標です。 AとBがまったく無関係な遺伝子で、互いに独立であればAとBから成るハプロタイプの頻度はAとBの 対立遺伝子頻度の積から計算できるはずです。 しかし何らかの都合でAとBが関わりあいを持ったまま遺伝する場合、 つまり互いに独立ではないならばハプロタイプ頻度は対立遺伝子頻度の積からずれてしまう。 人の遺伝子が親から子へ伝達されるときに、父親と母親の染色体それぞれ一本ずつから由来する対立遺伝子（アレル）を受け取る。減数分裂時に組換えがおこるので、同じ染色体上にある遺伝子同士でも世代を重ねるたびに、アレルの組み合わせは変わっていく。 この組換えは、一般には染色体上の位置が近ければ余り起こらず（連鎖）、離れていれば起こりやすい（連鎖がない）と考えられる。すなわちあるアレルに着目し、これがある表現型—たとえばある疾患であるかないかーと関連している（case-control study）とすればそのアレル自体はある疾患の遺伝子でないとしても、そのアレルとともに伝達されている本当の疾患遺伝子アレルがその近傍に存在しうる（連鎖不平衡にあるという。〜連鎖と連鎖不平衡の意味の違いに注意）。 この理論的背景はcommon disease common variant仮説が成立しているという条件が必要である。 連鎖不平衡解析は連鎖解析の弱点である、陽性領域の広さや検出力の低さを補うが、逆説として、陽性領域が狭いので多数マーカーが必要となり従って多重比較からの偽陽性の増加、集団の構造化による偽陽性の可能性、といった問題点がある。 ハプロタイプ　haplotype "haploid genotype"（半数体の遺伝子型）の略。単倍型とも訳される。 近接するアレル間でのアレルの組み合わせのこと 両親からそれぞれ一本ずつ同じ染色体を受け継ぎ，1対の相同染色体が生成される。そのどちらか一方の染色体（ハプロイド）に存在するアレルの組み合わせをハプロタイプとよぶ。PCRを用いた多型解析においては、通常相同染色体を同時に増幅させるため、このハプロタイプはわからないが、現在では種々のアルゴリズムを用いて推定している。 ありふれた疾患共通変異仮説　common disease common variant hypothesis 頻度の高い疾患が遺伝因子と関連する場合、その遺伝因子は共通の祖先の変異に由来するだろうという仮説 その突然変異の起きた近傍のハプロタイプが連鎖不平衡により、家系が異なっていても患者集団に残っていることから病因座位を特定する、 common disease common variant hypothesisが正しければ疾患の変異と周辺の変異には強い連鎖不平衡が存在し、これ利用して疾患関連遺伝子群を探し出すことが可能と考えられている。

  
  
  
• Chronic pain genes
  　→Human Pain Genes Database

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○遺伝子組み換え実験による物理的規制　参考1
バイオセーフティーレベル biosafety level： BSL　：細菌・ウイルスなどの微生物・病原体等を取り扱う実験室・施設の格付け

　[リスクグループ]

グループ1 ヒトあるいは動物に病気を起こす可能性の低い微生物

グループ2 ヒトあるいは動物に病気を起こすが、実験者およびその属する集団や家畜・環境に対して重大な災害を起こす可能性はほとんどない。 実験室感染で重篤感染を起こしても、有効な治療法・予防法があり、感染の拡大も限られている。 インフルエンザウイルスなど

グループ3 ヒトあるいは動物に生死に関わる程度の重篤な病気を起こすが、普通ヒトからヒトへの伝染はない。 有効な治療法・予防法がある。 黄熱ウイルス・狂犬病ウイルスなど

グループ4 ヒトあるいは動物に生死に関わる程度の重篤な病気を起こし、容易にヒトからヒトへ直接・間接の感染を起こす。 有効な治療法・予防法は確立されていない。 多数存在する病原体の中でも毒性や感染性が最強クラスである。 エボラウイルス・マールブルグウイルス・天然痘ウイルスなど

　[バイオセーフティーレベル　biosafety level：BSL]

バイオセーフティーレベルはリスクグループに対応

P1	一般的な実験室
P2	病原性を扱うような実験室　オートクレーブが設置されていることが望ましい（実験室内にある必要はない）。生物学用安全キャビネット（クラスIIA以上）の設置
P3	バイオクリーンルーム（室内に流入する空気は全てHEPAフィルタ（0.22μm方形のフィルター）を通している）
P4	遺伝子組み換え対象生物に触れずに実験できる実験室

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