■基礎の基礎

│神経幹細胞 neural stem cell│

■新研究

　←→エピジェネティックス/関連遺伝子/タンパク/発生/遺伝子導入 　←参考　Hitoshi laboratory/1

幹細胞 stem cell　→神経幹細胞/多能性幹細胞/間葉系幹細胞/小腸上皮幹細胞 自己複製能と多能性を持ち、際限なく増殖できる細胞 自己複製能 self-renewal　←→未分化性 対称分裂と非対称分裂によって、新たな幹細胞を生み出す能力 神経幹細胞は胎生初期の神経管の脳室壁で対称分裂により拡大・再生産される。 Tet1はES細胞の自己複製の維持に必要である。 Nanog遺伝子は自己複製マーカーである。 Notchシグナル活性の減弱によって、神経幹細胞の自己複製能が減弱される。 多分化能、分化多能性：pluripotencyとmultipotency 多分化能、分化多能性：pluripotency　←→　未分化/分化制御因子/多能性幹細胞 幹細胞が持つ、自分と同じ性質の細胞を作り出す能力を持つと同時に、どの三つの胚葉：内胚葉、中胚葉、または外胚葉にもなれる分化能力 由来によって、初期胚から作製される胚性幹細胞（ES細胞）、あるいは皮膚などの体細胞を初期化することで作製される人工多能性幹細胞（iPS細胞）が知られる。 pluripotent stem cellはあらゆる細胞運命や成熟細胞型を生じることができるが、一つの個体とはならないという点で全能性 totipotencyと区別する。 三胚葉を含むテラトーマの形成をもって多能性を証明することが一般的 奇形腫、テラトーマ　teratoma　←→テラトカルチノーマ/胚性カルチノーマ ES細胞やiPS細胞を免疫不全マウスの皮下などに注射した時に形成される腫瘍 様々な種類の組織が混在している。 テラトーマを観察し、様々な組織に分化していることを確認することは、細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の一つである。 多分化能、分化多能性：multipotency　←→説 複数の、しかし限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力 血液幹細胞であれば、いくつかの型の血液細胞へと成長することができるが脳細胞や他の型の細胞へは成長できない。 神経幹細胞の場合は、非対称分裂によりニューロンにもグリア（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）にもなりうる。 分化転換　transdifferentiation：近年の幹細胞の研究では、血液幹細胞を神経や脳細胞のように振る舞わせることができる。multipotent 細胞をpluripotent 細胞へ変質させる研究も行われている。 発生における細胞系譜の幹 stemになることから名付けられた。 細胞系譜 cell lineage　説/プロニューラル因子 細胞系譜とは、受精卵から成体ができるまでの発生過程で、組織細胞がどのような分裂パターンを経て産生されるかを記述したもの 細胞系譜とは、樹形図と各細胞の予定運命とを合わせて具体的に描写したもの 多細胞生物の初期胚が一定の法則に従って細胞分裂を繰り返し、組織や器官にまで分化していく道筋をいう。 高等な動物の初期胚の細胞系譜はおおまかではあるが、局所的な生体染色によって追跡できる。 レトロウイルスなどを用いた細胞系譜追跡実験によっても、ニューロン新生は確認される。 幹細胞は対称分裂と非対称分裂の2種類の細胞分裂を行うことによって、自己複製能も保持している。 幹細胞の分裂 対称分裂 symmetric cell division：等分裂、対称・分化特異的分裂 2つの同一の娘細胞を生み出し、その2つはどちらも幹細胞の性質を受け継いでいる。 非対称分裂 asymmetric cell division：不等分裂、非対称・幹細胞的分裂 幹細胞と、限られた自己複製能を持つ前駆細胞を1つ作る。 幹細胞が分化する際に幹細胞が消失しないよう、自分と同じ細胞も形成する。 分化

前駆細胞 progenitor cell　→神経前駆細胞 ある分化細胞の系譜に入り(commitment)、限られた回数の分裂の後に分化を遂げるように運命づけられた細胞

神経幹細胞 neural stem cell　←→幹細胞/神経前駆細胞/マーカー/分化制御因子/神経の発生/皮質板形成/　参考1/2/3

1928年	Santiago Ramón y Cajal（P スペイン）が論文の中で「成体哺乳類の中枢神経系は損傷を受けると二度と再生しない」と結論した。
1962年 1963年 1965年	Joseph Altman（1925 〜 2016, ハンガリー生まれ、米国の生物学者　参考　1/2/3/4）とGoapl Dasは成体脳でもニューロン新生が起こっていることを発見した。成体ラットの脳にRI標識したチミジン（3H-thymidine）を投与すると海馬と脳室周囲の細胞にチミジンが集積した。Altmanの研究あまり注目されなかったが、2012年に「成体脳のニューロン新生の発見」により第28回国際生物学賞を受賞した。　参考1/2
1965年 1969年	Joseph Altmanは成体脳のニューロン新生成体の嗅球でも新生ニューロンの存在することを示し、rostral migratory streamも発見・命名した。 *
1977年	Michael Kaplan（米国の解剖学者）とJames Hindsは電子顕微鏡を用いて、3歳のラットの3H-thymidineでラベルされた新生ニューロンが上衣下層に存在ことを報告した。
1974年 1984年 1988年	Pasko Rakic（ユーゴスラビア生まれ、 Yale大学の神経科学者 1/2/3）は霊長類の成体脳では神経は新生されないことを報告した。 参考1
1983年	Michael Kaplanは５歳のアカゲザルでも3H-thymidineラベル実験を行い、上衣下層に分裂細胞が存在することを報告した。
1985年	Fernand Nottebohm（Rockefeller University）がカナリアの海馬での神経再生を発見した。
1989年	Sally Templeがマウスの脳室下帯にある幹細胞の多分化能について論文を発表した。
1992年	カナダのBrent ReynoldsとSamuel Weissがneurosphere assayを開発した。成体マウスの線条体から取り出した細胞にEGFを添加して、分裂増殖しながら神経細胞やグリア細胞を生み出す細胞塊を分離することに成功した。つまり、神経やグリアを産み出す神経幹細胞の発見とも言える！ *
1993年	石 龍徳（現東京医大解剖学）がPSA-NCAM（神経前駆細胞・未成熟ニューロンのマーカー）のモノクローナル抗体を用いて、成体海馬歯状回の顆粒細胞に新生するニューロンを同定した。　参考1
1993年	Frank Corotto*/*とJoel Marunik（コロンビアのミズリー大学）が1993年に初めて放射線同位元素を使わないBrdU法で成体のニューロン新生の研究をした。BrdUと共焦点顕微鏡を使ってSEZのニューロンが嗅球に移動し、それらのニューロンは神経特異エノラーゼ：NSEとカルレチニンを発現していた。
1997年 1999年	Gerd Kempermann（Dresdenの神経科学者 1/2）らはFred H. Gage（ソーク研究所の遺伝学研究室の教授, 第13回慶應医学賞受賞）のlabで、刺激豊かな環境ではマウスの海馬歯状回の神経新生ニューロンが増加することを発見した。　参考1/2 1999年のHenriette van Praagの研究では、BrdU陽性細胞は刺激豊かな環境よりも自発走運動の方が多かった。　参考1
1997年 1998年 1999年	Elizabeth Gould（Princeton University心理学科の神経科学者 1/2）の研究グループはげっ歯類だけでなく、霊長類でも成体で神経が新生することを発見した。1997年にはツバイの歯状回で神経新生は心理社会的ストレスやNMDA受容体活性化によって制御されることを報告した。1998年には成体マーモセットや成体アカゲザルの海馬で神経新生を発見した。1999年には成体カニクイザルの新皮質（前頭葉前部、下側頭皮質、後頭頂葉）で神経新生を発見、海馬で生まれた神経細胞が白質を経て新皮質に移動することを発表した。
1998年	Peter S. Eriksson（1959/6/5〜2007/8/2, Sahlgrenska University Hospital in Gothenburg, Sweden）とFred H. Gage↑らは、、抗がん剤（BrdU）を服用したがん患者の協力を得て、その患者が死亡した後に、脳組織標本を詳しく調べることにより、大人の脳の中でも、少なくとも、海馬の歯状回で、ニューロンが新生していることを見出した。　参考1/2
1999年	Arturo Alvarez-Buylla（Fernand Nottebohm↑のラボ出身で、初めはトリのニューロン新生を研究していた。）らはラットの側脳室下帯の神経幹細胞がGFAP陽性であることを発表した。GFAPはアストロサイトのマーカーなので、その当時GFAPが神経幹細胞に発現していることは受け入れられなかった。
2001年	玉巻伸章（京大→熊本大・解剖学）、宮田卓樹（現名古屋大・細胞生物学）、Stephen C. Noctor（コロンビア大学）のグループがほぼ同時に、放射状グリア細胞が神経幹細胞であることを示す論文を発表した。
2006年	Jonas Frisén（スウェーデンKarolinska Institute）のグループは1960年代の水爆実験で放出された大気中14Cをトレーサーとして使用した研究により、大脳新皮質のニューロン新生は、仮に起こっていたとしてもその数は非常に限定的であるとするデータを示した。　参考
2011年	等誠司（生理研→滋賀医大）らはGcm遺伝子がDNAを脱メチル化させることによって、Hes5遺伝子が動きだし、Notchシグナルを活性化させて、神経幹細胞が生成されることを発見した。　←参考1/2
2017年	今吉格先生1/2/3/4/5が第１回ジョセフ・アルトマン記念発達神経科学賞を受賞




• 神経幹細胞：自己複製能と多分化能を併せ持つ未分化な細胞
  ：対称分裂あるいは非対称分裂によって新たな神経幹細胞を生み出す自己複製能と、複数の違った種類の細胞に分化する多分化能を持つ細胞
• 胎生初期の神経幹細胞は脳室帯に局在し、細胞分裂を繰り返して自己増殖している。
• 胎生中期の脳で神経幹細胞自身を維持するとともに、ニューロンを産生するようになる。ニューロン産生期における神経幹細胞の多くは非対称分裂を行い，自己複製を行いつつ、直接もしくは中間的な前駆細胞を介して、ニューロンを継続的に産生する。
• 胎生後期の脳では神経幹細胞はニューロン産生を終え、代わりにオリゴデンドロサイト・アストロサイトを産み出すように、増殖と分化のバランスをうまく調節している
• 胎生期の神経幹細胞の細胞周期はどんどん伸びていき、成体脳では遂に非常にゆっくりとしか分裂しなくなると考えられる。→quiescent 　
  
  

  神経幹細胞の未分化性 undifferentiatedの維持 　←→自己複製能/ニューロンへの分化/グリアへの分化/分化制御因子 repressor-typeのbHLH型転写因子が関与 Hes1やHes5の発現が未分化状態を維持（Hes1, Hes3, Hes5, Hey1, Hey2, HeyL (Hey3) KLF5、FUT9 未分化細胞マーカー：アルカリフォスファターゼ、SSEA-1（＝Lex抗原）、Nanog、Oct3/4 LIF Matrin-3　参考1/2/

  マウス　ES細胞未分化状態の維持　参考1 分泌性因子：LIF, BMP, Wntなど 転写因子 ：STAT3, Oct3/4, Nanog, Sox KLFも未分化性に関わる。 　 KLF4は　LIF非存在化で分化を抑制 未分化なマウスのES細胞では　KLF4, KLF2, KLF5が高発現しているが、分化に伴って減弱していく。 KLF4単独のノックダウンでは未分化性に影響しないが、３遺伝子のノックダウンにより未分化性が消失

  
  
• 神経幹細胞の自己複製と細胞分化はbHLH型転写因子によって制御されている。
• 神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイト分化を制御するHes1、ニューロン分化を制御するAscl1、オリゴデンドロサイト分化を制御するOlig2という3種類のbHLH型転写因子が重要な働きを担っている。
• 神経幹細胞においてHes1、Ascl1タンパク質は2〜3時間周期で、Olig2タンパク質は5〜8時間周期で振動発現（オシレーション）している。　参考1
• bHLH型転写因子が発現振動を繰り返すことによって神経幹細胞の細胞分裂を促進する。
  
  
• 大脳皮質発生過程における神経幹細胞の分化制御機構モデル 1

  Common progenitor説 中枢神経系を構成する全ての細胞が、共通の神経幹細胞から生み出されるという考え方である。 大脳皮質では、組織を構成する神経細胞のうち、終脳背側部の脳室帯及を発生起源とするグルタミン酸作動性の神経細胞⇩は、共通の神経幹細胞が非対称分裂を繰り返す過程で、経時的に発現する転写因子が切り替わり、この結果、神経幹細胞が時間と共に変化すると考えられてきた。これは、発生期のマウス中枢神経系では、ドナーの神経幹細胞を異なる誕生日の脳室帯に移植すると、誕生日の早い神経幹細胞は多様な分化能を示すが、誕生日の遅い神経幹細胞は分化能力が制限されるという知見に基づいている。 大脳皮質発生初期に分化する深層の神経細胞の運命決定は、より誕生日の早いCajal-Retzius細胞への分化を転写因子FoxG1が抑制する一方で、転写因子Fezlが促進することが確認されている。こうした神経幹細胞の時間依存的な性質の変化は、細胞周期の調節が中心的な役割を果たすとの仮説が提唱されてきたが、最近の研究で、細胞周期を止めても幹細胞の時間が進行することが見出されている。 ショウジョウバエ胚中枢神経系では、“common progenitor説”を支持する数多くの重要な知見を見出している。ショウジョウバエ胚中枢神経系では、まず一層の神経上皮からneuroblast：NBとよばれる神経幹細胞様の細胞が生じ、NBは神経幹細胞様に非対称に分裂し、自己複製とganglion mother cell：GMCとよばれる小さな神経前駆細胞の産生を繰り返す。GMCは、通常１回だけ分裂して２つの最終分化した神経細胞あるいはグリア細胞を生み出すが、順次、生み出されるGMCは生まれた順番に応じて、NBからそれぞれ異なる個性を与えられる。このとき、NBはHunchback、Krüppel、Pdm、Castor、Grainyheadという５種類の転写因子のセットを順次発現し、その発現を分裂とカップルして切り替えていくことで、共通の神経幹細胞様の細胞が時間と共に性質を変化する結果として、多様な細胞を生み出すことが可能となる。 脊椎動物においては、特定の神経幹細胞や前駆細胞を個体内で同定することは極めて困難であり、この過程を司る分子メカニズムを追求するには数多くの障壁が存在している。

  Fate−restricted progenitor説　←→神経デフォルト説/His' dualistic theory　参考1 発生期の早い時期から異なる細胞系譜の神経幹細胞が混在し、各々が固有の細胞型を生み出すという考え方である。 実際、神経幹細胞が不均一な細胞集団であることは古くから指摘されてきた。 増殖因子に対する応答性、形態、細胞周期の長さ、など神経幹細胞の不均一性を示唆する様々な報告が認められる。また、発生初期の神経上皮細胞でさえも、多数の異なる細胞集団が観察され、異なるコンピテンスを示す幹細胞型が分取可能であることが示されている。 大脳皮質発生初期の神経幹細胞に発現する転写因子Fezlを欠損したマウスは、深層の神経細胞の分化が阻止されているにも係らず、後期に誕生する上層の神経細胞は正常なタイミングで分化すること、神経幹細胞の未分化性を一過的に促進した細胞は、深層の神経細胞を生み出すことなしに、正しい時期に上層の神経細胞を生み出すことが可能であることが明らかにされている。 さらには、脳室帯に位置する神経幹細胞は、より未分化性の高い幹細胞集団と比較的分化に傾いた幹細胞集団が不均一に存在しており、これがNotchシグナルの強弱で区別されていることが見出されている。また、深層の神経細胞で発現する転写因子Fezlと上層の神経細胞で発現する転写因子Cux2が脳室帯の異なる神経幹細胞で発現する可能性も示されているが、これと相反する報告も認められている。一方で、分化した神経細胞でさえも環境に応じて適切に性質が変化する現象が観察されていることから、神経細胞の細胞運命決定機構を司る分子機構は未だ不明な点が多いのが現状である。

  
  
  

  休眠期、静止期、quiescent　←→自己複製能/ニューロンへの分化/label retaining法 胎生期の神経幹細胞の細胞周期はどんどん伸びていき、成体脳では遂に非常にゆっくりとしか分裂しなくなると考えられる。 ・・・細胞周期の延長に関連するか？ 成体脳神経幹細胞は自己複製能を保ちつつ、稀にしか分裂しない。 細胞周期の進行を負に制御することが知られているCDK inhibitor p57が成体神経幹細胞で強く発現している。 神経幹細胞には分裂回数に限界があり、稀にしか分裂しないことで幹細胞を長期にわたって維持していると考えられている。　参考1 Delta-like 1：Dll1 を成体脳で人為的に失くすと、神経幹細胞は維持されなくなるので、成体の脳で神経幹細胞を維持するニッチシグナルであることがわかった。Dll1は分裂中に偏った局在し、非対称分裂でニューロンに分化する娘細胞に譲渡される。Dll1のシグナルは神経幹細胞が分裂後に休眠状態に戻るのにも必要である。　参考 B型エフリン：EphB2を介したシグナルが成体脳の側脳室の幹細胞ニッチ細胞の運命転換に重要な役割をはたす。　参考1 幼若マウスと老齢マウスの脳内の幹細胞の増殖能と分化能は変わらないが、quiescentから抜け出す時間が延長するため、必要な細胞数を産生できない。より小さな幹細胞リザーバーは、損傷した脳の再生に対して古い神経幹細胞をより耐性にするquiescentを増加させることによって完全に枯渇することから保護されている。神経幹細胞の試験管内で培養でも、幼若マウス由来の幹細胞も、老齢マウス由来の幹細胞も同じように増殖できる。single cell trascriptome法を用いて両者の遺伝子発現を比べ、個々の細胞の発現遺伝子は増殖に関わるものも含めて、年齢でほとんど差がないことを明らかなった。 　老齢マウスの幹細胞がquiescentから抜け出しにくい理由を調べる目的で、幹細胞のニッチを作っているsubventicular zoneに存在する細胞の遺伝子発現プロファイルを調べ、インターフェロンにより誘導される炎症反応に関わる遺伝子が幹細胞のニッチで上昇している。幹細胞をインターフェロンαとβで処理すると、増殖が抑えられる。そして、インターフェロン遺伝子がノックアウトされたマウスでは幹細胞の数が上昇していることを見出している。さらに、インターフェロンにより誘導されるケモカインCXCL10に対する中和抗体を脳内にミニポンプで投与し、幹細胞の増殖を調べると増殖細胞が上昇し、静止期の細胞数が低下する。インターフェロンやケモカインがニッチによるquiescent細胞の維持に重要な働きをしている。老齢マウスの脳では、ニッチ炎症シグナルとWntのアンタゴニストのsFRP5がquiescenceを誘導する。　参考1/2 Hes1によるAscl1の抑制がquiescentに関与する。　参考1/2/3 dormant　休眠中 　参考 1/1 quiescentとdormantは同義か？ Doetschらの説によれば、神経幹細胞自身は比較的増殖能力が低くdormantな状態を維持している。 実際に増殖過程を増幅しているのは、transit amplifying cellと彼らが呼ぶ細胞であり、最も上皮成長因子 EGFの投与に反応するとされる。 その後に神経前駆細胞となって増殖期から分化過程に入り、遊走しつつ神経細胞に最終分化するとされる。 ラベル保持細胞　label-retaining cell：LRC, BrdU+ LRCslabel ←→retaining法 細胞周期の進行が遅い細胞 細胞周期が早いでは標識（BrdU）が希釈により薄くなるのに対し、分裂の遅い細胞では濃く標識される。

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★胎生期↓に盛んに分裂し、ニューロンを産生する。　←→成体脳

• 胎生初期の脳では、神経幹細胞は指数関数的に増殖して数を増やし、次いで大量の神経細胞を産生する。
• 胎生後期になるとオリゴデンドロサイトの前駆細胞を産み出し、生後の脳ではアストロサイトを産生する。
• マウスの胎生E7.5~E8.5：胚で神経幹細胞が誘導される。Notchシグナルの標的であるHes5遺伝子のプロモーターが脱メチル化を受け、Notchシグナルが伝わる。このDNA脱メチル化にはGcm遺伝子が関わっている：ゲノム複製を必要としない能動的DNA脱メチル化 ↑

  →神経上皮細胞・・・胎生初期の神経幹細胞

  →放射状グリア細胞・・・胎生中期の神経幹細胞

  (Pluripotent cell)　←→pluripotency 　　　　↓ LIF-dependent primitive NSC LIF 反応性の未分化神経幹細胞：epiblast期 　　　　↓ FGF2-dependent definitive NSC：E8.5 　　　　↓ EGF-dependent definitive NSC 　　　　↓ (Differential progenitor cells)

• ゴルジ体膜タンパク質であるRer1をマウスの脳形成時に欠損させると、脳内のγ-セクレターゼが減少することによりNotchシグナルが低下し、神経幹細胞の量が減少する。
  
  
• ニューロンとグリアの由来　←→参考1

  Schaper の一元説 Schaper's unitary theory　←→多分化能/細胞系譜 ニューロンとグリアが共通の神経幹細胞に由来するという説

  Wilhelm Hisの二元説　His' dualistic theory　←→Fate−restricted progenitor説 ニューロンとグリアが異なる母細胞に由来するという説 ニューロンは胚芽細胞（germ cells, germinal cell） から、グリアは海綿芽細胞から発生する。 神経管の神経発生のごく初期から異なる二つの芽細胞が共存する。 神経管形成頃の神経発達の初期段階では、神経管壁に２のタイプの細胞が見られる。一つは神経管壁に沿って盛んに分裂を繰り返えす細胞、もう一つは後に双極性の突起を出し分裂が見られない細胞。Hisは前者を神経細胞の元となる細胞と考え、胚芽細胞と名付け、後者はグリア細胞になる細胞と考え、海綿芽細胞と名付けた。 Hisは海綿芽細胞は中胚葉由来と考え、細胞間に境界がなく、スポンジのように合胞体を作っていると考えたので、そのように命名したが、後に海綿芽細も神経細胞同様外胚葉由来であると考えるようになった。海綿芽細胞と胚芽細胞は発生のごく初期に分裂した別系統のものであると考えた。

  Rakicの二元説：新二元説 放射状グリア細胞は、移動中の神経芽細胞 neuroblastの移動をガイドする役割を終えると、他のグリア細胞の母細胞に転換する。このように放射状グリア細胞はグリア細胞の前駆細胞であることより、同一時期に神経管の上皮の中にはニューロン前駆細胞とグリア前駆細胞という二つの異なる系統の芽細胞が共存する。 発生の比較的後期に２種の芽細胞に共存するという点において、Hisの二元説とは異なる。

  
  
  

  幹細胞ニッチ Stem-cell niche, germinal niche　←→germinal zone/SEZのニッチ 幹細胞の自己複製や分化を調節している微小環境 生体内で幹細胞がその性質を維持するために必要な微小環境である。成体幹細胞は生涯を通して未分化状態を維持するが、培養に伴って増殖能が低下することが知られている。このことから、幹細胞がその性質を維持するためには適切な環境が必要であると考えられており、この環境のことを幹細胞ニッチと呼ぶ。 「ニッチ」という言葉は培養系、生体中のいずれにおいても用いられる。 細胞の微小環境という概念は1967年にRobert MacArthur（1930/4/7〜1972/11/1、米国の生態学者）らによって提唱されたが、「ニッチ」という用語は1978年にSchofieldによって造血幹細胞に対して使われたのが始まりである。 体性幹細胞ニッチ、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸陰窩幹細胞ニッチ、心血管幹細胞ニッチ 脳室下帯や海馬歯状回顆粒層などのように、幹細胞の運命を制御するシグナルを活性化するリガンド分子が豊富に存在する微視的環境 EGFやbFGFのようなシグナル分子が豊富に存在する環境 ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸を発現するプロテオグリカンやGD2、GD3などの糖脂質、およびtenascin-C：TNC、promininやgp130などの糖タンパク質などの複合糖質が豊富に存在する環境 毛細血管から上衣細胞に向けて伸びたフラクトン構造が神経幹細胞のニッチとして機能する可能性がFrederic Mercier *らにより提唱されている。基底膜の主要構成分子であるラミニンやバーシカンによる斑点状のフラクトン構造が上衣細胞層に沿って観察される。 Delta-like 1：Dll1 を成体脳で人為的に失くすと、神経幹細胞は維持されなくなるので、成体の脳で神経幹細胞を維持するニッチシグナルであることがわかった。Dll1は分裂中に偏った局在し、非対称分裂でニューロンに分化する娘細胞に譲渡される。Dll1のシグナルは神経幹細胞が分裂後に休眠状態に戻るのにも必要である。　参考 ホーミング　homing effect ある特定の生理学的な現象を必要とする離れた場所に移動する効果 末梢から移植された幹細胞がニッチに到達する現象 ニッチからサイトカインや接着因子などの誘導シグナルが供給されることと，幹細胞側で誘導シグナル感受機構が作動することの双方がホーミングには必要である． 例えば骨髄では低酸素環境を造血幹細胞が感知することが重要なホーミング機構と考えられる。 ホーミングが成立してはじめて幹細胞はニッチにおいて分化細胞産生が可能になる． 再生医療には、幹細胞の「ホーミング」という性質が利用されている。 ニッチ niche　←→幹細胞ニッチ 「もともと隙間（すきま）」、「適所」 経済分野では「隙間市場」 西洋建築で、厚みのある壁をえぐって作ったくぼみ部分。彫像や花瓶などを置く。壁龕（へきがん）。橋・トンネルなどのわきに設けられる非常用の退避空間。 生態学（生物学）では、「生態的地位」 C・ダーウィンが『種の起原』のなかで「自然の経済における位置」と表現した概念が、後の生態学において具体化され、ニッチ（生態的地位 ecological niche）とよばれるようになった。通常は、ある生物が生物群集内で何をしているかを記述するのに用いられる。 「ニッチ」という言葉は培養系、生体中のいずれにおいても用いられる。 細胞の微小環境という概念は1967年にRobert MacArthur（1930/4/7〜1972/11/1、米国の生態学者）らによって提唱された。 アメリカのヨセミテの動物相を研究したグリンネルJ. Grinnelが最初にniche という用語を定着させた。種というものはそれぞれ特有の生息場所ができると、そこを埋めるように進化する、と彼は考え、その最小の分布単位を生態的地位と規定した。ここでいう生息場所とは、単なる非生物的環境ではなく、植生や食物や敵、競争者も含めた環境を意味する。

★成体脳における神経幹細胞・神経前駆細胞と細胞増殖・神経新生
　←→胎生期/研究法/未分化/増殖マーカー/分化制御因子/neurospher/ADP/増殖因子　参考1/2/3

　[細胞増殖 proliferation]

• 神経幹細胞と神経前駆細胞は増殖細胞であり、成体の脳にも存在する。多くの幹細胞は増殖は遅く、前駆細胞は増殖が速いので、増殖細胞の大半は前駆細胞である。
• 成体の神経幹細胞の多くは休眠状態で存在していると考えられるが、一生にわたって神経細胞やグリアを産みだし続ける。 （神経幹細胞は神経前駆細胞やグリア前駆細胞を産み（？）、神経 or グリア前駆細胞が神経細胞 or グリアを産みだす。）
• 成体脳では海馬・歯状回・顆粒細胞下帯: SGZ （↓）や上衣下層:SEZ（→嗅球↓）は新たな神経細胞を供給し続けている。
• 特に、記憶を司る海馬の歯状回において、齧歯類では毎日数千個の新たな神経細胞が加わっていると考えられている。
• 神経幹細胞の自己複製能、多分化能、細胞死などの細胞の運命は，Notchシグナル、Wnt、JAK／STAT、Ras-MAPK経路などのさまざまな細胞内シグナル伝達経路の活性化を通じて制御されている。
• Eph受容体とエフリンリガンドは成体脳に存在する神経幹細胞とニッチ細胞にも発現している。

　[神経新生 neurogenesis]　←→シナプス形成/血管新生

• 新生ニューロンは既存の神経回路を再編成することで学習や本能行動、脳の損傷の修復などに貢献する。
• 神経幹細胞から産生された新生ニューロンは、樹状突起や軸索を進展させ，シナプス形成を行い、既存の神経回路に組み込まれることが示されている。
• 新生ニューロンは既存のニューロンに比べて、外部刺激に対する応答性が高いことや、長期増強形成の閾値が低いなど，独特な性質も報告されている。
• 放射線照射や細胞増殖阻害剤投与、あるいは遺伝子改変マウスを用いて、成体脳ニューロン新生を阻害したげっ歯類においては、嗅覚関連記憶、空間記憶や恐怖条件づけの異常が報告されている。
• 特に海馬・歯状回（↓）との関連が深いとされている記憶のパターン分離や消去、忘却・幼児期健忘についても、ニューロン新生との関係が報告されている。
• 忘却にも神経新生は関わるか？　1/2/3/4/5
• テタヌス毒素による新生ニューロンの阻害　記憶のパターン分離の阻害　@Tonegawa Lab/Hisatsune Lab
• 神経細胞の新生過程で異常が生じると、うつ病などの精神疾患の原因となる可能性があると考えられている。
• 成体脳での神経新生は海馬歯状回の顆粒細胞下帯：SGZ、嗅球↓だけでなく、扁桃体基底外側核：BLAでも生じる。　参考1/2/3
  
• ヒトのadult neurogenesis　あるかないか問題
  　nature2018/Stem Cell2018
• 90歳代でも歯状回でニューロンが新生するが、老化またはアルツハイマー病進行に伴って縮減はする。　ということは、ヒトでも神経新生はある！　　参考1/2/3

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  ニューロンの新生の活性化因子 豊かな環境 適度な運動??? 学習行動 抗うつ薬 脳虚血 てんかん発作

  ニューロンの新生の不活性化因子 ストレス 適度な運動??? 老化

• ニューロン新生には様々な分泌因子（BDNF、 EGF、FGF、 Shhなど）が影響を及ぼす。
• 気分安定薬の投与によってニューロン新生が促進される。
• リチウムはWntシグナル経路およびイノシトール3リン酸経路の要として抑制性に働くIMPaseとGSK-3βを阻害する。 参考1
• ニューロン新生には多様な遺伝的（内在的）因子がかかわるだけでなく、様々な外的環境要因も大きな影響を与えうる。
• マウスを刺激豊かな環境（玩具のある広いケージや、毎日異なる匂い刺激を与えるなど）で飼育すると、ニューロン新生が増加する。
• てんかん発作は神経新生を促進させる。
• ミノサイクリンは成体のneural precursor cellの自己複製能を亢進させる。*
• ストレスはニューロン新生は低下させる。　参考1/2/

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哺乳類の脳細胞は、大人になってからは二度と再生しないと長年考えられていたが、 成体脳中でニューロンの新生がみられるのは、海馬↓とSEZ（→嗅球↓）である。 　海馬歯状回の顆粒細胞下帯：SGZの1型細胞　→海馬↓　 　側脳室周辺の上衣下層：SEZのB型細胞　→→→嗅球↓ 　*adult neurogenesisは扁桃体基底外側核：BLAでも生じる。　参考1/2/3 　　（neurosphere, Ascl1, Thy1, βIII-tubulin, BrdU, DCX） 神経幹細胞はGFAPを発現しているが、成熟したアストロサイトとは形態的、また機能的に異なっている。この領域では生涯を通して神経系細胞の供給が行われており、新たに産生されたニューロンは記憶、学習行動に関与していることが示唆されている。

海馬の神経新生　hippocampal neurogenesis：AHN 　→海馬歯状回のSGZ　←→ADP@神経新生の研究法　参考1/2 海馬はアンモン角と歯状回 からなるが、ニューロンの新生が起こるのは歯状回顆粒細胞層内側の顆粒細胞下帯：SGZであり、顆粒細胞↓として機能する。 顆粒細胞下帯に存在する増殖性の細胞は、それらの形態や特異的マーカーによって1型、2型、3型の3種類に分類することができる。 1型細胞 early progenitor　←→SEZ-B型 顆粒細胞下帯：SGZに常在する細胞で、成体での幹細胞が維持されている。 神経幹細胞であり、増殖能が半永久的 1型細胞は放射状の突起を持っており、GFAP（アストロサイトのマーカー）やBLBP（放射状グリアのマーカー）、nestin（神経幹細胞のマーカー）、Sox2を発現している。 歯状回に神経幹細胞がいるか、いないか？ Raewyn M. Seaberg and Derek van der Kooy J Neurosci. 2002 Mar 1;22(5):1784-93. 海馬歯状回（DG）単層培養システムでは幹細胞は得られるが、成人DGには常駐神経幹細胞の集団population of resident neural stem cellsは含まれていない。SEZには長期の自己複製能と多能性を有する神経幹細胞が含まれるが、成人のDGには自己複製能が限られた神経およびグリア前駆細胞が別々に存在する。多能性幹細胞ではなく、ニューロン特異的な前駆細胞が、成人期を通して新生されるDGニューロンの源である。 海馬歯状回由来神経前駆細胞ADP（＠朴秀賢先生）は分化能と多能性がある。しかし2a型神経前駆細胞↓ 2型細胞 late progenitor ←→SEZ-C型 2型細胞は 1型細胞の分裂によって産生され、高い分裂能を持つ神経前駆細胞と考えられている。 1〜3日後 GFAPは陰性で、BLBPやnestinの発現と、DCX（未分化なニューロンマーカー）やPSA-NCAMの発現が重複する時期である。 2型細胞はさらに2a型、2b型に分けることができる。 2a型 GFAPは半陽性あり、主にnestinを発現する。 2b型 GFAPを発現せず、DCX（未分化なニューロンマーカー）を発現する。 主にNeuroDやProx1（転写因子）を発現する。 3型細胞 Type-3 ←→SEZ-A型 15〜21日後 分裂後細胞：分裂脳のない未成熟な細胞へと分化していく。 ゆるやかな増殖能を持つ細胞で、神経芽細胞 neuroblastから未成熟ニューロンに移行する細胞である。 3型細胞は幹細胞マーカーを発現しておらず、ニューロンマーカーであるDCX、PSA-NCAM、NeuroD、Prox1を発現する。 3型細胞周辺においてアポトーシスが起こると考えられ、増殖により作られた新生細胞は大部分が淘汰されてしまう。 28〜30日後　分化した細胞となり、神経回路に組み込まれていく。 海馬新生ニューロンは、歯状回の顆粒細胞として機能する。 ←→海馬歯状回顆粒細胞/発生〜新生 歯状回の新生ニューロンは記憶のパターン分離に関与し、CA3がパターン補完に関わる。 成体における神経幹細胞の増殖、分化はホルモンや成長因子、外部環境などの外的因子と、細胞内の転写因子などの内的因子によって調節されている。 胎生期だけでなく成体海馬のSGZにおける神経幹細胞の増殖にもNotchシグナルが関わることが明らかになっていたが、SVZにおいてもNotch1が神経幹細胞の増殖、分化に必要であることが報告されている。 海馬のSGZにおいて、遺伝子の網羅的解析からinsulin-like growth factor：IGF2が神経幹細胞の増殖に関与していることが示された。 マウスの場合、歯状回の細胞のうち新生ニューロンが10%を占めることもある。 ヒトは高齢になっても海馬で1 日に約1400個という安定したペースで新生ニューロンを作り続けている。 90歳代でも海馬でニューロンが新生するが、老化またはアルツハイマー病進行に伴って縮減はする。 歯状回のニューロン新生はアルツハイマー病患者では急激に減少する。健常人ではdoublecortin陽性細胞：DCX+では非新生領域の嗅内野：ECやCA1ではみられないが、DGにはみられる。 　参考1/2/3 アルツハイマー病病のリスク遺伝子としてApoE4があるが、ApoE4を遺伝子導入したマウスでは、海馬のGABA回路のはたらきが低下し、新生ニューロン数も減少することがわかった。このマウスにGABA回路のはたらきを高めるフェノバルビタールを投与すると新生ニューロン数の減少が抑えられる。また、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子であるアミロイド前駆体タンパク質を導入したマウスでは、海馬GABA回路のアンバランスがおこり、新生ニューロンのはたらきが低下することが認められている。 新生した神経細胞ははじめは未成熟な状態↑であるが、やがて成熟し、既存の神経回路に組み込まれていく。 海馬歯状回の神経新生は新しい記憶の形成に重要な役割を果たしていることが報告されてきた。 その一方で、神経新生が起こると、既存の神経回路に再編が生じるため、それまで海馬の神経回路に蓄えられていた記憶は回路の再編に伴って忘却されてしまう可能性があるという指摘もある。* 歯状回での神経新生は個体の成熟過程とともに減少することが知られているが、もし神経新生により記憶の忘却が促進されるのであれば、神経新生が活発な子供の時に経験した出来事の記憶は忘却されやすく、神経新生が少ない大人の時に経験した出来事の記憶は忘却されにくいと考えられる。　←→幼児期健忘 ランニングや抗うつ薬の投与などにより新しい未成熟な神経細胞を増やすと記憶の忘却が促進される。　参考1 メマンチンも神経新生を促進し、恐怖条件付け文脈記憶の忘却を促進させる。社会回避記憶の忘却はPTSDの治療につながる可能性がある。　←→社会的敗北ストレス　 2/2

SEZ→嗅球 olfactory bulb：OB　参考1/2 嗅球の介在神経細胞は発生期だけでなく、生後・成体の脳においても、前脳の上衣下層：SEZで産生され続けている。 上衣下層：SEZで局在する神経幹細胞が、神経前駆細胞に分化した後、側脳室前端から嗅球に延びる吻側遊走経路：RMSを通って移動し、嗅球の糸球体周辺細胞や顆粒細胞になる。 SEZの細胞はB型細胞、C型細胞、A型細胞に分類される。 　B型細胞（神経幹細胞）からC型細胞（一過性増殖細胞）は産生され、C型細胞が自己複製を繰返して集団を増幅させた後、神経前駆細胞であるA型細胞（神経芽細胞）へと分化した後、嗅球に移動する。 V-SVZの背側の神経幹細胞は嗅球の顆粒細胞とTH 陽性細胞の糸球体周辺細胞生み出すが、 カルビンディン陽性細胞の糸球体周辺細胞は少ない。 参考　1 V-SVZの腹側の神経幹細胞は嗅球深層の顆粒細胞とTH 陽性でない糸球体周辺細胞を生み出す。 嗅球の介在ニューロンは側脳室の外側壁由来だけではなく、外套 palliumに面した外壁由来のものや、吻側遊走経路：RMS内の中隔と外套に面した内壁由来のものもある。従って、嗅球の介在ニューロンは胚の終脳の主要な領域に関連する生後の広範な　germinal layerに由来する。 V-SVZの背側の神経幹細胞は嗅球の顆粒細胞とTH 陽性細胞の糸球体周辺細胞生み出すが、 カルビンディン陽性細胞の糸球体周辺細胞は少ない。 V-SVZの腹側の神経幹細胞は嗅球深層の顆粒細胞とTH 陽性でない糸球体周辺細胞を生み出す。

○細胞増殖/神経新生の研究法　←→成体細胞の増殖/神経新生↑/マーカー↓/細胞周期関連物質

細胞増殖の解析法：DNA合成量を指標として間接的に細胞 増殖を測定する方法 チミジン thymidine　←→チミジンキナーゼ ピリミジン塩基であるチミンとデオキシリボースが結合したヌクレオシド チミジンはDNAの構成要素で、遺伝子が複製される時（細胞が分裂する時）に、細胞核内に取り込まれる。 チミジン類似体：トリチウム化チミジン、ブロモデオキシウリジン（BrdU） トリチウム化チミジン：3H-thymidine 水素の放射性同位体、トリチウムで放射標識したチミジン、DNAの標識に使われる。 放射性チミジンを使えば、分裂細胞を正確に検出できる。---オートラジオグラフィー法 Joseph Altman（1925 〜 2016, ハンガリー生まれ、米国の生物学者）は1962年に、3H-thymidineラベルのオートラジオグラフィー法の研究で、成体脳でもニューロン新生が起こっていることを発見した。 オートラジオグラフィー法では放射性同位元素を扱わなければならない上に、新生ニューロンの検出に１ヶ月以上かかるために、3H-thymidineラベルの研究は現在ではほとんで行われていない。 5-bromo-2′-deoxyuridine ：BrdU　←→細胞周期　参考1 DNA前駆体の一つのチミジンのアナログ 1950年代抗がん剤として紹介された。 Frank Corotto*/*↑とJoel Marunik（コロンビアのミズリー大学）が1993年に初めて放射線同位元素を使わないBrdU法で成体のニューロン新生の研究をした。BrdUと共焦点顕微鏡を使ってSEZのニューロンが嗅球に移動し、それらのニューロンは神経特異エノラーゼ：NSEとカルレチニンを発現していた。 Peter S. Eriksson（1959/6/5〜2007/8/2, Sahlgrenska University Hospital in Gothenburg, Sweden）とFred H. Gage↑らは、、抗がん剤（BrdU）を服用したがん患者の協力を得て、その患者が死亡した後に、脳組織標本を詳しく調べることにより、大人の脳の中でも、少なくとも、海馬の歯状回で、ニューロンが新生していることを見出した。　参考1/2 細胞分裂するためには必ずDNAが複製されるが、細胞周期のS期に複製中のDNAに取り込まれる。 BrdU存在下でDNAが複製されると、チミンの代わりにBrdUを含むゲノムができる。 BrdUを取り込んだ細胞は、抗BrdU抗体を用いて検出することができる。 BrdU陽性：S期を経て分裂した細胞 　BrdUを取り込んだ後に分裂、増殖した細胞 動物にBrdU（50-250mg/kg）を腹腔内注射し、一定時間後に動物を4%パラフォルムアルデヒドなどで灌流固定する。 注射後、30分〜2時間後に固定すれば、増殖細胞（神経幹細胞と神経前駆細胞）だけが標識される。 1〜3日後では、分裂活性を持つ細胞の他に、分裂能を失った細胞（未成熟ニューロン）も標識されていると考える。 BrdU投与後1〜2週間経てば、大分部の細胞は、分裂活性を失った未成熟ニューロンになる。 2週間以内に細胞死する細胞も少なくないが、6か月後まで陽性細胞は認められる。 対照群と実験群を比較するような動物実験では、BrdUの取り込の個体差を減少させるため、一日に数回投与する方が良い。 short-study proliferation long-study 1/1 differentiate, neurogenesis 定量　1/ 2　＠stereology LD50: 5-Bromo-2'-deoxyuridine - Toxicity Data: Oral LD50 1/2 rat Oral LD50 (rat): 8400 mg/kg Intraperitoneal LD50 (rat):1500 mg/kg Subcutaneous LD50 (rat): 3900 mg/kg mouse Oral LD50 (mouse): 9100 mg/kg Intraperitoneal LD50 (mouse): 3050 mg/kg Subcutaneous LD50 (mouse): 3500 mg/kg IdU/CldU 5 - ヨード - 2' - デオキシウリジン、(+)-5-Iodo-2'-deoxyuridine：IdU 5 – クロロ - 2' - デオキシウリジン、5-Chloro-2'-deoxyuridine：CldU DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ 増殖細胞および娘細胞をラベルする。 二種類のプローブを同時に用いることで、経時変化の観察など複雑な研究が可能 複製フォークの進行速度、安定性、複製起点の点火の研究に有用 BrdU 抗体および IdU 抗体で検出する。 5-ethynyl-2′-deoxyuridine：EdU　参考1/ 2/3 アルキンを持つ分子 BrdUと類似の増殖期マーカー fluorescent azideであるため、マイクロウェーブ処理など不要 EdUはBrdU、IdU、CldUなどの他のチミジンアナログの検出とは違い、抗体による免疫学的検出を必要としない。 EdUの検出にはClick反応による化学的検出法を用いる。 組み込まれたEdUは、銅触媒[3 + 2]付加環化（“Click” 反応）におけるEdUのエチニル基と蛍光azideとの反応によって検出する。 蛍光azideは充分小さいので、効果的に二本鎖DNAに拡散し、組み込まれたEdUのエチニル基と反応することができる。その結果、EdU染色はDNA変性なしに、検体の物理的完全性および種々のタンパク質マーカーの抗原性の両方を保存する。 マイルドなクリックケミストリープロトコールは、BrdUプロトコールとは異なり、細胞のエピトープを破壊せず、抗体標識、蛍光タンパク質および一般的な細胞染色法に適している。 クリックケミストリー Click Chemistry 直接標識または抗体ベースの二次検出技術以外の新たな検出法 比較的シンプルな構造の化合物同士を高い反応性と選択性で炭素-ヘテロ 原子結合反応により新たな機能性分子を合成する手法 2001年にK. B. Sharpless（スクリプス研究所）によって提唱された。 この“クリック”という言葉は、あたかもシートベルトのバックルがカチッ音を立ててつながるように2つの分子が簡単につながることに由来する。 1961年にR. Huisgenがアジド類とアルキン類による[3+2]双極子付加環化により、安定な1,2,3-トリアゾールを合成する反応を開発した。1,2,3-トリアゾール環は酸化や還元を受けることがなく、基質同士を強固に連結させる手法として最もよく用いられ。 クリック反応 銅触媒を用い、ウラシルに結合したアルキル基と蛍光色素が標識されたazide（carboxamido-6-azidohexanyl）の環化付加反応（copper -catalyzed azide alkyne cycloaddition：CuAAC） 小さい標識：アジドとアルキンは、生体分子に組み込み可能な、不活性かつ安定した極小の成分である。ヌクレオチド、糖、またはアミノ酸にタグ付け可能であり、細胞内で機能し続け、核酸、複合多糖類、またはタンパク質に対して正常に結合する上で小さく有用である。 検出する側である azide の分子量が極端に小さいため、膜透過性も高いので、DNAの螺旋構造内に入りやすく、感度が高く、バックグラウンドが低くできる。 特異的検出　：アジドとアルキンは、「click」反応において高い特異性をもって互いに結合し、安定かつ不活性な生成物を形成する。 生体内にazideとアルキル基が存在しないため特異的に反応が起こる（bioorthogonal）。 無極性であり結合しやすい。そのため、増殖細胞に取り込まれた EdUはBrdU のような検出前DNA開環処理を必要とせず、蛍光標識されたazideとの化学反応によって容易で安定した検出ができる。 アジ化物、アジド、azide −N3 原子団を持つ化合物の総称 アジ化物イオン (N3−) の塩も、置換基であるアジ基 (−N3) が共有結合した化合物もアジド と呼ばれる。 特にアシル基にアジ基が置換した化合物を酸アジドと呼ぶ。 アジドは1,3-双極子であるので、各種不飽和結合と [3+2]型の付加環化反応を起こす。例えばニトリルに付加してテトラゾール環を与える。またアルキンとも反応し、1,2,3-トリアゾールを形成する。この反応は銅イオンの存在下で加速され、水や各種官能基の存在に影響を受けず極めて収率よく進行する。Karl Barry Sharpless（1941/4/28〜, アメリカ合衆国の化学者、2001年に野依良治先生らとノーベル化学賞）らが推進するクリックケミストリーの中心的な反応として注目を浴びている。 アジ化ナトリウム=ナトリウムアジド sodium azide：組成式 NaN3 で表される、白色無臭の塩である。量 65.01、融点 275℃、沸騰する前に分解するので沸点は無い。室温では六方晶系の結晶である。窒化ナトリウム Na3N（式量 82.976）と混同されやすいが、これとは全く別の化合物である。 アルキン、alkyne 分子内に炭素間三重結合を1個だけ持ち、一般式が CnH2n−2 で表される鎖式炭化水素の総称である。 アセチレン系炭化水素とも呼ばれる。広義には分子内に非環式および環式の C−C 三重結合を持つ化合物全般を指し、この場合「アセチレン」の語を一般名称として用いる。 アルキル基 alkyl group： メタン系炭化水素（＝脂肪族飽和炭化水素＝アルカン）から水素１原子を抜いたもの Ki67＝MKI67=Antigen KI-67＝MKI67 gene：antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 細胞周期関連核タンパク質 MKI67 遺伝子にコードされる、細胞分裂関係タンパク質 ドイツのKiel大学の病理学教室でホジキンリンパ腫である L428 細胞をマウスに注射して作製したモノクローナル抗体で、特異的に増殖細胞と反応するものが 67 回目の実験で初めて同定され，ドイツの Kielの最初の 2 文字に由来し、67 回目の試みで初めて認められたということで，Ki67 と命名された。 近年、乳がんでは、このKi67を効果予測因子として評価する研究に注目が集まっている。 10番染色体長腕に存在する遺伝子により発現するタンパク、核に存在するタンパク質 MKI67遺伝子によってコードされるタンパク Ki-67は核膜の分解後に生物学的界面活性剤として働き、染色体が崩れてひとかたまりになるのを防ぐ。 細胞周期関連核タンパク質、増殖細胞のマーカー 分裂中の細胞の核で発現される抗原 Ki67発現量と腫瘊の悪性度には正の相関が見られるため、腫瘍組織における増殖細胞を検出するマーカーとしても有用 増殖中の細胞では、G1期後期、S期、G2期、M期において発現するが、増殖を休止しているG0期においては存在しないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとして用いられる。 増殖細胞核抗原　proliferating cell nuclear antigen：PCNA DNA複製に関与するホモ三量体タンパク質(261 アミノ酸; 29 kDa) DNAポリメラーゼδのコファクターとして機能する。 リーディング鎖の伸長時に、ポリメラーゼのヌクレオチド処理能力を向上させることで、真核生物の DNA 複製の制御に働く。 PCNAは、もともと細胞周期のDNA合成期の細胞の核で発現する抗原として同定された。 S期に特異的に発現し、DNA複製に関与する。 結晶構造データからPCNAホモ3量体リングがDNA二重らせんに沿って囲み、滑ることができると示唆された。 DNA複製、DNA修復および細胞周期制御に関与する多数のタンパク質はDNA に直接結合するよりむしろPCNAと結合することに依って、DNAのプロセッシンの諸過程を促進している。 PCNAはDNA合成期の有用なマーカー、ある種のがんのマーカーでもある。 リン酸化ヒストン3 phosphorylated Histone-3：PH3　←→増殖細胞のマーカー リン酸化ヒストン：PH3の発現時期は主にG2期とM期に限局している。 抗リン酸化ヒストンH3は、有糸分裂の特異的なマーカー

Nestin-CreERT2-Creマウス タモキシフェンにより活性誘導可能な組み換え酵素であるCreERT2を、神経幹細胞において働くNestin・プロモーター／第2イントロンの制御下に発現するトランスジェニックマウスなので、成体のマウスにタモキシフェンを投与することによって、神経幹細胞に効率の良いCre組み換え活性を誘導できる。

neurosphere assay　←→接着性単層培養/3次元培養 成体脳の脳室下層に存在する神経幹細胞／前駆細胞のin vitroでの培養 embryoのganglionic eminencein vitro培養 ニューロスフェア neurosphere　参考1/2 神経幹細胞を含む球状の神経系細胞の塊 clonal colony-forming 脳室下帯から分取した細胞をEGF/FGFを含む無血清培地にて培養して得られる球状の浮遊細胞塊 1992年にカナダ （当時Calgary大学病理学）のBrent ReynoldsとSamuel Weissは、成体マウスの線条体から取り出した細胞にEGFを添加して、分裂増殖しながら神経細胞やグリア細胞を生み出す細胞塊を分離することに成功し、この細胞塊を「neurosphere」と名付けた。 Science. 1992. 255 (5052): 1707–1710. この線条体由来ニューロスフェアは、後に脳室下帯（SEZ）に存在する神経幹/前駆細胞に由来することも確認された。 1次ニューロスフェア　primary neurosphere 脳室下層に存在する神経幹細胞／神経前駆細胞の培養　大多数は神経前駆細胞 自己複製能の評価 2次ニューロスフェア　secondary neurosphere 1次ニューロスフェアをさらに継代培養したもの 神経幹細胞を浮遊培養で継代培養する方法として用いられる。 減少させる因子：生前ストレス、成体におけるストレス、グルココルチコイド 増加させる因子：新生児期ストレス、抗うつ薬、気分安定薬 脳室下帯由来のニューロスフェアは強制水泳（成体におけるストレス）で減少し、抗うつ薬（フルオキセチンやイミプラミン）の投与やセロトニンの脳室内投与で回復。増減にはコルチコステロン（マウスの副腎皮質ホルモンと5-HT2C受容体が関与する。　→参考1/2 気分安定薬（リチウム、バルプロ酸、カルバマゼピン）は、血中治療域よりはるかに低い髄液内治療域濃度において、マウス神経幹細胞の自己複製能（未分化性）を亢進させる。気分安定薬は神経幹細胞内のNotchシグナルを増強する。 　→参考1/2 生前ストレスで減少し、幼少期ストレスーhandlingで増加。 　→参考1

接着性単層培養　adherent monolayer culture　←→neurosphere assay/単層培養　参考1 ニューロスフェアとは異なり、前駆細胞のほとんどは均質な集団からなり、単一細胞における分化プロセスを追跡するのに有用であるという大きな利点がある。 細胞がより孤立し均質なままである接着性培養は、ニューロスフェアの異種性を排除することができる。これらの増殖条件下で、前駆細胞は急速に増殖し、ほとんどすべての細胞が分裂し、特徴的な神経前駆体マーカーNestin、Sox2、およびBLBPを発現する。 単層培養系の主な弱点は、個々の前駆体由来クローンをモニターおよび定量することができないことである。

海馬歯状回由来神経前駆細胞、adult dentate gyrus-derived precurser cells：ADPの培養　←→海馬歯状回@細胞増殖 bFGF依存性に増殖する成体海馬歯状回由来神経前駆細胞(ADP)の培養系 ＠朴秀賢先生　1/2/h PND 56 (8-week old) のラットの脳を取り出し、ice cold PBS（pH 7.4）で洗浄し、 Brain Slicer（室町）*で1 mm の冠状脳切片を作成し、顕微鏡下で歯状回部分の組織を切り出す。 歯状回はプロテアーゼ （パパイン, dispase II）とDNaseの混合液で処理する。 percoll溶液を用いて分画し、目的の画分からADPを得る。 fetal bovine serumとペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12混合培地を添加したコートなしディッシュに細胞を撒き、5% CO2/37°C の条件でインキュベートする。 一晩インキュベートした後、Neurobasalメディウム 、ビタミンAを抜いたB27サプリメント、1 mM L-glutamine、ペニシリン-ストレプトマイシン、および20 ng/ml bFGFを含む増殖メディアに交換し、単層培養する。 ポリ-L- オルニチン/ラミニンでコートしたディッシュに増殖メディアを入れて、37°Cで培養し、2〜3日毎に半分を新しいメディアに交換する。 細胞が80–90%に達したらトリプシン処理して、密度が約 1 × 104 cells/cm2になるように細胞を撒いて、モニターする。 ADPの増殖は限定的であるが、約10回 or 20代?継代できる。 歯状回SGZの2a型細胞に対応 自己複製能（BrdU-Nestin）と多分化能がある。 ADPはニューロン（BDNF添加→anti-Tuj1）、アストロサイト（レチノイン酸/FBS添加→anti-GFAP）、オリゴデンドロサイトIGF添加→anti-O4）に分化する多分化能がある。 nestin陽性、GFAP半陽性SOX2陽性であり、2a型神経前駆細胞と考えられる。 グルココルチコイド受容体のアゴニストであるデキサメタゾン：DEXはADPの増殖を抑制するが、分化には関与しない。SSRIを含む数種類の抗うつ薬は増殖促進作用を示さず、DEXの抑制にも作用しない。SSRIは間接的な経路（cAMP-CREBカスケードなど）を介して神経細胞の増殖を阻害する。 グルココルチコイドはGSK-3βのTyr216のリン酸化を増加させることでβ-カテニン/TCF pathwayを抑制してADPの増殖を抑制する。リチウムは活性化されたGSK-3βを阻害することでグルココルチコイドによるADPの増殖抑制を回復させる。　参考1/1 バルプロ酸もリチウムと同様にグルココルチコイドによるADPの増殖抑制を回復させる。 ラットの母子分離において、ADP細胞培養の神経分化能低下、レチノイン酸受容体：RARαの遺伝子発現低下、RARαプロモーター領域のDNAメチル化が亢進した。5-aza-dC（DNMTの阻害剤）で抑制されたので、母子分離によって減少した神経への分化はDNAメチル化が関与していると考えらえる。　参考1

ラベル保持法、label retaining法　←→細胞周期/quiescent/ラベル保持細胞 細胞分裂の遅い細胞を分裂時に核に取り込まれる物質を利用して標識（ラベル）する方法 一定期間標識物質を投与した後に投与を中止すると、分裂の早い細胞では標識が希釈により薄くなるのに対して分裂のゆっくりした細胞では標識の濃度が維持（label retain）される。 in vivoでは幹細胞がゆっくり分裂することを利用した検出法



• 神経幹細胞様細胞

  →網膜神経幹細胞 retinal stem cell　参考1 Derek van der Kooyら Ciliary Epithelium　網様体上皮細胞 網膜辺縁部に近接する網膜先端部ではWnt2bが発現しており、網膜辺縁部の幹細胞のもつ増殖能・未分化性を維持している。

  傷害誘導性神経幹細胞 Injury-induced Neural Stem/Progenitor Cell：iNSPC　参考1 脳梗塞などの脳損傷後に神経幹細胞が出現する。　←→脳虚血モデル SVZ 由来の神経幹細胞とは発現遺伝子が異なる。 血管周囲に存在してPDGFRβ、NG2などのペリサイトマーカーを発現することから、ペリサイトを起源とする神経幹の可能性

  神経膠芽腫幹細胞様細胞 グリオブラストーマ幹細胞 glioblastoma stem-like cells：GSC 激しく増殖する腫瘍の中に、ゆっくりとしか分裂しない幹細胞様の細胞が存在している。 膠芽腫↓を維持している幹細胞 自己複製能・多分化能を持つ脳腫瘍の起源細胞 Bre1aが増殖と分化を促進し、腫瘍細胞が増殖する。 内皮細胞へ分化し、血管新生も誘導する。 がん幹細胞様細胞がNotchシグナルによって内皮前駆細胞に分化し、さらにこれらがVEGF刺激によって血管を形成する。　参考Nature 神経膠腫 glioma　←→グリア 神経膠腫：神経膠細胞から発生する悪性腫瘍 星細胞腫 astrocytoma：WHO grade II 乏突起神経膠腫 oligodendroglioma：WHO grade II 退形成星細胞腫 anaplastic astrocytoma：WHO grade III 退形成乏突起神経膠腫 anaplastic oligodendroglioma：WHO grade II 膠芽腫、多形性膠芽腫、悪性神経膠腫 glioblastoma： GBM：WHO grade IV　←→グリア芽細胞 神経膠腫の中でも、特に悪性度が高いことで知られている。 原発性脳腫瘍のうち悪性度が最も高く、浸潤の早さから手術による全摘は困難とされており、平均生存期間は約１年と極めて予後不良な脳腫瘍である。 自己複製能・多分化能を持つ神経幹細胞は脳腫瘍の起源細胞の一つと考えられている。 神経膠芽腫幹細胞様細胞が腫瘍を維持している。 ５年生存率は10%以下、平均余命は１〜1.5年と予後不良である。 膠芽腫の全生存期間は14.6ヶ月とされていて、欧米での膠芽腫の治療成績を見る限り放射線治療単独群に比してテモゾロミド併用群では2.6ヶ月程度の生存期間の延長が認められている。　←→MGMT 悪性グリオーマに対する遺伝子治療において、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK遺伝子）を腫瘍細胞にあらかじめ発現させておき、その後にガンシクロビルを点滴静注し、HSV-TKが発現した腫瘍細胞を選択的に死滅させようとする治療方法がある。 分子標的薬のベバシズマブはVEGF対する抗体で、悪性神経膠腫の血管新生を抑制するのが目的であり、がん細胞そのものを標的としたものではない。 PCV療法（プロカルバジン、ロムスチン、ビンクリスチン）、およびカルムスチン（BCNU） 悪性神経膠腫分子標的ペプチド (Malignant glioma molecular target peptide)　参考1/2/3 悪性神経膠腫の特徴は、腫瘍細胞の一部が血液脳関門を保ったまま増殖しているので、腫瘍に特異的な分子標的プローブを作製しても、血管経由で抗腫瘍物質を腫瘍に到達させることができない。 椎野顯彦先生（滋賀医科大学）/谷垣 健二先生*（滋賀県立成人病センター）の開発 ファージディスプレイ法を用いて血液脳関門を透過する2種類のペプチドプローブ(GLA、GYR)をスクリーニングした。 手術で得られた悪性神経膠腫の組織から腫瘍幹細胞を樹立し、これをSCIDマウスの脳に移植するPXDモデルを作成し、Ph.D.C7Cの静脈注射を繰り返す（バイオパンニング）ことにより、１億以上の組み合わせから有望な２つを選択しBTと命名した。治療効果を調べる目的で、BTに HSP90阻害作用のある ゲルダナマイシン：GMを結合させたものをPDXマウスに静脈投与し腫瘍縮小効果をMRIで調べた。GM単独投与よりも体重減少などの副作用は軽減したが、BT-GM複合体はGM単独よりも腫瘍の縮小効果は減弱した。GMは腫瘍細胞に選択的に取り込まれていたことから、原因として腫瘍細胞のオートファジー機構が考えられた。BT-GM 複合体がエンドサイトーシスにより取り込まれた後、細胞質に移行することなく分解/排出されたと考えられる。 これに対し、endosome内で活性化するPMAPs、エンドソームの膜を不安定にするaureinなどのペプチドをGM-BT複合体に結合させることにより複合体をエンドソームから脱出させることにより、腫瘍の縮小効果を得ることかできるようになった。 動物のMRI 　参考3/1/2/ 混合性腫瘍 髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、悪性リンパ腫、胚細胞腫瘍、髄芽腫、上衣腫 神経芽腫、神経芽細胞腫　neuroblastoma　←→神経芽細胞/培養細胞株Neuro2A/網膜芽細胞腫　参考1 小児がんの組織型の一種　小児がんにおいては白血病についで患者数が多い。 神経堤細胞に由来する悪性腫瘍で、主に副腎髄質や交感神経幹から発生する。副腎から発生する腫瘤として発見される。転移先として肝臓、骨、骨髄が多い。 尿中腫瘍マーカーはVMAとHVA。血清NSEが高値を示す。遠隔転移診断は骨シンチ及びMIBGシンチによる。 一般に18ヶ月までに発症する場合は予後が良いことが多いが、18ヶ月以降の場合は予後不良が多い。また、神経節に生じた腫瘍は予後良好。腫瘍遺伝子N-Mycの増幅や染色体重複があると予後不良。日本では年間150例発生する。 Neuro2A: N2a　　→培養細胞株Neuro2A ヒト神経芽腫SHSY-5Y細胞等

  neurosphere↓

  奇形腫　テラトーマ teratoma 奇形腫：2胚葉性あるいは3胚葉性成分を有する、最も高分化な胚細胞性腫瘍 ES細胞やiPS細胞を免疫不全マウスの皮下などに注射することによって形成されるテラトーマには、様々な種類の組織が混在している。 テラトーマを観察し、様々な組織に分化していることを確認することは、細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の１つである。

  
  
  
• 神経前駆細胞

  神経前駆細胞 neural progenitor cell　←→前駆細胞/マーカー/グリア前駆細胞/神経の発生/皮質板形成/ 神経幹細胞の分裂によって生まれ、限られた回数の分裂の後に分化を遂げるように運命づけられた細胞 神経のみに分化する未分化細胞であるが、神経細胞に運命決定された2次的な増殖細胞 中間前駆細胞　Intermediate progenitor：IPC（Basal progenitor） 放射状グリアの分裂によって生じ、脳室下帯で分裂してニューロンを生み出す神経前駆細胞 顕著な細胞突起を持たない細胞 特に哺乳類大脳の神経発生中期以降に多く観察される。 対称分裂・分化特異的分裂を行う。 Tbr2を発現し、Pax6の発現が抑制されている。 outer radial glia：oRG細胞 霊長類の胎生期大脳の外側脳室下帯 ourter SVZ：OSVZで神経細胞を産生する。 apical endfoodが無く、基底膜方向にのみ一本の細胞突起を持つ。 髄膜方向へtranslocationしながら分裂すると言う点で放射状グリアと異なる。 basal processがあり、非対称分裂をして自身を複製すると言う点で、中間前駆細胞と異なる。 oRGは中間前駆細胞を産む。 oRGは全増殖細胞の40-75%を占めると見積もられている。 げっ歯類の脳室下帯にもoRGは少数存在する。例外はあるが、進化過程における大脳皮質の発達の程度はoSVZの細胞増殖活性と相関関係にあり、大脳皮質形成における脳室下帯の役割が注目されている。 上衣下層SEZのC型細胞 神経幹細胞であるB型細胞から産生される。 C型細胞は自己複製を繰返して集団を増幅させた後、A型細胞へと分化する。 SEZで産生されたA型細胞はRMSを移動し、約4週間かけて最終的に嗅球の顆粒細胞および糸球体周辺細胞に分化する。 嗅球へ移動後、ニューロンに分化して臭いの識別や記憶の形成に関与していることが示唆されている。 海馬歯状回の顆粒細胞下帯：SGZの1型細胞と2型細胞　←→ADP@神経新生の研究法

  神経前駆細胞 neural precursor cell：NPC? 　　　↓

  神経芽細胞 neuroblast　←→グリア芽細胞 無極性ニューロン 胎生期では 　→カハール・レチウス細胞、サブプレートニューロン 胎生期に発生する幼若なニューロン 将来神経細胞に分化すべき胎生期細胞 神経幹細胞は非対称分裂を行い、2個の異なる娘細胞（神経幹細胞と神経芽細胞）になる。 神経芽細胞には分裂能はなく、2度と分裂サイクルに入らない。 成体脳では 　→海馬歯状回DGのSGZの3型細胞 　→上衣下層:SEZのA型細胞

  ↓ 未熟な神経細胞 immature neuron　←→マーカー 　　　↓

  成熟した神経細胞 cell　←→マーカー

  
  
  
• グリア前駆細胞　←→グリア細胞/神経前駆細胞

  グリア芽細胞 glioblast（神経膠芽細胞）　←→神経芽細胞 グリア系に運命が方向づけられたグリア前駆細胞 胎生中期以降はグリア芽細胞へと分化する。 アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することができるグリア前駆細胞 グリア形成期に放射状グリア細胞は非対称分裂により、放射状グリア細胞とグリア芽細胞を作る。 グリア芽細胞はオリゴデンドロサイトとアストロサイトの両者を産生するか、それともアストロサイトのみの産生に特化した前駆細胞が出現するのか? Olig2転写因子を発現したグリア芽細胞（O-2A前駆細胞）の細胞系譜解析では、マウスE17からオリゴデンドロサイト、さらに上衣細胞が産み出されることが明らかにされている。 →tripotential glial restricted precursor cells：GRP →bipotential O2A/OPC →O-2A前駆細胞 グリア芽細胞、またはアストロサイト、オリゴデンドロサイトががん化したものが膠芽腫である。

  海綿芽細胞 spongioblast　←→Wilhelm Hisの二元説 神経上皮細胞の脳室端で観察される双極型をした細胞 グリアを生み出す細胞

  アストロサイト前駆細胞 astrocyte progenitor cells　←→分化制御因子 アストロサイトへの分化が運命付けられた前駆細胞 放射状グリアから発生する。 ニューロン産生からグリア産生へと放射状グリアの性質が変移する過程には、外因的要素（CNTF, LIF, CT-1など）と内因的要素（JAK-STAT経路、アストロサイト関連遺伝子のエピジェネティクスなど）が密接に関連している事が明らかとなってきている。 Martin C. Raffらが1980年代初頭にラットの網膜神経を培養して、アストロサイトを分類した。 TypeⅠアストロサイトとTypeⅡアストロサイトに大別されたが、現在ではそれらの呼称は用いられなくなった。 tripotential glial restricted precursor cells (GRP) グリアに限定された三分化能前駆細胞 bipotential O2A/OPC オリゴデンドロサイトとTypeⅡアストロサイトの前駆細胞 オリゴデンドロサイトの始原細胞でもある。

  オリゴデンドロサイト前駆細胞 olygodendrocyte progenitor cells, OLG progenitor cell ：OPC 　　　oligodendrocyte precursor cells　←→分化制御因子/NG2グリア　参考1 オリゴデンドロサイトとなるよう運命づけられた細胞で、オリゴデンドロサイトの形態的・分子的特徴を持たないものをオリゴデンドロサイト前駆細胞 オリゴデンドロサイトの性質を備えながら髄鞘を作らない細胞も生み出す。 OPCは、転写因子Olig2とNG2プロテオグリカンの表面発現の活動によって特徴付けられる。 NG2 chondroitin sulfate proteoglycan を細胞膜に発現している。 OPCは成体脳にも豊富に存在し、オリゴデンドロサイトへの分化能を有するだけでなく、神経細胞やアストロサイトにも分化しうる。 血小板由来増殖因子受容体 PDGFRα：OPCの系譜マーカーとして見出された。 NG2抗体は、培養系ではO-2A前駆細胞を標識し、生体内でもPDGFRα陽性細胞を標識することから、OPCで発現していることが明らかにされた。 移動能と増殖活性は高い。 オリゴデンドロサイトの発生 参考1/2/3/4/5/ 胎生期のオリゴデンドロサイト前駆細胞：OPCの出現は脊髄、大脳共に腹側領域で観察される。脊髄ではpMNドメイン（motor neuron progenitor (pMN) domain）から運動神経が産生された後、胎生12日〜オリゴデンドロサイト前駆細胞が産生される。 脊髄のオリゴデンドロサイトの分化誘導はfloor plateから分泌されるsonic hedgehog：Shhによって誘導される。roof plateから分泌されるWntsやBMPsによって分化誘導は抑制される。pMNドメインに特異的に発現しているbHLH型転写因子のOlig2がオリゴデンドロサイトの産生に重要である。 前脳のオリゴデンドロサイト前駆細胞は胎生12日前後に内側基底核原基：MGEの脳室層から産生される。脊髄と同様にその発生制御にはOlig2、Shh、BMPsなどの因子が関わっている。MGEで産生されたオリゴデンドロサイト前駆細胞は腹側領域全体へと移動し、さらに大脳皮質側へと移動する。 この時期の背側の脳室層に存在する神経幹細胞・前駆細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞を産生しない。オリゴデンドロサイト前駆細胞はShhによる強い誘導を受け、先ず腹側領域から産生され、組織全体へと移動する。 MGEのOPCはNkx2.1陽性でE12.5に出現し、外側基底核原基：LGE及び尾側基底核原基 ：CGEのOPCはGsh2陽性でE15.5に出現し、cortical ventricular zone（lateral dorsoventral boundary）のOPCはEmx1陽性で誕生時に出現する。　参考1/1 Nestin-CreERマウスとOlig2-CreERマウスを使った実験から、大脳皮質のオリゴデンドロサイトは胎生16日前後から産生されることが確認された。 O-2A前駆細胞 　＝Olig2陽性グリア前駆細胞 Oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) progenitor cells A2B5陽性でGFAPにもGalCにも陽性を示さない段階のもの ラット視束から初めて見いだされたグリア芽細胞であり、in vitroの特定の培養条件下においてオリゴデンドロサイトとTypeⅡアストロサイトのいずれにも分化し得ることから、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトに共通する前駆細胞の存在が示唆された。 O-2A細胞をin vivoへ移植した場合にはオリゴデンドロサイトへのみ分化することから、現在ではO-2A細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞と考えられている。 O2A前駆細胞は、新生児ラットの視神経や大脳皮質をフラスコで2週間程度培養し、その後フラスコを激しく水平方面に激しく1晩振盪（200rpm以上）することにより浮遊してくる。この浮遊細胞を集め、ミクログリアも何もコートしていないプラスチックペトリ皿に付着させることで除いて継代培養すると、O-2A細胞が80〜90%程度含まれるenriched cultureとなる。A2B5抗体を培養基質に塗布して、これに接着する細胞を集めることにより95%以上の純度でO-2A細胞を集めることができる。培養条件により、アストログリア、またはオリゴデンドロサイトに分化させるようにコントロールできることから、細胞分化調節機構解析のモデル細胞として扱われてきた。しかし、マウス胎仔および新生仔の脳の培養細胞では、同じような手順で行ってもO-2A細胞のenriched cultureは難しい。

  →オリゴデンドロサイトのマーカー 　MAG、CNPase、GSTπ

○ニューロン新生の分子マーカー　←→　分化制御因子/神経新生の研究法/増殖因子/層特異的マーカー　参考1

	神経 幹細胞	前期 神経前駆細胞	後期 神経前駆細胞	未成熟 ニューロン	成熟 ニューロン
nestin/Sox2/ Pax6	+	+	△	ー	ー
Ki67/PCNA/PH3	途中から	＋	＋	ー	ー
GFAP	+	△	ー	ー	ー
FABP7/BLBP	＋	＋	途中まで	ー	ー
Mash1	途中から	途中まで	ー	ー	ー
Tbr2	ー	途中から	途中まで	ー	ー
Hu	ー	＋	＋	＋	＋
PSA/DCX/NeuroD	ー	ー	＋	＋	ー
NeuN	ー	ー	ー	途中から	＋
βIIItubulin ＝TuJ-1				＋
MAP2					＋
calbindin	ー	ー	ー	ー	＋





細胞増殖 proliferationのマーカー　←→成体脳の細胞増殖 神経幹細胞と神経前駆細胞は増殖細胞であり、多くの幹細胞は増殖は遅く、前駆細胞は増殖が速いので、増殖細胞の大半は前駆細胞であり、ごく一部の細胞のみが幹細胞である。 増殖細胞のその後の発生運命を追跡するのでなければ、Ki67、PCNA、リン酸化ヒストン：PH3などの、細胞周期に関連した分子マーカーによって、増殖細胞を検出するのが簡便である。 Ki67は現在最もよく使われている増殖細胞のマーカーである。 細胞周期のG1後期からM期に発現しているので、ほぼ増殖細胞の全体像を捉えることができる。 PCNAは細胞周期全体で発現しており、Ki67よりも発現期間が長いことが報告されている。 リン酸化ヒストン：PH3の発現時期は主にG2期とM期に限局している。 神経幹細胞や神経前駆細胞の分裂によって生まれた新生細胞はBrdUなどの細胞増殖マーカーで同定される。

神経幹細胞のマーカー　←→神経幹細胞/神経上皮細胞マーカー/放射状グリアマーカー 成体海馬歯状回の顆粒細胞下帯：SGZや前脳上衣下層SEZの神経幹細胞の際だった特徴は、アストロサイトや放射状グリアのマーカーであるGFAP、FABP7/BLBPなどを発現することである。 一般の幹細胞マーカー分子も発現する。 GFAPは、アストロサイトに存在する中間径フィラメントである。したがって、SGZやSVZには、GFAP陽性神経幹細胞とGFAP陽性アストロサイトが混在している。一般には、GFAP陽性神経幹細胞（primary progenitor）が次の神経前駆細胞になるとGFAPの発現を失うとされているが、増殖性のGFAP陽性細胞には、ニューロンマーカーのHuやproneural proteinのMash1を同時に発現している中間型の細胞がある。したがって、HuやMash1を使うと、GFAP陽性神経前駆細胞とアストロサイトを区別することができる。 FABP7/BLBPは、脳に存在する脂肪酸結合タンパク質であり、放射状グリア細胞のマーカーとして知られている。海馬歯状回の顆粒細胞では、SGZの放射状及び神経幹細胞の細胞膜が染色される。 nestin は中間径フィラメントで、神経系に限らず、幹細胞一般に発現する分子である。成体海馬では、SGZの放射状細胞に発現するだけでなく、血管の周囲細胞にも発現する。脳が損傷を受けた場合にも、アストロサイトにnestinが発現する。 Pax6は転写因子であり、胎生期の大脳皮質では、神経幹細胞である放射状グリア細胞に発現している。成体海馬では神経幹細胞/前駆細胞とアストロサイトの細胞核に発現している。 Sox2は胎生幹細胞や神経上皮細胞に発現している。成体海馬では神経幹細胞/前駆細胞とアストロサイトの細胞核に発現している。 Sox2陽性神経幹細胞には自己複製能と多分化能があることが証明されている。 Pax6とSox2は、GFAP陽性神経幹細胞に発現しているが、ニューロンマーカー陽性の神経前駆細胞にも低いレベルで発現している。 Musashi CD133

神経幹細胞からニューロンへの分化　←→未分化性の維持/分化制御因子 ＝プロニューラル因子、プロニューラル遺伝子 ニューロン系譜へと運命を決定される因子　←→細胞系譜 神経細胞の分化を開始させるスイッチとして働く。 上皮の一部の細胞で発現することによって、その細胞に神経前駆細胞として分化する最初のきっかけを与えている。 bHLH型転写因子のMash1（＝Ascl1）、NeuroD、Ngn1、Ngn2、Math1など プロニューラル因子が発現する細胞は神経細胞に分化し、隣接する細胞を幹細胞として維持させるための経路をオンにする。 プロニューラル因子はDelta遺伝子をオンにして、細胞の表面に発現させる。Deltaは、隣接する細胞の表面に出ているNotchと結合し、細胞内へとシグナルを伝える。 このシグナルによって発現が促されたHes1/5は、プロニューラル因子であるMash1やNgn2の発現を抑制する。プロニューラル因子が発現しないため、この細胞は神経細胞には分化しない。 Hes6はHes1の機能を抑制し、Mash1がHes1に打ち勝ってニューロンに分化させるのを助ける。

神経前駆細胞のマーカー 発生運命がニューロンに決定された後に神経前駆細胞に発現するマーカー FABP7/BLBP 神経細胞接着分子PSA-NCAM 後期神経前駆細胞からは、微小管関連タンパクであるDoublecortin：DCX、RNA結合タンパクであるHu、Activator-typeのbHLH型転写因子であるNeuroD

未成熟ニューロンのマーカー　←→PSA-NCAM、SEZのType A/SGZ-3型/　　参考　1 発生運命がニューロンに決定された後に神経前駆細胞に発現するマーカー 神経細胞接着分子PSA-NCAM、微小管関連タンパクであるDoublecortin：DCX/βIIItubulin（＝TuJ-1）、RNA結合タンパクであるHu、Activator-typeのbHLH型転写因子であるNeuroD、Tbr2、Ca結合タンパクであるCarletinin Doublecortin、Beta III tubulin、NeuroD1、TBR1、Stathmin 1

成熟ニューロン NeuNは、PSA-NCAMやDoublecortin：DCXと比較すると、発達中のニューロンの後期に発現する。しかし、PSA-NCAMを発現している細胞の一部では、すでにNeuNを発現しているものもあるので、NeuNを発現しているからといって、成熟ニューロンとは限らない。 微小管結合タンパク質MAP2は経前駆細胞から分化すると発現し始め、成熟したニューロンでは軸索にはほとんど存在せず、樹状突起と細胞体にほぼ特異的に局在する。 小脳のプルキンエ細胞や嗅球の僧帽細胞の様に、成熟ニューロンでもNeuNを発現しない細胞もあるので注意が必要である。 calbindinは成熟した顆粒細胞のマーカーであると考えられている。成体海馬において、calbindinは、すべての顆粒細胞の細胞体と樹状突起、軸索に強く発現しているように見える。 しかし、calbindinを強く発現する細胞は、少数だが海馬全体に散在している。また、顆粒細胞層においても、明らかに顆粒細胞とは形態が異なる細胞にcalbindinが発現しているので注意を要する。

神経幹細胞からグリアへの分化　←→分化制御因子 bHLH因子Hes1やHes5は発生の初期には神経幹細胞の維持に作用するが、発生の後期にはグリアへの分化を促進する。 Hesとよく似た構造をもつbHLH因子Hesr2もグリアへの分化を促進する。 Mash1とMath3はグリアの分化を抑制する。

○分化制御因子　←→　ニューロン新生の分子マーカー　参考1

ニューロン分化	細胞外促進因子	Wnt
	細胞外抑制因子	Notch, BMP2, BMP4
	転写因子	Mash1, Ngn, Math1, NeuroD, Hes1, Hes5, Id1, Id3
アストロサイト分化	細胞外促進因子	BMP2, BMP4, レチノイン酸, LIF
	転写促進因子	Smads, STAT3, p300/CBP, Hes5, ID4
	転写抑制因子	Ngn
オリゴデンドロサイト分化	細胞外促進因子	Shh
	細胞外抑制因子	Notch, BMP2, BMP4
	転写促進因子	Olig1, Olig2, YY1, HDAC
	転写抑制因子	Hes5, ID2, ID4, Tef4

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☆興奮性ニューロンの発生　←→抑制性/神経細胞の遊走

■発生過程における中枢神経系での細胞増殖　←→成体脳/皮質板形成/発生/胚期　参考1/2/3/4/5/6

マウス　←胚期

胎生7.5〜8.5日：神経幹細胞：誘導

胎生11日：ニューロン産生

胎生17日：オリゴデンドロサイト産生

胎生後期から生後：アストロサイト産生





マウスの胚体外胚葉 epiblast：E6.25 epiblast のステージで原始外胚葉が形成され、後に神経上皮細胞になる。 白血病阻止因子 ：LIF反応性の未分化神経幹細胞が存在するが、FGF2に反応して増殖する神経幹細胞は検出されない。

expansion phase：神経幹細胞の自己増殖期：自己複製能　E8.5〜、胎生初期 extended reproductive period　拡大再生産期　←→胎生期の皮質板形成 　 胎生初期の神経管の閉鎖直後、神経幹細胞は神経上皮という一列の層状に並んだ形態をとっていて、神経上皮細胞と呼ばれる。 神経上皮細胞は側脳室の拡大に伴って脳室表面において対称分裂を繰り返し、神経幹細胞の数を増やしている。 神経上皮細胞はニューロンやグリア細胞に分化することなく、対称分裂により自己複製を繰り返す。 神経上皮細胞は線維芽細胞増殖因子：FGF2に反応して神経幹細胞へ分化し、増殖する細胞として検出される。 胎生8.5日のマウス神経組織では、Notchシグナル経路を構成する全ての遺伝子と、標的遺伝子であるHes1, Hes5が発現している。

neurogenic phase：ニューロン分化期〜　E11? 胎生中期? 大脳皮質の発生過程では、神経細胞は誕生した部位からダイナミックな細胞移動を経て最終配置部位に到達し、新皮質においては6層構造が形成される。大脳皮質を構成する神経細胞は興奮性神経細胞と抑制性神経細胞に大別され、興奮性神経細胞は主に終脳背側部の外套（広義の大脳皮質）の脳室面にある脳室帯及び脳室下帯から産生され、後者は主に抑制性神経細胞の基底核原基と呼ばれる部位の脳室面から産生される。 背側終脳 dorsal telencephalon ：dTel　←→終脳/Emx 発生期の背側終脳の脳室面にある脳室帯及び脳室下帯に興奮性の神経前駆細胞が分布する。 転写因子Pax6は背側終脳の興奮性ニューロンの脳室帯の前駆細胞に発現するが、抑制性のGABA作動性介在ニューロンを生成する前駆細胞には発現しない。 外套 pallium　＝大脳皮質原基　←→基底核原基/海馬原基/大脳皮質の発生 広義の大脳皮質 神経解剖学において、外套は脊椎動物の大脳の上部表面を覆う灰白質の層を指す。 側脳室の背側を覆う 外套は内側外套（海馬に相当）、背側外套（新皮質に相当）、外側外套（嗅皮質に相当）、および腹側外套（扁桃体の外套領域）に分けられる。 胎生期に神経細胞を産生する脳室帯や脳室下帯は外套の脳室に面した部分である。 胎生期に観察される大脳基底核原基は外套の腹側に位置する。 外套下部 subpallium 側脳室の腹側 外套下部には中隔核、線条体、および扁桃体の外套下部領域などが含まれる。 大脳皮質の発生の初期には、脳室に面した脳室帯に存在する神経上皮細胞が対称分裂によって自己複製能する。やがて神経上皮細胞は、対称性分裂による自己増殖と非対称性分裂による神経細胞産生の両方を行うようになる。 神経上皮細胞は放射状に伸びた細長い形態をとっていて、その末端はそれぞれ脳室面と基底面に結合しているが、細胞増殖に伴い脳の層が厚くなると基底面側が突起となって放射状に引き伸ばされていく。 皮質板が形成される頃に、神経上皮の肥厚に伴って神経上皮細胞は放射状に伸長した形態を示し、放射状グリアと呼ばれるようになる。 放射状グリア細胞は非対称分裂により、神経幹細胞とニューロン（神経細胞あるいは神経前駆細胞）を一つずつ生み出すようになる。 放射状グリア細胞は脳室面側にとどまり脳室帯：VZを形成しているが、細胞周期に連動したエレベーター運動運動を繰り返しながら分裂を行う。 産生された神経細胞は放射状グリア細胞の突起にガイドされ、基底面側に移動していくことで辺縁帯: MZを形成する。 放射状グリア細胞から産生された一部の神経細胞前駆細胞も、移動中、脳室下帯: SVZにおいて対称分裂により増殖し、前駆細胞の集団を形成することが確認されている。 その後、神経細胞は脳室下帯で放射状グリア線維から一旦離れ、多極性の形態に変化する。この多極性細胞は、しばらく方向性の定まらない運動を続けるが、やがて双極性細胞に変化して放射状グリア線維に接着し、軸索を伸ばしながら皮質板に向かって移動していく。　→migration 皮質板に到達した神経細胞は、既に定着している神経細胞を乗り越えてさらに移動を続け、皮質表層近傍で停止する。 初期に誕生した神経細胞は皮質板の深い場所に位置し、後から誕生した細胞ほど、表層近くに位置することになる。　→inside-out 以上のような移動様式により、大脳皮質の６層構造が形成される。 胎生中期には、アストロサイトへの分化は抑制されている。 胎生中期の神経幹細胞はglial fibrillary acidic protein (GFAPなどのアストロサイト特異的遺伝子のプロモーター領域が高頻度にメチル化されているので、LIFにより刺激してもSTAT3が認識配列に結合できないためアストロサイトへは分化せずにニューロンへのみ分化する。

gliogenic phase：グリア形成期、E17? 胎生後期? ニューロン分化期が終わるとオリゴデンドロサイトを産み出す時期に続いて、生後アストロサイトを産産み出す時期が到来する。




神経上皮細胞 neuroepithelial cell （マトリックス細胞）　←→成体脳における上衣細胞/上皮細胞 胎生期の神経管を構成する多列上皮である脳室帯を構成する神経幹細胞であり、皮質板の形成に寄与する。 外胚葉由来で、胎生初期には脳室帯に局在する。 未分化な細胞で、ニューロンやグリア細胞などの中枢神経系、脊髄、網膜などは神経上皮細胞に由来する。 ゼブラフィッシュからヒトに到るまでの脊椎動物種全般において神経細胞を産生する。 アピカル―基底膜軸に沿って二本の突起を伸ばす。 胎生初期↑には神経上皮細胞は対称分裂により2個の神経上皮細胞を生み出し、やがて対称分裂と非対称分裂の両方を行うようになる。 Basal（Intermediate）ProgenitorとoRG細胞の起源となる細胞であり、脳形成の過程でその数を十分に増やすための増殖的分裂を行う。 お互いに密着結合する性質があり、頂底軸極性（apical-basal polarity）を持ち、細胞周期の進行に伴う核移動を示す。 神経上皮細胞は脳室側の頂端部にアドヘレンスジャンクションを有する。 神経上皮細胞は脳室面で細胞分裂：M期を行い、その過程で神経上皮細胞の核はエレベーター運動を行い、細胞周期に応じて脳室面から脳膜面の間を上下に移動する。 細胞増殖に伴い脳の層が厚くなると基底面側が突起となって放射状に引き伸ばされていく。 皮質板が形成される時期には、放射状グリア↓と呼ばれるようになる。 神経上皮細胞マーカー　←→神経幹細胞のマーカー 転写因子：Sox2、 Pax6 脳に存在する脂肪酸結合タンパク質　FABP7/BLBP 中間径フィラメントタンパク質であるネスチン 放射状グリアのマーカーであるradial glial cell marker-2（RC2） RNA結合タンパク質Sox2、 Musashi1などは発生初期の神経上皮細胞から発現している。 これらのうち Pax6は神経上皮細胞の未分化性の維持に重要であり、FABP7/BLBPの発現を制御する。

放射状グリア細胞　radial glia　←→放射状移動 放射状グリア細胞は神経上皮細胞↑の非対称分裂から生み出される細胞で、神経前駆細胞およびグリア前駆細胞のどちらにも分化できる、神経幹細胞としての機能を有していると考えられ、神経上皮細胞と同様、頂底軸極性（apical-basal polarity）を持ち、核移動（IMM）を示す。 皮質板が形成される頃になると、神経上皮の肥厚に伴って神経上皮細胞↑は放射状に伸長した形態を示し、放射状グリアと呼ばれるようになる。 放射状グリア細胞は神経上皮細胞であり、神経幹細胞である。 高い円柱性の細胞で、下方に向かう突起は脳室壁に、上方に向かう突起は軟膜に達する。 従って放射状グリアの突起は神経上皮細胞の軸索よりも長いので、エレベーター運動も著しい。 Pasko Rakicが1972年にサルの胎児の新皮質のマイグレーションのペーパーの中で始めた「radial glia」という用語を使った。 ニューロン生成期↑ 対称分裂による神経上皮細胞の拡大再産期が終わると、神経上皮細胞は脳室側で非対称分裂を行う。 放射状グリアの非対称分裂により、娘細胞の一方は神経幹細胞として脳室帯に留まり、もう一方の細胞は分裂を停止して神経細胞に分化するか、神経細胞に運命決定された2次的な増殖細胞（Intermediate progenitor：IPC（Basal progenitor））となって脳室下帯へと移動する。 こうしてできたニューロンは、分裂サイクルからはずれて脳室側より軟膜側に移動を開始し、適当なところで移動 migration をやめてニューロンに分化する。 グリア形成期 gliogenic phase ↑ 放射状グリア細胞は非対称分裂により、放射状グリア細胞とグリア芽細胞（神経膠芽細胞）を作る。 最終的に神経上皮細胞は分裂能を失い、脳室を覆う１層の上衣細胞になる。 成体期になると、側脳室外側壁の放射状グリアは上衣細胞とアストロサイトに分化する。 放射状線維　radial fiber 脳室帯から脳表面へと伸びる放射状グリアの長い突起 細胞体トランスロケーションと多極性移動は放射状線維を使わない。 放射線状移動：放射状線維が足場となって神経細胞をガイドとし、法線方向へ移動する。 ＝ロコモーション：脳室帯から脳表面へと伸びる時、放射状線維を足場として移動する。 放射状グリア細胞はお互いに密着結合する性質があり、また脳軟膜直下のエンドフィートにグリコーゲンを貯蔵する顆粒を持つ。 放射状グリア細胞の主なマーカー・タンパク質とそれらに対する抗体をご紹介します。放射状グリア細胞はアストロサイトの一種なので、各種アストロサイト・マーカー・タンパク質も発現している。 放射状グリアマーカー　←→神経幹細胞のマーカー/アストロサイトのマーカー radial glial cell marker-2：RC2 中間径フィラメントタンパク質：ビメンチン アストロサイトのマーカー:GFAP、BLBP カルシウム結合タンパク質：S100β アストロサイト特異的なグルタミン酸トランスポーター：GLAST グルタミン合成酵素：GS 細胞外マトリックス糖タンパク質：テネイシンC：TN-C Pax6 Hes1、Hes5


　　　　　↓

→神経芽細胞 neuroblast↑＠神経前駆細胞 　→カハール・レチウス細胞、サブプレートニューロン 胎生期に発生する幼若なニューロン 将来神経細胞に分化すべき胎生期細胞 神経幹細胞は非対称分裂を行い、2個の異なる娘細胞（神経幹細胞と神経芽細胞）になる。 神経芽細胞には分裂能はなく、2度と分裂サイクルに入らない。 成体脳では 　→海馬歯状回DGのSGZの3型細胞 　→上衣下層:SEZのA型細胞





エレベーター運動 elevator movement　←→皮質板形成/発生過程/Fucci 　interkinetic nuclear migration：INM、interkinetic nuclear movement：IKNM　参考1 胎生期脳の神経幹細胞／神経前駆細胞が示す細胞周期依存的な細胞核運動 神経上皮細胞や放射状グリア細胞が細胞周期に同調して細胞核が神経管壁を上下に移動する運動 1897年にSchaperが考案し、1935年Sauerによりその概念を提唱し、1959年にトリチウム化チミジンを用いた「パルス・チェイス法」によって証明された。1995年にChenn & McConnellによってフェレットのスライス培養下に神経前駆細胞の INM が初めてライブでとらえられた（Cell 82, 631-641）。 1960年代にニワトリ胚の神経管から、エレベーター運動を行うマトリックス細胞（神経上皮細胞）が発見され、このマトリックス細胞からグリア芽細胞と上衣細胞が産み出されることが明らかにされた。脊索動物が持つ神経管は、外胚葉から形成され、脳室近傍に存在する神経幹細胞から神経前駆細胞とグリア芽細胞が産み出される。 apicalとは頂点という意味であるが、エレベーター運動でシェーマで描かれているapical面は下で、basal面は上である。 細胞周期の進行に従い、細胞核は脳室帯内で「アピカル（apical）−基底膜（basal）軸」に沿った上下運動を行う。 神経幹細胞の対称分裂は脳室帯アピカル表層で起こる。 アピカル表層（脳室の近傍）で細胞分裂（M期）が起こり、その後のG1期で基底膜側方向（脳表面方向）に細胞核が移行する。 DNA合成期であるS期に核は脳室帯の基底膜側に局在し、その後のG2期間に細胞核は再び基底膜側からアピカル側に戻る。 エレベーター運動はすべての上皮細胞にみられるが、神経上皮が肥厚している時期の放射状グリアでは著しい。 G1 S G2 M G1 basal 　 ○ 　 　 　 脳室帯 　 　 ○ 　 　 ○ 　 　 　 　 　 　 　 　 ○○ apical 　 　 　 ○○ 　 細胞周期 　G1期：合成準備期 　S期：DNA合成期 　G2期：分裂準備 　M期：分裂期 このような運動は、Notchシグナルなどの増殖シグナルを核に伝達しやすくするために起こっていると考えられている。　参考 target=new>1

☆大脳皮質抑制性ニューロンの発生　←→興奮性ニューロンの発生/神経細胞の移動/GABA

• GABA作動性の介在神経細胞は新皮質になる領域（pallium）の外側にあるsubpallium、特にmedial ganglionic eminence （MGE）で産生され、接線方向に移動して（tangential migration、水平移動）、新皮質領域に到達する。
• ヒトではGABA作動性神経細胞の一部は脳室帯由来とされている。
• 水平移動は主として辺縁帯、中間帯、脳室下帯で起こり、その後、斜行、あるいは法線方向に移動して皮質板に進入する。マウスにおいて、新皮質領域まで到達したGAD65陽性細胞のうち皮質板に存在するものの割合は　E14.5では数％であるが、E18.5には40%程度まで増える。
• GABA作動性介在神経細胞のサブタイプであるシャンデリア細胞が側脳室のventral germinal zoneに存在するNkx2.1陽性細胞から由来することが明らかになった。
• 介在神経細胞の皮質板内の層分布はその産生された領域と時期に依存する。また、介在神経細胞のradial migrationはReelinのシグナルには依存しないことが分かっている。
• 第V層の神経細胞の分化と軸索投射のマスター遺伝子の一つと考えられている。
• Fezf2のノックアウトマウスでは、脳室帯由来の神経細胞の層構造は正常であるが、ソマトスタチン陽性およびパルブアルブミン陽性の介在神経細胞が第V層で特異的に減少していた。このことから、すでに形成された興奮性神経細胞の層構造に依存して介在神経細胞の層分布が決定される可能性が指摘されている。
  
  

  基底核原基 ganglionic eminence：GE　←→大脳基底核/大脳皮質原基（=外套） 　参考1/2 基底核原基は大脳皮質抑制性ニューロンを産生するが、抑制性ニューロンだけを産生するわけではない。 終脳のうち外套 palliumの腹側に位置する。 胎生期に観察され、構造的に脳室内に隆起しているため、基底核隆起とも言われる。 大脳皮質のGABA作動性抑制性神経細胞、オリゴデンドロサイトを産生する領域である。 誕生した抑制性神経細胞は大脳皮質、線条体、淡蒼球、扁桃体、嗅球などの様々な領域に移動することが知られている。 大脳基底核原基は解剖学、および遺伝子発現様式に基づき、内側基底核原基、外側基底核原基、尾側基底核原基の三領域に主に区分される。 抑制性介在ニューロンの大半は内側基底核原基に由来するが、約3割の細胞は尾側基底核原基に由来する。また，約1割の介在ニューロンは尾腹側に位置する視索前野に由来する。 内側基底核原基 medial ganglionic eminence：MGE 大脳新皮質抑制性神経細胞の約半分程度が内側基底核原基に由来する。 内側基底核原基由来の細胞は尾側基底核原基由来の細胞に比べて、早生まれである。 この領域の神経幹細胞では転写因子Nkx2.1の発現が見られる。最終分裂を終えた内側基底核原基由来の大脳皮質抑制性神経細胞のほとんどでは、Nkx2.1の下流分子Lhx6が発現してNkx2.1自体の発現は消失する。 大脳皮質に向かう内側基底核原基由来細胞は接線方向移動と呼ばれる移動様式を取って脳表面に平行に移動して皮質内に進入し、主にパルブアルブミン陽性またはソマトスタチン陽性の抑制性神経細胞となる。 内側基底核原基に由来する抑制性神経細胞が外套に入る際には脳室下帯／中間帯を通るものと、辺縁帯を通るものに分かれ、脳室下帯／中間帯を通過したグループはその後、脳表面側へと向かい、その一部は辺縁帯にまで達して接線方向にランダムウォークした後、再び皮質板内へと潜り込む。 内側基底核原基由来の介在ニューロンは，マウスでは胎生12.5日ごろに大脳皮質の外側部から侵入する。その後、皮質では中間帯から脳室下帯にかけて皮質深部と辺縁帯に標識細胞が観察されるようになる。 前脳のオリゴデンドロサイト前駆細胞は胎生12日前後に内側基底核原基の脳室層から産生される。脊髄と同様に発生制御にはOlig2、sonic hedgehog：Shh、BMPsなどの因子が関わっている。MGEで産生されたオリゴデンドロサイト前駆細胞は腹側領域全体へと移動し、さらに大脳皮質側へと移動する。　←→→オリゴデンドロサイトの発生 腹側内側基底核原基では線条体および淡蒼球に移動する抑制性神経細胞も確認されている。 線条体へ向かう細胞群ではNkx2.1の発現が継続し、Nkx2.1により受容体分子ニューロピリン（Neuropilin 2（Nrp2））の発現が抑制されている。線条体ではNrp2の反発性リガンドであるSema3Fが発現していて、Neuropilin2/Sema3Fが抑制性神経細胞の配置を制御していることが知られている。 内側基底核原基は抑制性神経細胞が誕生して目的地に向かって移動していくに従い縮小していき、最終的に消失する。 外側基底核原基 lateral ganglionic eminence：LGE 主に線条体や嗅球に移動する抑制性神経細胞が誕生する部位として知られている。 背側外側基底核原基 dorsal LGE Er81遺伝子が発現している。 嗅球の抑制性神経細胞を産生する。 Er81を発現する部位が生後においては上衣下層となり、吻側移動経路：RMSへ抑制性神経細胞を供給する。 腹側外側基底核原基 ventral LGE Isl1遺伝子が発現している。 線条体の抑制性神経細胞を産生する。 線条体の発生では、最初に線条体のストリオソームを構成する抑制性神経細胞が誕生し、その後マトリックスを構成する抑制性神経細胞が誕生することが知られている。 尾側基底核原基 caudal ganglionic eminence：CGE 主に大脳皮質および扁桃体に移動する抑制性神経細胞を産生することが知られている。 マーカーとして、尾側基底核原基領域ではCOUP-TFIIが優位に発現している。神経細胞の誕生時期の解析等により、発生の初期においては主に扁桃体に移動する抑制性神経細胞が、後期では主に大脳皮質に移動する抑制性神経細胞が尾側基底核原基にて誕生することが示唆されているが、今後直接の検討が必要である。 尾側基底核原基から誕生する扁桃体核は誕生時期により異なる。初期に中心核が誕生し、その後、外側核、基底内側核、基底外側核、外側嗅索核 Nucleus of lateral olfactory tractが誕生する。 尾側基底核原基から産生される大脳皮質抑制性神経細胞は全体の30％程度を占めている。 大脳皮質に移動する過程においては、全体に散らばるように移動する内側基底核原基由来細胞とは異なり、尾側基底核原基細胞は尾側に方向性を持つ移動様式である尾側細胞移動経路：CMSを取ることが報告されている。 この移動経路は尾側基底核原基に発現するCOUP-TFIIによって制御されている。また、尾側基底核原基由来の抑制性神経細胞は5HT3A受容体を発現していることが示されている。 大脳皮質の抑制性神経細胞の約３割は5HT3A受容体であり、そのほとんどは尾側基底核原基に由来する。これらの細胞はReelin陽性細胞やCarletinin陽性細胞、外套へ向かう細胞は大脳の後方へ回り込むシャープな細胞の流れを作り、これを尾側移動経路：CMSと呼ぶ。 外側基底核原基は扁桃体の神経細胞を供給する。大脳皮質の抑制性神経細胞は他に、視索前野にも由来する。 尾側基底核原基に由来する神経細胞は主に線条体、および嗅球へ向かう神経細胞となり、大脳皮質への細胞供給はあっても少数であると考えられている。

☆神経細胞の移動・遊走 neuronal migration　←→神経の発生（興奮性・抑制性）　参考1/2

• 多くの神経細胞は生まれた場所にとどまることなく、遠く離れた部位まで移動する。
• これは多くの部位において、神経細胞が産生される部位と、配置されて実際に機能する部位とが異なることに起因する。
• 様々領域から細胞が移動してくることによって、多様な神経細胞からなる細胞構築の形成につながる。
  
  
• 移動中の細胞は樹状突起や軸索突起は持たないが、比較的太い先導突起を移動方向に伸ばし、後方には短いトレーリングプロセスを伸ばしながら移動する。
• 突起の先端には軸索の成長円錐に似た小さな膨らみがある。先導突起は状況によって枝分かれをする。
• 成体脳では神経線維やグリア細胞は突起が発達していて、成熟した組織の内部を移動するには、発達期とは異なった分子機構による制御が必要である。
• 移動速度は細胞の種類、発達の時期、環境によって異なるが、マウスの大脳皮質のGABA作動性介在ニューロンの場合10〜30 µm/h1, 2）である。つまり、1日あたり250〜700 µmというように、極めて長い距離を移動する。
  
  
• 近年ライブイメージングにより、3種類の移動様式が知られるようになった：ロコモーションだけでなく、多極性移動や細胞体トランスロケーションもある。

  多極性移動　multipolar migration 産生されて間もなくの神経細胞にみられるゆっくりとした移動様式 多極性移動する細胞は多数の突起を色々な方向に伸ばしていて、多極性細胞と呼ばれる。 脳室帯、あるいは脳室下帯から産生された神経細胞の多くは発生の時期に関わらず多極性細胞の形態をとり、多極性移動を示す。これらの細胞は、基本的にはその後、ロコモーションの移動様式に変化して皮質板内へと進入する。 多極性移動では、その突起を活発に伸縮させながら、細胞体は様々な方向に漂い、全体としてはゆっくりと脳表面側へと向かう。 細胞体トランスロケーションと多極性移動は放射状線維を使わない。

  細胞体トランスロケーション　somal translocation 移動方向側に長く伸びた突起が、その先端を固定しながら短縮し、細胞体が引き上げられる。 細胞体トランスロケーションと多極性移動は放射状線維を使わない。 皮質形成初期〜中期（マウスの胎生12〜14日目）に誕生した一部の皮質神経細胞は多極性細胞を経ずに細胞体トランスロケーションにより脳室帯から辺縁帯直下に至る。

  ロコモーション 放射状移動などでみられる素早い移動様式 脳室帯から脳表面へと伸びる放射状グリア細胞の長い突起である放射状線維を足場として移動する。 ロコモーション細胞は進行方向側に比較的太い先導突起（leading process）、反対側には細いトレーリングプロセス（trailing process）を持つ特徴的な双極性の形態をとる。 ロコモーションでは、細胞体が動いている時期と静止している時期が周期的に繰り返される跳躍的な移動が観察される 個々の神経細胞の遊走過程は、３つのプロセスの繰り返す。 1) 先導突起伸展　leading process extension 先導突起　leading process：LP 先導突起とは神経上皮細胞などの持つ、比較的太い運動性の高い突起 トレーリングプロセス　trailing process：：TP 先導突起の反対側にある細い突起 移動方向に先導突起を伸ばし、後方には短いトレーリングプロセスを伸ばしながら移動する。 上衣下層のA型細胞も進行方向に先導突起を伸ばし、RMSを通って、嗅球に向かう。 興奮性神経細胞は移動時の先導突起が樹状突起に、トレーリングプロセスが軸索になると考えられていたが、興奮性神経細胞の多くは中間帯まで移動すると減速し、先導突起とトレーリングプロセスを失い、培養海馬神経細胞と同様に、複数の短い神経突起の伸長と退縮を繰り返す。参考* 2)ターミナルトランスロケーション　 terminal translocation 皮質形成の初期においても後期においても、皮質神経細胞の移動終了地点においては、細胞体トランスロケーションの一形態であるターミナルトランスロケーションが観察される。 辺縁帯直下には皮質板の中でもさらに細胞密度が高い部位があり、これをprimitive cortical zone (PCZ)と呼ぶ。 ターミナルトランスロケーションはこのPCZを乗り越えるために必要であり、ロコモーションからの転換にはReelin分子が必要であることが示されている 3) 後方突起収縮　trailing process トレーリングプロセスの’収縮

  
  

  ●胎生期の大脳皮質形成における神経の遊走 大脳皮質を構成する神経細胞は興奮性と抑制性に大別されるが、興奮性神経は脳室帯及び脳室下帯で生まれて法線方向へ移動し、抑制性神経は大脳皮質とは異なる部位で生まれ、長距離を移動して大脳皮質に到達する。 ○興奮性神経細胞の移動様式 　脳室帯及び脳室下帯→放射状移動（法線方向移動） ○抑制性神経の移動様式　　　　　 　内側基底核原基：MGE→接線方向移動 　尾側基底核原基：CGE→尾側移動経路：CMS 　外側基底核原基：LGE→吻側遊走経路：RMS

  ○成体脳における抑制性神経の移動 　上衣下層→吻側遊走経路：RMS→嗅球

  
  
  

  放射状移動（法線方向移動）radial migration 神経管の中心と脳表面を結ぶ軸、すなわち法線方向への移動であり、これは神経管全体において起こる。 胎生期の脳室帯及び脳室下帯の興奮性神経細胞の移動 大脳皮質の神経細胞は70〜80%が興奮性神経細胞であり、胎生期に外套の脳室に面した部分である脳室帯、あるいはそれに隣接した脳室下帯（最下層）において産生され、脳表面側（最上層）へと移動する。 神経幹細胞の非対称分裂によって生じた神経前駆細胞は放射状グリア細胞の突起（放射状線維）にそって脳表面に向かって放射状に移動し、皮質板を形成する。 脳室周囲から放射状グリアにガイドされ、脳表面方向に移動し、大脳皮質層構造を形成する。 inside-out様式 胎生期の大脳皮質形成の初期に誕生した神経細胞は皮質板の深い場所に位置し、後から誕生した細胞ほど、表層に定着するような組織構築過程 初期に産まれた皮質神経細胞の集団は、最初期に生まれてすでに脳表面側に形成されているプレプレートに割って入り、これを脳表面側の辺縁帯と、脳室側のサブプレートとに分け、その間にサンドイッチされるように配置される。この辺縁帯とサブプレートに挟まれた部分は皮質板と呼ばれ、その後に産まれた皮質板神経細胞も順次脳表面へと移動するが、その際にすでに移動を終了している神経細胞を乗り越えて辺縁帯直下に達し、その移動を終える。このため、大脳皮質では早生まれのものほど脳の深層側に、遅生まれのものほど表層側に配置される（辺縁帯の細胞は例外であり、皮質板神経細胞より早生まれであるが常に再表層に局在する）。 マウスE13.5に子宮内電気穿孔法を用いて、神経幹細胞のBre1aの発現を抑制すると、神経幹細胞の分化と、inside-outパターンが障害される。

  接線方向移動　tangential migration、水平移動 胎生期の大脳における抑制性神経細胞の接線方向移動 内側基底核原基：MGEから発生した介在ニューロンは法線方向に移動するが、その後接線方向に向きを変え、大脳皮質に向かって移動する。 内側基底核原基の細胞は接線方向に移動して、線条体および淡蒼球に移動する。 放射線状移動に比べて脳表面と平行により長い距離をより速い速度で移動する。 放射線状移動に関しては放射状線維　radial fiberが足場となって神経細胞をガイドするが、接線方向の移動ではそのような明確な足場は存在しない。 CXCL12のような誘引性の分子の局在が移動経路の決定に、またSemaphorin、Slitのような軸索反発因子として知られている分子や、Netrin-1のような軸索誘引因子が移動経路や移動方向の決定に関与している。

  尾側移動経路 caudal migratory stream ：CMS 胎生期は尾側基底核原基：CGEの細胞が、尾側細胞移動経路を経由して、 主に大脳皮質および扁桃体に移動する抑制性神経細胞を産生する 尾側基底核原基（他の部位に由来して尾側基底核原基を通過中の細胞も含まれている可能性がある）から外套へ向かう細胞は大脳の後方へ回り込むシャープな細胞の流れを作り、これを尾側移動経路：CMSと呼ぶ。

  吻側遊走経路、吻側細胞移動経路 rostral migratory stream：RMS 胎生期 胎生期では、外側基底核原基：LGEの細胞が、吻側遊走経路：RMSを経由して、線条体や嗅球に移動し、抑制性ニューロンになる。 背側外側基底核原基ではEr81遺伝子が発現していて、嗅球の抑制性神経細胞を産生する。 腹側外側基底核原基ではIsl1遺伝子が発現していて、線条体の抑制性神経細胞を産生する。 線条体の発生では、最初に線条体のストリオソームを構成する抑制性神経細胞が誕生し、その後マトリックスを構成する抑制性神経細胞が誕生することが知られている。 成体脳　参考1 Er81を発現する部位が生後においては上衣下層となり、吻側移動経路：RMSへ抑制性神経ニューロンを供給する。 マウス成体の脳で総長約5mm 上衣下層のA型細胞（neuroblast ）が毎時70〜80μmの速さで嗅球の糸球体層や顆粒細胞層に遊走する。 嗅球へ到達した新生ニューロンの約95%が顆粒細胞へ、ごく少数が糸球体周辺細胞へ分化する。 進行方向に先導突起と呼ばれる短い突起を伸ばし、脳内を吻側へと長距離にわたって移動するが、その間も増殖を続けている。 成体脳の内部の吻側移動経路における新生ニューロンの移動には、胎生期のニューロンの移動とは2つ異なる特徴がある。 グリアチューブ glial tubes 吻側移動経路：RMSに、脳の発達の末期から現われるアストロサイトの突起が縦に繋がってトンネル構造ができて、このトンネルは「グリアチューブ」と呼ばれる。 グリアチューブがあることによって遊走する細胞はを長軸方向への移動が可能となる。 グリアチューブを形成するアストロサイトの細胞体および突起に、Slitの受容体であるRobo2とRobo3が強く発現している。 鎖状細胞移動 chain migration 遊走する細胞は「鎖状細胞移動 chain migration」と呼ばれる集団移動の様式をとる。 遊走する細胞間に小さな接着結合を断続的に作って、鎖状の細長い細胞塊を形成し、この中で互いを足場としてスライドするように移動している。 新生ニューロンは細長いチェーンのような細胞塊を形成し、グリアチューブを高速度で移動し、嗅球へ至る。 遊走する新生ニューロン自身に軸索反発性因子であるSlitが発現している。 遊走する新生ニューロン自身にSlitが発現しているので、典型的なガイダンス因子としての作用モデルとは明らかに異なる。 遊走する新生ニューロンはSlit1を分泌し、受容体Roboを発現するアストロサイトの形態および分布を制御してグリアチューブを維持することにより、高速移動が可能となっている。

  
  
  →胚盤胞補完法（neural blastocyst complementation；NBC）
  
  

  Pain Relief