What are the molecular targeted drugs for cancers with BRCA1 and BRCA2 gene mutations?

BRCA1およびBRCA2遺伝子変異を持つがんに対する分子標的薬で注目されているのはPARP阻害剤（PARPi）です。現在、FDAに承認されているPARPiは4種類あり、これらはBRCA1/2欠損がんの治療に利用されています（Ragupathi et al., 2023）。

最初に承認されたPARPiであるオラパリブは、BRCA変異を持つ卵巣がん患者の治療において非常に有望な結果を示しています（Venkitaraman, 2009; Tangutoori et al., 2015）。PARPiは、がん細胞のゲノム不安定性を利用してDNA損傷応答を標的とし、従来の化学療法と比較してより腫瘍細胞選択的なアプローチを提供します（O’Connor, 2015）。

PARPiの細胞毒性は、BRCA1/2変異腫瘍の複製が困難なゲノム領域に過剰な複製ストレスを誘導することによると考えられています（Ragupathi et al., 2023）。現在進行中の研究では、PARPiと免疫チェックポイント阻害薬を組み合わせて臨床結果を向上させる方法が探求されています（Ragupathi et al., 2023）。さらに、PARPiは他のさまざまながんタイプに対しても、単独療法および他の治療法との併用療法としての利用が検討されています（Tangutoori et al., 2015）。

このように、PARP阻害剤はBRCA1/2遺伝子変異を持つがん患者にとって新たな希望となる治療法であり、今後の研究と臨床応用が期待されています。

Molecular targeted drugs for cancers with BRCA1 and BRCA2 gene mutations primarily focus on PARP inhibitors (PARPi). Four FDA-approved PARPi are currently available for treating BRCA1/2-deficient cancers (Ragupathi et al., 2023). Olaparib, the first approved PARPi, has shown promise in treating ovarian cancer patients with BRCA mutations (Venkitaraman, 2009; Tangutoori et al., 2015). PARPi exploit the genomic instability of cancer cells by targeting the DNA damage response, offering a more selective approach compared to traditional chemotherapy (O’Connor, 2015). The cytotoxic effect of PARPi is believed to result from inducing excessive replication stress in difficult-to-replicate genomic regions of BRCA1/2 mutated tumors (Ragupathi et al., 2023). Ongoing research explores combining PARPi with immuno-oncology drugs to enhance clinical outcomes (Ragupathi et al., 2023). Additionally, PARPi are being investigated for use in various other cancer types, both as monotherapies and in combination with other treatments (Tangutoori et al., 2015).

References

O’Connor, M. J. (2015). Targeting the DNA Damage Response in Cancer. 60(4), 547–560. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.040

Ragupathi, A., Singh, M., Perez, A. M., & Zhang, D. (2023). Targeting the BRCA1/2 deficient cancer with PARP inhibitors: Clinical outcomes and mechanistic insights. 11, 1133472. https://doi.org/10.3389/fcell.2023.1133472

Tangutoori, S., Baldwin, P., & Sridhar, S. (2015). PARP inhibitors: A new era of targeted therapy. 81(1), 5–9. https://doi.org/10.1016/j.maturitas.2015.01.015

Venkitaraman, A. R. (2009). Targeting the molecular defect in BRCA-deficient tumors for cancer therapy. 16(2), 89–90. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2009.07.011

図の解説：PARP（ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ）は、主に一重鎖DNA切断（single-strand breaks, SSB）の修復に関与しています。具体的には、以下のようなDNAダメージを修復します：

1. 一重鎖切断（SSB）: DNAの片方の鎖が切断される損傷です。PARPはこの損傷を検出し、修復プロセスを開始します。
2. 塩基除去修復（BER）: DNAの塩基が損傷を受けた場合、PARPはこの修復経路に関与し、損傷した塩基を除去し、新しい塩基を挿入するプロセスを助けます。

PARPは、これらの損傷を修復することで、細胞のゲノム安定性を維持し、細胞の生存を助けます。しかし、BRCA1やBRCA2遺伝子に変異がある場合、これらの修復経路が正常に機能しないため、PARP阻害剤（PARPi）はこれらのがん細胞に対して特に効果的です。PARPiはPARPの機能を阻害することで、がん細胞に蓄積するDNA損傷を増加させ、最終的にがん細胞の死を誘導します。

PARP分子と、Olaparibの結合を結晶構造で眺めてみました。この構造だと、PARPたんぱく質に結合したOlaparibは分子の中に深く埋もれているように見えます。（結合した後にたんぱく質の構造変化が起きる？）緑色の分子がolaparibで、それ以外が human PARPのcatalytic domain。下図は下記文献のデータを基にわたくしが作図しました。

Ogden, T. E. H., Yang, J.-C., Schimpl, M., Easton, L. E., Underwood, E., Rawlins, P. B., McCauley, M. M., Langelier, M.-F., Pascal, J. M., Embrey, K. J., & Neuhaus, D. (2021). Dynamics of the HD regulatory subdomain of PARP-1; substrate access and allostery in PARP activation and inhibition. 49(4), 2266–2288.
https://doi.org/10.1093/nar/gkab020

ゲノムワイド関連解析(GWAS)のマンハッタンプロット

アイキャッチ画像のような図を論文で見ていて、どうやって描いたもので何を意味するのか自分でもとデータから図を描きつつ見方を学ぼうという事で書籍を開きながら試してみました。その時のチョコっとした学びを書き留めた備忘録です。

#初心者によるやってみた系の記事

参考にした書籍

参考にしたのは「ゼロから実践する 遺伝統計学セミナー〜疾患とゲノムを結びつける」という本です。参考というか、このホームページに書いていることは、この本に書かれていることをたどっただけです。書籍にはCGYWINのインストール、plinkの使い方から、マンハッタンプロットまで丁寧に書かれていますので、この書籍を読めば私のホームページは見る価値があまりないかもしれません。

Rでのプロット

ここで、今回使用したRのスクリプトを掲載しようと思っていたのですが、そのスクリプトというのが上記書籍を購入したらダウンロードできるというデータの中にあるスクリプトで、ごくわずか変更（ファイル格納ディレクトリやデータファイル名を変更）した程度なので、さすがに掲載したらまずそうだと思いとどまり、別の例で示します。

CRANから、Rのパッケージqqmanをインストールしてあるとして次になります。

library(qqman)
manhattan(gwasResults, chr="CHR", bp="BP", snp="SNP", p="P" )

gwasResultsはパッケージqqman付属のデータで、次のようにSNPの名称・染色体・位置・表現型と当該SNPとの関連性がないと仮定した場合の確率P値の４項目のデータが16470行続きます。

で、このスクリプトの結果は次の図のようになります。

色が寂しいので、同じデータでウクライナを思わせるカラーで表現すると

# Load the library
library(qqman)

# Make the Manhattan plot on the gwasResults dataset
manhattan(gwasResults, chr="CHR", bp="BP", snp="SNP", p="P",  col = c("#0057B7", "#FFDD00"))

次のようになります

図の中のSNPを表示するには　, annotatePval = 0.01　を追加します

# Load the library
library(qqman)

# Make the Manhattan plot on the gwasResults dataset
manhattan(gwasResults, chr="CHR", bp="BP", snp="SNP", p="P",  col = c("#0057B7", "#FFDD00"), annotatePval = 0.01)

もう少し図にバリエーションを

３番染色体の集中していくつものSNPが高い-log10(p)値を示すのに頂上の変異しか名前が表示されないので　annotateTop = FALSE　というオプションをつけてみました。

# Load the library
library(qqman)

# Make the Manhattan plot on the gwasResults dataset
manhattan(subset(gwasResults, CHR == 3), chr="CHR", bp="BP", snp="SNP", p="P"
          ,  col = c("#0057B7", "#FFDD00"), annotatePval = 0.001
          , annotateTop = FALSE, main = "Chr 3")

３番目の染色体に関連のありそうなSNPが集中しているようなので3番目のsubsetを表示してみます。肝は　subset(gwasResults, CHR ==3)　の個所です。

# Load the library
library(qqman)

# Make the Manhattan plot on the gwasResults dataset
manhattan(subset(gwasResults, CHR == 3), chr="CHR", bp="BP", snp="SNP", p="P"
          ,  col = c("#0057B7", "#FFDD00"), annotatePval = 0.001
          , annotateTop = FALSE, main = "Chr 3")

気になるあたりをもう少し拡大します

# Load the library
library(qqman)

# Make the Manhattan plot on the gwasResults dataset
manhattan(subset(gwasResults, CHR == 3), chr="CHR", bp="BP", snp="SNP", p="P"
          ,  col = c("#0057B7", "#FFDD00"), annotatePval = 0.001
          , annotateTop = FALSE, main = "Chr 3", xlim = c(200,500))

データの作成

上記の作図は単純で、各Chromosome上のそれぞれの位置でp値をプロットしただけのものなので、結局はp値を計算して大きな外れ値（-> association）を示す位置を目視で確認しやすくしたものだという事がわかりました。

肝となるのはp値の計算になります。それでは、p値をどうやって計算していたかというと、複数人のSNPのデータと、それぞれのサンプル（の人）の興味のある表現型のデータを用いて表現型と無関係なSNPか表現型とassociateしているSNPかを計算しています。

plink.exe　（windows用）がインストールされていて、冒頭の書籍の付録のファイル　1KG_EUR_QC.bed, 1KG_EUR_QC.bim, 1KG_EUR_QC.fam とかのデータがあったとして、コマンドプロンプトで次を実施しました。

plink.exe --bfile 1KG_EUR_QC --out 1KG_QC_Pheno1 --pheno phenotype1.txt --logistic --ci 0.95

上記で作成されるファイルから、p値等のデータを抽出するのにawkを使いました。awkを使うのに、MacOSだとawkはデフォルトで入っているのですが、今回はwindowsを使いましたのでCYGWINで実行しました。

awk '{print $2"\t"($1*100000000000+$3)"\t"$12}' 1KG_QC_Pheno1.assoc.logistic > 1KG_QC_Pheno1.assoc.logistic.P.txt

この出力で生成される　1KG_QC_Pheno1.assoc.logistic.P.txt　ファイルを上の方で記したRスクリプトのインプットとすることで、マンハッタンプロットを描くことができました。

公開データを使って練習

さらなる練習用という事で「心筋梗塞1666症例および対照健常者3198名のGWAS」データが公開されており、使用についての制限がないためこちらのデータで試してみました。
（制限がない＝NBDC非制限公開データとは、アクセスに制限を設けることなく、誰でも利用することが可能な公開データです。）
次のサイトからダウンロードしました。

https://humandbs.biosciencedbc.jp/

「ゼロから実践する 遺伝統計学セミナー〜疾患とゲノムを結びつける」に従った例でawkで行っっていた、行の抽出の部分はをsqlで行いました。
好みの問題かもしれませんが、windowsでlinux emulatorみたいなのを稼働させてawk走らせるより、Microsoft AccessのSQLで抽出するのが素直に開発しやすいと感じました。

SELECT Release_L12vsUniv06_AllSample.[#SNPID] AS SNP, Release_L12vsUniv06_AllSample.chr AS chr, Release_L12vsUniv06_AllSample.chrloc AS location, Release_L12vsUniv06_AllSample.ptrend AS p INTO [0010 GWAS_results]
FROM Release_L12vsUniv06_AllSample;

で作図は次のようにしました。

library(readxl)
library(qqman)

GWAS_results <- read_excel("0010 GWAS_results.xlsx")
manhattan(GWAS_results, chr="chr", bp="location", snp="SNP", p="p"
          ,  col = c("#0057B7", "#FFDD00"), annotatePval = 0.00001
          ,  annotateTop = FALSE)

manhattan(subset(GWAS_results, chr == 12), chr="chr", bp="location", snp="SNP", p="p"
          ,  col = c("#0057B7", "#FFDD00"), annotatePval = 0.00001
          ,  annotateTop = FALSE, xlim = c(1.1e+8, 1.12e+08))

12番染色体の3’側に不均衡が集中している様なのでそのあたりを拡大したりしました。

SARS-CoV-2（新型コロナウイルス）のSpikeタンパク質

Spikeのアミノ酸配列

新型コロナウイルス肺炎COVID-19の原因ウイルスである、SARS-CoV-2ウイルスのSpikeタンパク質のアミノ酸配列についてみてみました。一般にウイルスで変異のない株を野生型と呼びます。野生型のタンパク質のアミノ酸残基の配列を見ると、484番目のアミノ酸残基がE(Glutamic Acid, Glu)で、501番目のアミノ酸残基はN(Asparagine, Asn)です。

ちなみに変異の書き方ですが、この484番目のEがK(Lysine, Lys)に変異した場合E484Kと表記します。同様に501番目のNがY(Tyrosine, Tyr)に変異した場合にN501Yと表記します。

LOCUS       QOS45029                1273 aa            linear   SYN 28-OCT-2020
DEFINITION  SARS-CoV-2 spike [synthetic construct].
ACCESSION   QOS45029
VERSION     QOS45029.1
DBSOURCE    accession MW036243.1

KEYWORDS    .
SOURCE      synthetic construct
  ORGANISM  synthetic construct

            other sequences; artificial sequences.
REFERENCE   1  (residues 1 to 1273)
  AUTHORS   Wussow,F., Chiuppesi,F. and Diamond,D.
  TITLE     Development of a Multi-Antigenic SARS-CoV-2 Vaccine Using a
            Synthetic Poxvirus Platform
  JOURNAL   Unpublished
REFERENCE   2  (residues 1 to 1273)
  AUTHORS   Wussow,F., Chiuppesi,F. and Diamond,D.
  TITLE     Direct Submission
  JOURNAL   Submitted (23-SEP-2020) Hematology, City of Hope, 1500 E Duarte Rd,
            Duarte, CA 91010, USA
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..1273
                     /organism="synthetic construct"
                     /db_xref="taxon:32630"
                     /clone="C35/41"
     Protein         1..1273
                     /product="SARS-CoV-2 spike"
     CDS             1..1273
                     /coded_by="MW036243.1:145058..148879"
                     /transl_table=11
ORIGIN      
        1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs
       61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv
      121 nnatnvvikv cefqfcndpf lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle
      181 gkqgnfknlr efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrdlpqgf saleplvdlp iginitrfqt
      241 llalhrsylt pgdsssgwta gaaayyvgyl qprtfllkyn engtitdavd caldplsetk
      301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn
      361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtgkiad
      421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn ylyrlfrksn lkpferdist eiyqagstpc
      481 ngvEgfncyf plqsygfqpt Ngvgyqpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn
      541 fnfngltgtg vltesnkkfl pfqqfgrdia dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp
      601 gtntsnqvav lyqdvnctev pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl igaehvnnsy
      661 ecdipigagi casyqtqtns prrarsvasq siiaytmslg aensvaysnn siaiptnfti
      721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe
      781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc
      841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam
      901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss tasalgklqd vvnqnaqaln
      961 tlvkqlssnf gaissvlndi lsrldkveae vqidrlitgr lqslqtyvtq qliraaeira
     1021 sanlaatkms ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpa qeknfttapa
     1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy epqiittdnt fvsgncdvvi givnntvydp
     1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis ginasvvniq keidrlneva knlneslidl
     1201 qelgkyeqyi kwpwyiwlgf iagliaivmv timlccmtsc csclkgccsc gscckfdedd
     1261 sepvlkgvkl hyt
//

感染・伝播性の増加が懸念されるSARS-CoV-2の変異 E484K N501Y

多くの変異が発生するはずのウイルスで、E484KやN501Yの変異は感染性や伝播性の増加が懸念されるとされています。この変異のある場所は、ヒトの細胞に侵入する際にまず結合する分子であるangiotensin-converting enzyme2 (ACE2)との結合に重要だとされています。このあたりを昨年も見た記憶がありますが、変異のウイルスが国内でも報告されるようになってきましたので、その変異の起こる部分が立体的にどういう位置にあたるのか、SARS-CoV-2 SpikeとAEC2が結合してる立体構造を調べたデータの公開データを元に見てみました。まずは野生型のSpikeで示します。緑色のモコモコしたのが変異すると悪い性質を獲得するのではないかと心配されている場所のアミノ酸残基を示します。（下図）

上図の当該のアミノ酸残基を、変異したアミノ酸残基に置き換えた図もしめします。（下図）側鎖のエネルギーだけ小さくなるように調整はしましたが、示された構造全体は動かない設定ですので本当にこの形になっているとは期待できません。

その変異部分の拡大図です（下図）

E484Kは荷電が反転する

アミノ酸の基本的な分類に荷電の陽性・陰性があります。E484Kは484番目のEがKに変異した事を示します。野生型のEは陰性荷電を示す酸性極性側鎖アミノ酸で、一方変異型のKは陽性荷電を示す塩基性アミノ酸です。感染性等が増加する懸念は、荷電が逆転することでACE2への結合に変化が起きると推定されることから来ているものと思われます。また、ワクチンの効果が減弱するという懸念もあります。この懸念は、ワクチンの効果が結合領域（328-533aa）に対する抗体によるところがあって、この変異が結合領域の中心付近の484aaに存在している点に加えて、荷電が逆転することで抗体の結合にも変化が起きると推定されるところからきているのではないかと思います。

ちなみに基礎知識としてアミノ酸側鎖の性質と、略号をまとめた物をコールドスプリングハーバー（CSH）の実験プロトコール集のような書籍のMolecula Cloning a laboratory manual volume 3から抜粋です。E (Glu)がAcidic groupで、K(Lys)がBasic groupとなっています。

cBioPortalとは何か

cBioPortal for Cancer Genomicsとは何か、という問いについてはオリジナルのサイトをみていただくのが速いのでしょう。公開された遺伝子関連情報（変異情報、遺伝子発現情報、臨床情報他）と解析ツールを組み合わせたもの、というのが私の理解です。これを使って何が判るのか、ということを少し触ってみましたので、メモしてゆきます。

今回はまず第一弾として遺伝子変異にかかる情報を表示してみました。

データセットの選択

cBioPortalでは解析しやすい形で格納されたデータが提供されています。今回はとりあえずこの提供されたデータを表示することにします。次の図はcBioPortalのトップページです。

1. Pan Cancerのなかの、MSK-IMPACT clinical sequencing cohortのファイルのチェックボックスをクリックして選択します。
2.  下のほうにある「Query By Gene」ボタンをクリックします。

表示する遺伝子の選択

上記でボタンをクリックすると推移する画面が次です。

1. Enter Genes: のボックス内に遺伝子名(HUGO gene nomenclature）で入力します。今回はERBB2と入力しています。個人的にはHER2 (erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)という名前で、Gefitinibの標的として親しんできた遺伝子ですが、HUGO gene nomenclatureではERBB2というシンボルです。
2. 「Submit Query」  ボタンをクリックします。

まずは概要が表示されます

上記でクリックしてしばらくすると表示される画面が次の通りです。

この画面はOnco Printというタブの情報が示されています。赤くて太いラインが目に入ります。下のレジェンドをみますと、これはgene amplificationを示しています。この図もよく見るといろいろな情報があります。解析対象の症例の7％の症例に何らかの変異がある、あるいは、解析対象のサンプルの7％のサンプルに何らかの異常があること、ドライバー変異もあれば、意義が不明の変異もあることも示されています。点変異の様なものもあれば他の遺伝子への融合や途中で翻訳が終わるtruncationになる変異もあります。

がん種ごとの情報を見るには

1. 「Cancer Types Summary」タブをクリックして、がん種ごとの変異情報を表示します

変異の頻度が比較的多いのが食道癌で、Amplificationの頻度が多い様です。

遺伝子のどこに変異が多いか

「Mutation」タブをクリックすると次の画面になります。

この画面では、遺伝子の中のどこに変異があるのか、ある場合は頻度も見て取れます。また、遺伝子の各ドメインが表示されています。たとえば、図の中で飛び出して目立っている、S310F/Yは310 番目のセリンがフェニルアラニンやタイロシンに変わる変異が報告されていることを示しています。その変異がある場所が翻訳後の蛋白質としてはFurin-likeドメインに存在することもわかります。そして、高い位置に丸があるのはその変異の頻度が多いことを示しています。この緑の丸をクリックすると、下の症例リストも変化します。

上図の状態で、右中程にあります虫メガネのアイコンのボックスに「lung」と入力してみますと、肺がんの情報に書き換えられます。（他のがん種の情報を除いた形で表示されます。）

全がん種の情報では変異の頻度が高かった310番目のアミノ酸残基の変異は目立たなくなりまして、代わりにY772_A775 dupという変異の頻度が目立っています。この変異があるのはタイロシンリン酸化酵素ドメインと呼ばれる部分になります。この変異をクリックして置いて、下の症例リストのアノテーションのアイコンにマウスをオーバーする（クリックはしない）と、この変異がhot spotにある事や、oncogenicの変異であることが表示されます。

虫メガネアイコンにBreastと入れて見ると今度は乳がんでの情報が表示されます。若干見た目は代わりますが、乳がんも肺がん同様に、タイロシンリン酸化酵素ドメインでの変異が多いことがわかります。一方、bladderと入力しますと、細胞外ドメインの変異が多く、細胞内のタイロシンリン酸化酵素ドメインの変異が相対的に少ないことがわかります。

今度は右側の「view 3D structure」ボタンを押してみます。

PDB chains のあたりにマウスを持ってくると、PDBのどの立体構造情報で表示するかを選ぶことができる様になります。上図は一番上の行の右側（C末端側）の四角をクリックした状態です。右側の窓に立体構造が表示されまして、これをくりくり回したり拡大縮小して表示したりすることができます。グレーの中に緑やエンジの着色がなされている場所は変異が報告されている場所を示します。

他にも、機能がついていますがとりあえず変異に関しての面白そうな機能はこんなところです。

ゲノム配列を見てみました

COVID19の原因ウイルスであるSARS-Cov-2のゲノム配列が公開されているのでとりあえず眺めてみました。こういうのは、ちょっと遺伝子を扱う研究的なことをやったことのある人にとっては、元ファイルを見た方が速いんでしょうけど。以前はアクセション番号とか言っていましたが、シーケンスのIDは次の通りです；NCBI Reference Sequence: NC_045512.2

約29.9千塩基とシーケンスは長いのでこのページの下の方に示すとして、主な構造です。GC％　約38%。11種類の遺伝子から12種類の成熟タンパク質が翻訳されると報告されています。上流（5′-末）から順に見ていきます。265塩基の5′-UTRに引き続いて出てくるタンパク質をコードしているとされる配列はORF1abとされています。

gene ORF1ab

 gene            266..21555

大きな遺伝子が設定されています

CDS             join(266..13468,13468..21555)

ココは興味深いところで、13468までのコドンをtta aacと読んでおいて、一塩基分５’側に引き返して、その最後のcを次のコドンの頭と読み替えています。（2度Cを読むような感じ）

13451 gca[A]..caa[Q]..tcg[S]..ttt[F]..tta[L]..aac[N]..ggg[G]..ttt[F]..gcg[A]..gtg[V].. taa[stop] -> 

13451 gca[A]..caa[Q]..tcg[S]..ttt[F]..tta[L]..aac[N]..cgg[R]..gtt[V]..tgc[C]..ggt[G]..gta[V]..agt[S]..gca[A]…

ribosomal_slippage
note="pp1ab; translated by -1 ribosomal frameshift"

と注釈が入っています。リボゾームがスリップして、フレームシフトを起こすようです。この現象は2005年にはコロナウイルスで報告があります。¹

ORF1 a/bは大きなペプチドで、複数のたんぱく質(mature protein)をコードしています。その機能は、良く判りません。

gene S

ORF1 a/bに続く遺伝子は「S」　スパイクタンパク質をコードする遺伝子です。このタンパク質がACE2と結合してヒト細胞に侵入するのに大きな役割を担っていると報告されています。

gene            21563..25384
                gene="S"

アミノ酸配列です

/translation="MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFR
SSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIR
GWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVY
SSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQ
GFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFL
LKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITN
LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCF
TNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYN
YLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY
RVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFG
RDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAI
HADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPR
RARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTM
YICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFG
GFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFN
GLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQN
VLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGA
ISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMS
ECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAH
FPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELD
SFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELG
KYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSE
PVLKGVKLHYT

ORF３a

Sに続く配列がORF3a

gene            25393..26220
                /gene="ORF3a"

gene E

ORF3aに続くのは、SARS-Cov-2 ウイルスの構造タンパク質であるエンベロープをコードする遺伝子です。

gene            26245..26472
                /gene="E"

アミノ酸配列です

/translation="MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCC
NIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV"

Envelopeにはあまり、面白そうなリガンドが含まれる相同性のある構造が報告されていないようなので、アライメントした結果をここに貼っておきます。

gene M

gene E　に続くのは、gene Mです。

gene            26523..27191
                /gene="M"

アミノ酸配列です。

/translation="MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNR
FLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRL
FARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCD
IKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIA
LLVQ"

M-proteinで相同性検索すると、リガンドが含まれる構造が８種類あるのですが、既知の構造とSARS-CoV-2のM-proteinで相同性がある範囲が狭いのと、テンプレートのリガンドの位置が気に入らないので、これ以上深追いしないという事で、アライメントを公開します。

ORF6, 7a, 7b, 8

gene Mに続くのは、ORF6, 7a, 7b, 8です。

gene            27202..27387
                /gene="ORF6"
gene            27394..27759
                /gene="ORF7a"
gene            27756..27887
                /gene="ORF7b"
gene            27894..28259
                /gene="ORF8"

gene N

ORF 8につづくのは、gene Nで、これはnucleocapsid phosphoproteinをコードします。

gene            28274..29533
                /gene="N"

アミノ酸残基です

/translation="MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQG
LPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMK
DLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQ
LPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAA
LALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGR
RGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYT
GAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTV
TLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA"

ORF10

gene Nに続いて出てくる読み枠が最も3′-末のORF10です。

gene            29558..29674
                /gene="ORF10"

これに引き続いて3′-UTR配列が来ます。

全配列

ORIGIN      
        1 attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct
       61 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact
      121 cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc
      181 ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt
      241 cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac
      301 acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg
      361 agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg
      421 cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa
      481 acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact
      541 cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg
      601 cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg
      661 tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga
      721 tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga
      781 actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg
      841 ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc
      901 atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg
      961 tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca
     1021 gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa
     1081 ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa
     1141 gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg
     1201 caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca
     1261 gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga
     1321 aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc
     1381 atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg
     1441 cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc
     1501 ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg
     1561 ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga
     1621 aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga
     1681 gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa
     1741 aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac
     1801 aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc
     1861 tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct
     1921 tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg
     1981 aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac
     2041 taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg
     2101 gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga
     2161 agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat
     2221 ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa
     2281 ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc
     2341 tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca
     2401 ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc
     2461 tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt
     2521 aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga
     2581 agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga
     2641 aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac
     2701 cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga
     2761 agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt
     2821 acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc
     2881 ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc
     2941 actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg
     3001 tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga
     3061 agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga
     3121 agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga
     3181 agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga
     3241 cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt
     3301 agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt
     3361 aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt
     3421 aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc
     3481 aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc
     3541 tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa
     3601 acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa
     3661 gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg
     3721 tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa
     3781 tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga
     3841 aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa
     3901 gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat
     3961 caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa
     4021 cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag
     4081 tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca
     4141 agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat
     4201 gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca
     4261 gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc
     4321 cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc
     4381 ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg
     4441 tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca
     4501 agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc
     4561 gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta
     4621 tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc
     4681 agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc
     4741 ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa
     4801 agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga
     4861 taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac
     4921 ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac
     4981 aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca
     5041 acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc
     5101 acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt
     5161 tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca
     5221 cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa
     5281 caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc
     5341 acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc
     5401 acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat
     5461 gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg
     5521 taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg
     5581 cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca
     5641 agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc
     5701 tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca
     5761 gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt
     5821 acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag
     5881 ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat
     5941 tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat
     6001 tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg
     6061 tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc
     6121 aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta
     6181 taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg
     6241 gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg
     6301 tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga
     6361 cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt
     6421 ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt
     6481 aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca
     6541 cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga
     6601 attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag
     6661 tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac
     6721 aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt
     6781 ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc
     6841 atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga
     6901 ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg
     6961 gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt
     7021 tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa
     7081 ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct
     7141 tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc
     7201 atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat
     7261 tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag
     7321 ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt
     7381 acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta
     7441 tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg
     7501 ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag
     7561 gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg
     7621 tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga
     7681 cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga
     7741 tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac
     7801 ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac
     7861 taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc
     7921 atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact
     7981 agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga
     8041 tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact
     8101 agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac
     8161 ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt
     8221 tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa
     8281 ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat
     8341 tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat
     8401 atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc
     8461 tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa
     8521 tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca
     8581 gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc
     8641 tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat
     8701 tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc
     8761 tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc
     8821 attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac
     8881 gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt
     8941 tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc
     9001 ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata
     9061 ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac
     9121 acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc
     9181 tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc
     9241 agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag
     9301 atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac
     9361 accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat
     9421 tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg
     9481 tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact
     9541 ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt
     9601 gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt
     9661 cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca
     9721 tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt
     9781 tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa
     9841 gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa
     9901 taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg
     9961 tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc
    10021 accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc
    10081 atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg
    10141 tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat
    10201 gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca
    10261 ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct
    10321 taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg
    10381 acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc
    10441 tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg
    10501 ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac
    10561 tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca
    10621 aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta
    10681 cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga
    10741 ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat
    10801 actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa
    10861 agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga
    10921 tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt
    10981 gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt
    11041 agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt
    11101 accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa
    11161 gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat
    11221 ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac
    11281 tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact
    11341 aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat
    11401 gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc
    11461 catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat
    11521 gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac
    11581 tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg
    11641 ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga
    11701 ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa
    11761 gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg
    11821 tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt
    11881 actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt
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    12001 ttcactactt tctgttttgc tttccatgca gggtgctgta gacataaaca agctttgtga
    12061 agaaatgctg gacaacaggg caaccttaca agctatagcc tcagagttta gttcccttcc
    12121 atcatatgca gcttttgcta ctgctcaaga agcttatgag caggctgttg ctaatggtga
    12181 ttctgaagtt gttcttaaaa agttgaagaa gtctttgaat gtggctaaat ctgaatttga
    12241 ccgtgatgca gccatgcaac gtaagttgga aaagatggct gatcaagcta tgacccaaat
    12301 gtataaacag gctagatctg aggacaagag ggcaaaagtt actagtgcta tgcagacaat
    12361 gcttttcact atgcttagaa agttggataa tgatgcactc aacaacatta tcaacaatgc
    12421 aagagatggt tgtgttccct tgaacataat acctcttaca acagcagcca aactaatggt
    12481 tgtcatacca gactataaca catataaaaa tacgtgtgat ggtacaacat ttacttatgc
    12541 atcagcattg tgggaaatcc aacaggttgt agatgcagat agtaaaattg ttcaacttag
    12601 tgaaattagt atggacaatt cacctaattt agcatggcct cttattgtaa cagctttaag
    12661 ggccaattct gctgtcaaat tacagaataa tgagcttagt cctgttgcac tacgacagat
    12721 gtcttgtgct gccggtacta cacaaactgc ttgcactgat gacaatgcgt tagcttacta
    12781 caacacaaca aagggaggta ggtttgtact tgcactgtta tccgatttac aggatttgaa
    12841 atgggctaga ttccctaaga gtgatggaac tggtactatc tatacagaac tggaaccacc
    12901 ttgtaggttt gttacagaca cacctaaagg tcctaaagtg aagtatttat actttattaa
    12961 aggattaaac aacctaaata gaggtatggt acttggtagt ttagctgcca cagtacgtct
    13021 acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt
    13081 tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac
    13141 taattgtgtt aagatgttgt gtacacacac tggtactggt caggcaataa cagttacacc
    13201 ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg
    13261 ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat
    13321 acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt
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    13441 gtcagctgat gcacaatcgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca
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    13861 acattaaaag aaatacttgt cacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag
    13921 gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa
    13981 cgtgtacgcc aagctttgtt aaaaacagta caattctgtg atgccatgcg aaatgctggt
    14041 attgttggtg tactgacatt agataatcaa gatctcaatg gtaactggta tgatttcggt
    14101 gatttcatac aaaccacgcc aggtagtgga gttcctgttg tagattctta ttattcattg
    14161 ttaatgccta tattaacctt gaccagggct ttaactgcag agtcacatgt tgacactgac
    14221 ttaacaaagc cttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta
    14281 aaactctttg accgttattt taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac
    14341 tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg
    14401 ttcccaccta caagttttgg accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt
    14461 gtagtttcaa ctggatacca cttcagagag ctaggtgttg tacataatca ggatgtaaac
    14521 ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg
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    14641 cttactaaca atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat
    14701 gactttgctg tgtctaaggg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc
    14761 ttctttgctc aggatggtaa tgctgctatc agcgattatg actactatcg ttataatcta
    14821 ccaacaatgt gtgatatcag acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt
    14881 gattgttacg atggtggctg tattaatgct aaccaagtca tcgtcaacaa cctagacaaa
    14941 tcagctggtt ttccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ttcaatgagt
    15001 tatgaggatc aagatgcact tttcgcatat acaaaacgta atgtcatccc tactataact
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    15121 tctatctgta gtactatgac caatagacag tttcatcaaa aattattgaa atcaatagcc
    15181 gccactagag gagctactgt agtaattgga acaagcaaat tctatggtgg ttggcacaac
    15241 atgttaaaaa ctgtttatag tgatgtagaa aaccctcacc ttatgggttg ggattatcct
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    15421 caagtattga gtgaaatggt catgtgtggc ggttcactat atgttaaacc aggtggaacc
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    15601 cgcaatttac aacacagact ttatgagtgt ctctatagaa atagagatgt tgacacagac
    15661 tttgtgaatg agttttacgc atatttgcgt aaacatttct caatgatgat actctctgac
    15721 gatgctgttg tgtgtttcaa tagcacttat gcatctcaag gtctagtggc tagcataaag
    15781 aactttaagt cagttcttta ttatcaaaac aatgttttta tgtctgaagc aaaatgttgg
    15841 actgagactg accttactaa aggacctcat gaattttgct ctcaacatac aatgctagtt
    15901 aaacagggtg atgattatgt gtaccttcct tacccagatc catcaagaat cctaggggcc
    15961 ggctgttttg tagatgatat cgtaaaaaca gatggtacac ttatgattga acggttcgtg
    16021 tctttagcta tagatgctta cccacttact aaacatccta atcaggagta tgctgatgtc
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    16141 gacatgtatt ctgttatgct tactaatgat aacacttcaa ggtattggga acctgagttt
    16201 tatgaggcta tgtacacacc gcatacagtc ttacaggctg ttggggcttg tgttctttgc
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    16321 tgctgttacg accatgtcat atcaacatca cataaattag tcttgtctgt taatccgtat
    16381 gtttgcaatg ctccaggttg tgatgtcaca gatgtgactc aactttactt aggaggtatg
    16441 agctattatt gtaaatcaca taaaccaccc attagttttc cattgtgtgc taatggacaa
    16501 gtttttggtt tatataaaaa tacatgtgtt ggtagcgata atgttactga ctttaatgca
    16561 attgcaacat gtgactggac aaatgctggt gattacattt tagctaacac ctgtactgaa
    16621 agactcaagc tttttgcagc agaaacgctc aaagctactg aggagacatt taaactgtct
    16681 tatggtattg ctactgtacg tgaagtgctg tctgacagag aattacatct ttcatgggaa
    16741 gttggtaaac ctagaccacc acttaaccga aattatgtct ttactggtta tcgtgtaact
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    16861 gttgtttacc gaggtacaac aacttacaaa ttaaatgttg gtgattattt tgtgctgaca
    16921 tcacatacag taatgccatt aagtgcacct acactagtgc cacaagagca ctatgttaga
    16981 attactggct tatacccaac actcaatatc tcagatgagt tttctagcaa tgttgcaaat
    17041 tatcaaaagg ttggtatgca aaagtattct acactccagg gaccacctgg tactggtaag
    17101 agtcattttg ctattggcct agctctctac tacccttctg ctcgcatagt gtatacagct
    17161 tgctctcatg ccgctgttga tgcactatgt gagaaggcat taaaatattt gcctatagat
    17221 aaatgtagta gaattatacc tgcacgtgct cgtgtagagt gttttgataa attcaaagtg
    17281 aattcaacat tagaacagta tgtcttttgt actgtaaatg cattgcctga gacgacagca
    17341 gatatagttg tctttgatga aatttcaatg gccacaaatt atgatttgag tgttgtcaat
    17401 gccagattac gtgctaagca ctatgtgtac attggcgacc ctgctcaatt acctgcacca
    17461 cgcacattgc taactaaggg cacactagaa ccagaatatt tcaattcagt gtgtagactt
    17521 atgaaaacta taggtccaga catgttcctc ggaacttgtc ggcgttgtcc tgctgaaatt
    17581 gttgacactg tgagtgcttt ggtttatgat aataagctta aagcacataa agacaaatca
    17641 gctcaatgct ttaaaatgtt ttataagggt gttatcacgc atgatgtttc atctgcaatt
    17701 aacaggccac aaataggcgt ggtaagagaa ttccttacac gtaaccctgc ttggagaaaa
    17761 gctgtcttta tttcacctta taattcacag aatgctgtag cctcaaagat tttgggacta
    17821 ccaactcaaa ctgttgattc atcacagggc tcagaatatg actatgtcat attcactcaa
    17881 accactgaaa cagctcactc ttgtaatgta aacagattta atgttgctat taccagagca
    17941 aaagtaggca tactttgcat aatgtctgat agagaccttt atgacaagtt gcaatttaca
    18001 agtcttgaaa ttccacgtag gaatgtggca actttacaag ctgaaaatgt aacaggactc
    18061 tttaaagatt gtagtaaggt aatcactggg ttacatccta cacaggcacc tacacacctc
    18121 agtgttgaca ctaaattcaa aactgaaggt ttatgtgttg acatacctgg catacctaag
    18181 gacatgacct atagaagact catctctatg atgggtttta aaatgaatta tcaagttaat
    18241 ggttacccta acatgtttat cacccgcgaa gaagctataa gacatgtacg tgcatggatt
    18301 ggcttcgatg tcgaggggtg tcatgctact agagaagctg ttggtaccaa tttaccttta
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    18421 cctaataata cagatttttc cagagttagt gctaaaccac cgcctggaga tcaatttaaa
    18481 cacctcatac cacttatgta caaaggactt ccttggaatg tagtgcgtat aaagattgta
    18541 caaatgttaa gtgacacact taaaaatctc tctgacagag tcgtatttgt cttatgggca
    18601 catggctttg agttgacatc tatgaagtat tttgtgaaaa taggacctga gcgcacctgt
    18661 tgtctatgtg atagacgtgc cacatgcttt tccactgctt cagacactta tgcctgttgg
    18721 catcattcta ttggatttga ttacgtctat aatccgttta tgattgatgt tcaacaatgg
    18781 ggttttacag gtaacctaca aagcaaccat gatctgtatt gtcaagtcca tggtaatgca
    18841 catgtagcta gttgtgatgc aatcatgact aggtgtctag ctgtccacga gtgctttgtt
    18901 aagcgtgttg actggactat tgaatatcct ataattggtg atgaactgaa gattaatgcg
    18961 gcttgtagaa aggttcaaca catggttgtt aaagctgcat tattagcaga caaattccca
    19021 gttcttcacg acattggtaa ccctaaagct attaagtgtg tacctcaagc tgatgtagaa
    19081 tggaagttct atgatgcaca gccttgtagt gacaaagctt ataaaataga agaattattc
    19141 tattcttatg ccacacattc tgacaaattc acagatggtg tatgcctatt ttggaattgc
    19201 aatgtcgata gatatcctgc taattccatt gtttgtagat ttgacactag agtgctatct
    19261 aaccttaact tgcctggttg tgatggtggc agtttgtatg taaataaaca tgcattccac
    19321 acaccagctt ttgataaaag tgcttttgtt aatttaaaac aattaccatt tttctattac
    19381 tctgacagtc catgtgagtc tcatggaaaa caagtagtgt cagatataga ttatgtacca
    19441 ctaaagtctg ctacgtgtat aacacgttgc aatttaggtg gtgctgtctg tagacatcat
    19501 gctaatgagt acagattgta tctcgatgct tataacatga tgatctcagc tggctttagc
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    19801 cgcaacatta aaccagtacc agaggtgaaa atactcaata atttgggtgt ggacattgct
    19861 gctaatactg tgatctggga ctacaaaaga gatgctccag cacatatatc tactattggt
    19921 gtttgttcta tgactgacat agccaagaaa ccaactgaaa cgatttgtgc accactcact
    19981 gtcttttttg atggtagagt tgatggtcaa gtagacttat ttagaaatgc ccgtaatggt
    20041 gttcttatta cagaaggtag tgttaaaggt ttacaaccat ctgtaggtcc caaacaagct
    20101 agtcttaatg gagtcacatt aattggagaa gccgtaaaaa cacagttcaa ttattataag
    20161 aaagttgatg gtgttgtcca acaattacct gaaacttact ttactcagag tagaaattta
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    20281 ttcattgaac ggtataaatt agaaggctat gccttcgaac atatcgttta tggagatttt
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    21001 tgtgcaactg tacatacagc taataaatgg gatctcatta ttagtgatat gtacgaccct
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    21241 actaatgtga atgcgtcatc atctgaagca tttttaattg gatgtaatta tcttggcaaa
    21301 ccacgcgaac aaatagatgg ttatgtcatg catgcaaatt acatattttg gaggaataca
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    21481 cttagtaaag gtagacttat aattagagaa aacaacagag ttgttatttc tagtgatgtt
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    21901 gacccagtcc ctacttattg ttaataacgc tactaatgtt gttattaaag tctgtgaatt
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    22681 attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac
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    22861 tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta
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    23341 tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca
    23401 ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg
    23461 gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc
    23521 tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag
    23581 ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat
    23641 tgcctacact atgtcacttg gtgcagaaaa ttcagttgct tactctaata actctattgc
    23701 catacccaca aattttacta ttagtgttac cacagaaatt ctaccagtgt ctatgaccaa
    23761 gacatcagta gattgtacaa tgtacatttg tggtgattca actgaatgca gcaatctttt
    23821 gttgcaatat ggcagttttt gtacacaatt aaaccgtgct ttaactggaa tagctgttga
    23881 acaagacaaa aacacccaag aagtttttgc acaagtcaaa caaatttaca aaacaccacc
    23941 aattaaagat tttggtggtt ttaatttttc acaaatatta ccagatccat caaaaccaag
    24001 caagaggtca tttattgaag atctactttt caacaaagtg acacttgcag atgctggctt
    24061 catcaaacaa tatggtgatt gccttggtga tattgctgct agagacctca tttgtgcaca
    24121 aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata
    24181 cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc
    24241 attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc ttataggttt aatggtattg gagttacaca
    24301 gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat tgccaaccaa tttaatagtg ctattggcaa
    24361 aattcaagac tcactttctt ccacagcaag tgcacttgga aaacttcaag atgtggtcaa
    24421 ccaaaatgca caagctttaa acacgcttgt taaacaactt agctccaatt ttggtgcaat
    24481 ttcaagtgtt ttaaatgata tcctttcacg tcttgacaaa gttgaggctg aagtgcaaat
    24541 tgataggttg atcacaggca gacttcaaag tttgcagaca tatgtgactc aacaattaat
    24601 tagagctgca gaaatcagag cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt cagagtgtgt
    24661 acttggacaa tcaaaaagag ttgatttttg tggaaagggc tatcatctta tgtccttccc
    24721 tcagtcagca cctcatggtg tagtcttctt gcatgtgact tatgtccctg cacaagaaaa
    24781 gaacttcaca actgctcctg ccatttgtca tgatggaaaa gcacactttc ctcgtgaagg
    24841 tgtctttgtt tcaaatggca cacactggtt tgtaacacaa aggaattttt atgaaccaca
    24901 aatcattact acagacaaca catttgtgtc tggtaactgt gatgttgtaa taggaattgt
    24961 caacaacaca gtttatgatc ctttgcaacc tgaattagac tcattcaagg aggagttaga
    25021 taaatatttt aagaatcata catcaccaga tgttgattta ggtgacatct ctggcattaa
    25081 tgcttcagtt gtaaacattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggttg ccaagaattt
    25141 aaatgaatct ctcatcgatc tccaagaact tggaaagtat gagcagtata taaaatggcc
    25201 atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacaattat
    25261 gctttgctgt atgaccagtt gctgtagttg tctcaagggc tgttgttctt gtggatcctg
    25321 ctgcaaattt gatgaagacg actctgagcc agtgctcaaa ggagtcaaat tacattacac
    25381 ataaacgaac ttatggattt gtttatgaga atcttcacaa ttggaactgt aactttgaag
    25441 caaggtgaaa tcaaggatgc tactccttca gattttgttc gcgctactgc aacgataccg
    25501 atacaagcct cactcccttt cggatggctt attgttggcg ttgcacttct tgctgttttt
    25561 cagagcgctt ccaaaatcat aaccctcaaa aagagatggc aactagcact ctccaagggt
    25621 gttcactttg tttgcaactt gctgttgttg tttgtaacag tttactcaca ccttttgctc
    25681 gttgctgctg gccttgaagc cccttttctc tatctttatg ctttagtcta cttcttgcag
    25741 agtataaact ttgtaagaat aataatgagg ctttggcttt gctggaaatg ccgttccaaa
    25801 aacccattac tttatgatgc caactatttt ctttgctggc atactaattg ttacgactat
    25861 tgtatacctt acaatagtgt aacttcttca attgtcatta cttcaggtga tggcacaaca
    25921 agtcctattt ctgaacatga ctaccagatt ggtggttata ctgaaaaatg ggaatctgga
    25981 gtaaaagact gtgttgtatt acacagttac ttcacttcag actattacca gctgtactca
    26041 actcaattga gtacagacac tggtgttgaa catgttacct tcttcatcta caataaaatt
    26101 gttgatgagc ctgaagaaca tgtccaaatt cacacaatcg acggttcatc cggagttgtt
    26161 aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga ctactagcgt gcctttgtaa
    26221 gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt cggaagagac aggtacgtta
    26281 atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc
    26341 atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta
    26401 aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag agttcctgat
    26461 cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct gtttggaact ttaattttag
    26521 ccatggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct taaaaagctc cttgaacaat
    26581 ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg tcttctacaa tttgcctatg
    26641 ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt cctctggctg ttatggccag
    26701 taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc accggtggaa
    26761 ttgctatcgc aatggcttgt cttgtaggct tgatgtggct cagctacttc attgcttctt
    26821 tcagactgtt tgcgcgtacg cgttccatgt ggtcattcaa tccagaaact aacattcttc
    26881 tcaacgtgcc actccatggc actattctga ccagaccgct tctagaaagt gaactcgtaa
    26941 tcggagctgt gatccttcgt ggacatcttc gtattgctgg acaccatcta ggacgctgtg
    27001 acatcaagga cctgcctaaa gaaatcactg ttgctacatc acgaacgctt tcttattaca
    27061 aattgggagc ttcgcagcgt gtagcaggtg actcaggttt tgctgcatac agtcgctaca
    27121 ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc
    27181 ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag
    27241 atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata
    27301 aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat
    27361 gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg
    27421 ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta
    27481 cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta
    27541 gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac
    27601 ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga
    27661 caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt
    27721 ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact
    27781 tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt
    27841 ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat
    27901 ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac
    27961 agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt
    28021 ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg
    28081 atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct
    28141 gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt
    28201 cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa
    28261 cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac
    28321 gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg
    28381 atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct
    28441 cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac
    28501 caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg
    28561 tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg
    28621 gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga
    28681 gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc
    28741 aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag
    28801 cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa
    28861 ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga
    28921 tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg
    28981 taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa
    29041 gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag
    29101 acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac
    29161 tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg
    29221 aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc
    29281 catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca
    29341 tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc
    29401 tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc
    29461 tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc
    29521 aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc
    29581 ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc
    29641 acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta
    29701 gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt
    29761 acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat
    29821 tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa
    29881 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa

CDC(Centers for Disease Control and Prevention)

最近安倍総理大臣もこの言葉を覚えた模様で「日本版CDC」をというような使い方がなされています。業界の人にとっては、ガイドラインを出しているのでその周辺でお目にかかることが多いのではないかと思います。私は、1995年公開の映画「アウトブレイク」で初めて耳にしました。1999年に留学したFDAとは、同じHHSの下部組織、つまりFDAとCDCは組織図上は横並びでした。CDCはどういった仕事をしているのでしょうか？業務は多岐にわたります。CDCの仕事を身近に感じたのは、1999年留学した年に、テレビで「鳥の死骸から西ナイルウイルスが検出された」という発表でした。米国には鳥の死骸のウイルス検査をしている行政機関があることに驚きました。その後ニューヨークでは夜間にヘリコプターで住宅街に殺虫剤をまくというプロジェクトが放送されていました。夜間に殺虫剤をまくので窓を閉めて寝るようにという放送がされていました。テレビの放送によると、「人体には無害な殺虫剤をまくが、念のため窓を閉めておくように」という事でした。

次に私が目にしたのは、FDAのCBERと共同してワクチンの副反応を集めて集計している業務です。パピローマウイルスワクチン、いわゆる「子宮頸がんワクチン」を知り合いたちと集計したのを覚えています。当時日本では上市前でしたが、すでに上市されていた米国のデータではStill病のような副反応が報告されているという内容でした。

サーベイランスのアルゴリズム

そして今回の新型コロナウイルス肺炎の騒ぎで、伝染病のサーベイランスと結果次第では早めの対応を日本でもできるようにという事で、「日本版CDC」をという議論が出てきているのだろうと思います。ただ、良く判らないのがその機能を担う機関が日本に全くないのかというとそういう訳でもないように思います。それは、さておき感染症のサーベイランスはどんな風にデータを評価しているのか少し調べてみました。Getting started with outbreak detection　（アウトブレイクを検出することから始めよう）という論文によるとCDC algorithmという手法があります。新たに発症した症例数を週ごとに集計して、過去の発症例数と比較して変動の範囲を超えて感染者が増加した場合に、そのシグナルを検出する手法です。どんなふうになるのか、論理的な事や数式が出てきて良く判らなくなるよりは、実際のCOVID-19の日本のデータ（3月10日までの集計）を流し込んでどういったアウトプットが得られるのか、ながめてみることにしました。

とりあえず結果です

図はFarringtonアルゴリズムの出力です。四角い柱で1日ごとの度数が表示されています。右端のピークが3月6日。初めのアラートが1月28日（3例報告の日）。

実は、CDCが感染の流行をモニターしているアルゴリズムは週ごとのデータしか解析しないということで、今回のような短期のデータを日ごとで集計しようとするとエラーになりました。そこで教科書にCDCのアルゴリズムと列挙されていましたもう一つのアルゴリズム　Farringtonのアルゴリズムで集計してみました。とりあえず、過去50日分の報告件数から、変動の範囲内なのか流行の兆しなのかを計算しているようです。この手法は、日ごろから散発的に報告があるような疾患で、急に増えて流行の兆しではないかというのを早期に発見する目的で使用するのに適している様で、COVID-19の様に全く新しい疾患に対しては、この手法は向いていないように思いました。残念。

A statistical algorithm for the early detection of outbreaks of infectious disease, Farrington, C.P.,Andrews, N.J, Beale A.D. and Catchpole, M.A. (1996), J. R. Statist. Soc. A, 159, 547-563.

https://www.jstor.org/stable/2983331?seq=1

library(“surveillance”)
library(readxl)

X0020_STS <- read_excel(“COVID_STS.xlsx”)

CovidDisProg <- create.disProg(week = X0020_STS$week,
observed = X0020_STS$observed,
state = X0020_STS$state,
start = c(2018, 1),
freq=365,
epochAsDate=TRUE)

#Do surveillance for the last 50 days.
n <- length(CovidDisProg$observed)
#Set control parameters.
control <- list(b=2,w=3,range=(n-50):n,reweight=TRUE, verbose=FALSE,alpha=0.01)
res <- algo.farrington(CovidDisProg,control=control)
#Plot the result.
plot(res,disease=”COVID-19″,method=”Farrington”)

# sts.cdc <- algo.cdc(CovidDisProg, control = control)
# <<<error>>> algo.cdc only works for weekly data.
# plot(sts.cdc, legend.opts=NULL)

使用した集計済ファイル

https://gis.jag-japan.com/covid19jp/?fbclid=IwAR3FWAcLkQvXDTUUMtNwm7qRFhplIxSREML5m-rrPXWzfz7IxVANOBdSeSY

COVID_STS

1 ファイル 32.72 KB

ダウンロード

COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2のMproというタンパク質の構造がPDBに公開されていました。エントリは6LU7。PDBの解説の書き方からすると、このウイルスのタンパク質で他にも構造が決定されている分子があるけれども、（無料で無条件に）公開されているのはこれだけだという様に取れます＊１。新しいものを発見したとして、その知財を囲い込んで自分達の金儲けにするというのは20世紀的なアメリカンドリームであって、ものが不足していた頃の考え方で時代遅れでないかと。発見したもので社会の様々な問題を解決したり、世の中を良くする様にというような考え方が広がらないかなぁ。それはさておき、タンパク質の発現にバキュロと昆虫細胞を使った系が多い中、このタンパク質は私が慣れ親しんだBL21(DE3)で発現しています。公開されたものを見てみましょう。（レンダリングは私がしましたが、構造はPDB 6LU7を使用しています）

＊１　その後多くの構造が公開されています。ACE2とウイルスのタンパク質の結合についてを別記事に追加しました。(2020.04.11)

SARS-CoV-2コロナウイルス3CLヒドロラーゼ（Mpro）のタンパク質で、登録された構造全体（1分子分）を表示しています。Mpro（白）以外にオリゴペプチド様の阻害薬（薄紫）が一緒に含まれています。

阻害薬付近が見えやすいように薄切り(Slab)にしてみます。

両分子間で水素結合がありそうなところを見やすい表示にしてみました。ちゃんとはまり込んでいるような感じになっています。

PDB newsによると、「PDBアーカイブのエントリーと比較すると、少なくとも90%の配列相同性を持つ蛋白質が95件のPDBエントリーで同定されました。さらに、これらの関連蛋白質構造には、約30個の異なる低分子阻害薬が含まれており、新薬の発見に役立つ可能性があります。」とのこと。それらの阻害薬は治療薬の開発の出発点になるかもしれません。

はじめに

Self-controlled case series (SCCS) の解析方法を試しはじめてしばらく時間が経過しました。その間に、このSCCSを計算するためのRのパッケージが開発されていまして、一見したところ便利そうです。とりあえず、ご多分に漏れず、このパッケージを利用して、過去にやった方法や論文¹と同じ結果が得られるのか試してみました。

まずはインストール

install("SCCS")

適切なサーバーを選択してインストールが完了するのを待ちます。

読み込みます

library("SCCS")

オックスフォード伯爵のマーチ

以前Observation Islandで試したoxfordデータが，このパッケージではamdatという名前で含まれています。どんな内容か確認してみます。

amdat
   case sta end  am mmr
1     1 366 730 398 458
2     2 366 730 399 750
3     3 366 730 413 392
4     4 366 730 449 429
5     5 366 730 455 433
6     6 366 730 472 432
7     7 366 730 474 395
8     8 366 730 485 470
9     9 366 730 524 496
10   10 366 730 700 428

以前使用したoxfordデータは次の通りです

良く似ているけど微妙に調整が必要そうです

観察の開始日

前回試したoxfordデータでは開始日が365でした。このパッケージのamdatでは366に。うるう年にかかってしまったかな？などと思うのも良いのですが、とりあえず同じデータで開始したいので、試行する間はパラメータを投入する際にこの部分を前回と同じになるように調整。具体的にはスクリプトでパラメータを与える際に、

astart=sta

と与えるべきところを

astart=sta-1

にして調整しました。

症例２のMMR接種日が前回と違う

前回試したoxfordデータでは症例10の接種日は716日目だったのが、今回パッケージ附属のamdatでは同じ症例が「症例２」になっていて，接種日が750日目になっていました。とりあえずここも、前回に合わせておきたいので

amdat[2,5] <- 716

とやります。なんだか、細かい質の部分に齟齬が残っているな。

スクリプト

上記2点の調整を含むスクリプトは次のようになります。

library("SCCS")

amdat[2,5] <- 716
am.mod2 <- standardsccs(event~mmr+age, indiv=case, astart=sta-1,
aend=end, aevent=am, adrug=mmr, aedrug=mmr+35,
expogrp=15, agegrp=547, data=amdat)
am.mod2

実行結果

解りにくいかもしれませんが、mmrのオッズ比が12.037 (95%CI, 3.00226, 48.259)となりました。

次に示すのが論文で掲載された結果です。今回の集計結果と論文の結果で、小数点以下2桁くらいまでは一致しています。誤差範囲と考えられますので、今回試したRのSCCSパッケージが思ったように機能することが確認できました。投入する前のデータさえきちんとしていたら、使えそうだという印象を持ちました。

reference

耐性ウイルス

新規インフルエンザ治療薬に耐性を持つというウイルスが、その新規治療薬を使用した患者さんから検出されたという事で、2018.1.25にニュースが流れました。その治療薬は、キャップ依存性エンドヌクレアーゼ (cap-dependent endonuclease) 阻害薬で、一般名バロキサビルマルボキシル (baloxavir marboxil) と呼ばれる医薬品です。ニュースではどういった検査をして「耐性」を確定したかは述べられていませんでした。ソースの情報によるとターゲット分子であるキャップ依存性エンドヌクレアーゼの変異であるPA I38T、I38F等を監視していることが述べられています。これらの変異はNCBIのデータベースに以前より存在していますので、普通に世の中にいるウイルスが持っていた変異だろうと思われます。そして、治験時には10％弱の被験者にこの変異が見られました。治験の情報によりますと、この変異を持っているウイルスにかかった被験者では、治療5日目、9日目にウイルスが検出された割合が野生型のウイルスにかかった被験者より高くなりました。¹

この治験データで少し目に留まるのは、プラセボ治療群より変異ウイルスに対する実薬治療群の方がウイルスが検出される被験者の割合が高くなる様に見える点です。力価のグラフを見ていると、耐性ウイルスは一旦力価が低下した後、6日目あたりに再び力価が上昇するようなカーブを描いて見えます。これらのデータが、臨床的に深刻な問題なのかは何とも言えません。詳しく知りたい方は原著¹や販売メーカーの資材を見てご検討ください。

PAに耐性変異があると医薬品が全くPAと相互作用しないのか？

PA分子の結晶構造が公開されています²ので、これを利用し耐性のメカニズムに迫る。とか言うたいそうな話ではなく、とりあえず眺めてみました。黄色がbaloxavir acidです。（医薬品のbaloxavir marboxilとは、若干構造が違います）青が活性中心付近に側鎖を出しているアミノ酸残基。そして、ピンクが変異がある場所です。

野生型構造

PA I38T の耐性を有する構造

I38Tの変異があっても、作用点にbaloxavir acidが一見きちんとハマっているようです。水素結合を作っているであろう原子間の距離が微妙に違うので、ファンデルワールス力が違い、結合の強さに差が出るのかもしれません。科学的に厳密なディスカッションは、論文²をご確認ください。

お遊びで、いつもより多めに回してみました。

はじめに

本稿はRのパッケージでdeep learningができると聞いて、ネットで調べながら、パッケージを使う道筋をつけるまでの、忘備録です。サンプルにしたのは、「A薬」で検索した結果と「B薬」で検索した結果を、テキスト形式でA.txt, B.txtとしてPCに保存したうえで、一部を学習用サンプル、残りをテスト用サンプルにして、学習の効果（？）を測定しました。集計に入る前に、ダウンロードしたデータの中の、検索キーワードを削除しました。（←これをしないとさすがに検索キーワードそのものがそれぞれの集団にばっちり入ってしまうので分類の性能が評価できないのではないかと）

はっきり分類しやすいように、今回はAは抗癌薬、Bは免疫神経系疾患治療薬と治療対象の疾患の性質が違うものにしています。検索結果は、Medline形式でダウンロードします。このあたりの手順は、【Rで自然言語処理】を、ほぼそのまま利用しています。（「データ分析系男子」さんありがとうございます。）分類に使用したMXNetの周りのスクリプトは【RのMXNetでirisを分類】を、ほぼそのまま利用しています（「なんとなくなDeveloper」さんありがとうございます。）

{mxnet}パッケージのインストール

とりあえずこのパッケージのインストールです。インストール方法は、他の日本語のサイトの説明通りでは、なぜかうまくゆきません。一応以下の流れでインストールできました。他のパッケージは特に苦労することなくinstall.packages()でインストールできました。

# first add the repo
drat::addRepo(“dmlc”)
# either install just one or more given packages
install.packages(“xgboost”)

cran <- getOption(“repos”)
cran[“dmlc”] <- “https://s3-us-west-2.amazonaws.com/apache-mxnet/R/CRAN/”
options(repos = cran)
install.packages(“mxnet”)

---

MedLine検索と保管

検索キーワードは普通に入力して検索すればよいのですが、あまりたくさんの文献があっても取り回しが悪いので今回は検索対象を今年出版の文献としました。またアブストラクトで分類しますので、アブストラクトが入力されている英語の文献に絞って出力するようにしました。

保存に当たっては、send toからFile-Medline形式を選択しました。

Medline読み込み

setwd(“C:/Users/Oshima/Documents/2018/R deep learning/TXT/”)

## define function
medline <- function(file_name){
lines <- readLines(file_name)
medline_records <- list()
key <- 0
record <- 0
for(line in lines){
header <- sub(” {1,20}”, “”, substring(line, 1, 4))
value <- sub(“^.{6}”, “”, line)
if(header == “” & value == “”){
next
}
else if(header == “PMID”){
record = record + 1
medline_records[[record]] <- list()
medline_records[[record]][header] <- value
}
else if(header == “” & value != “”){
medline_records[[record]][key] <- paste(medline_records[[record]][key], value)
}
else{
key <- header
if(is.null(medline_records[[record]][key][[1]])){
medline_records[[record]][key] <- value
}
else {
medline_records[[record]][key] <- paste(medline_records[[record]][key], value, sep=”;”)
}
}
}
return(medline_records)
}

## read Medline
fileVec <- list.files(file.path(getwd()),
pattern=”.txt”,
full.names = T)
categoryVec <- list.files(file.path(getwd()),
pattern=”.txt”)
dataMed <- lapply(fileVec,medline)

## exstract Title, Abstract and CategoryVec
dataMedList <- lapply(seq(1,length(dataMed)),function(x){
res <- lapply(seq(1,length(dataMed[[x]])),function(y){
out <- data.frame(title=dataMed[[x]][[y]]$TI,
abst=dataMed[[x]][[y]]$AB,
category=categoryVec[x])
return(out)
# return(x)
})
return(do.call(rbind,res))
# return(y)
})

dataMedDF <- do.call(rbind,dataMedList)

データの前処理

dataMH <- sapply(dataMed,function(i){
sapply(i,function(x){
if(all(!(names(x) %in% “MH”))){
strMH <- c()
}else{
strMH <- strsplit(x$MH,”;”)
}
strMHgsub <- gsub(” “,”_”,strMH[[1]])
strMHpaste <- paste(strMHgsub,collapse = ” “)
return(strMHpaste)
})
})

トピック頻度のデータフレームを作成しました。ここでは、上述のサイトに倣ってk=20でやっています。

library(textmineR)
library(text2vec)
library(tm)
library(topicmodels)

# create vector of abstracts
allTexts <- sapply(dataMed,function(i){
sapply(i,function(x){
ti <- gsub(“\\[|\\]”,””,x$TI)
if(all(!(names(x) %in% “MH”))){
strMH <- c()
}else{
strMH <- strsplit(x$MH,”;”)
}
strMHgsub <- gsub(” “,”_”,strMH[[1]])
strMHpaste <- paste(strMHgsub,collapse = ” “)
paste(ti,x$AB,strMHpaste,collapse=” “)
})
})

allTexts <- unlist(allTexts)

# preprocess
sw <- c(“i”, “me”, “my”, “myself”, “we”, “our”, “ours”,
“ourselves”, “you”, “your”, “yours”, tm:::stopwords(“English”))
preText <- tolower(allTexts)
preText <- tm::removePunctuation(preText)
preText <- tm::removeWords(preText,sw)
preText <- tm::removeNumbers(preText)
preText <- tm::stemDocument(preText, language = “english”)

# tokenize(split into single words)
it <- itoken(preText,
preprocess_function = tolower,
tokenizer = word_tokenizer)
#, ids = abstID)

# delete stopwords and build vocablary
vocab <- create_vocabulary(it,
stopwords = sw)

# word vectorize
vectorizer <- vocab_vectorizer(vocab)

# create DTM
dtm <- create_dtm(it, vectorizer)
# Term frecency
TDF <- TermDocFreq(dtm)

# modeling by package “topicmodels”
model <- LDA(dtm, control=list(seed=37464847),k = 20, method = “Gibbs”)

termsDF <- get_terms(model,100)
topicProbability <- data.frame(model@gamma,dataMedDF$category)

今回は学習用サンプルを80%, 評価用サンプルを20%にして、分けました。

train_size <- 0.8
n <- nrow(topicProbability)
perm <- sample(n, size=round(n * train_size))

# data for training
train <- topicProbability[perm, ]

# data for test
test <- topicProbability[-perm, ]

# imput data for training
train.x <- data.matrix(train[1:20])

# label for training
train.y <- as.numeric(train$dataMedDF.category) -1

# imput data for test
test.x <- data.matrix(test[1:20])

# label for test
test.y <- as.numeric(test$dataMedDF.category) -1

以上データの前処理でした。

階層型ニューラルネットワーク

データの前処理が終わりましたので、ここからがいわゆる機械学習の処理になります。iris記事に倣って、本稿でも次のようにしています。

‘tanh’, ‘relu’とはなんぞや、というのは解らない。「フリーランスのプログラマ」さんによると、「結論から言うとReluを使おう」なのだそうです。

# deep learning

library(mxnet)
mx.set.seed(0)

# 学習
model <- mx.mlp(train.x, train.y,
hidden_node = 5,
out_node = 2,
num.round = 100,
learning.rate = 0.1,
array.batch.size = 10,
activation = ‘relu’,
array.layout = ‘rowmajor’,
eval.metric = mx.metric.accuracy)

# 評価
pred <- predict(model, test.x, array.layout = ‘rowmajor’)

# 評価用データの分類結果（0, 1）
pred.y <- max.col(t(pred)) -1

# 評価データの正解の割合を算出
acc <- sum(pred.y == test.y) / length(pred.y)

print(acc)

結果

次の通り97.1% (95%CI; 92.6 – 99.2) の割合で正解に分類できました。

機械学習的な何か

はじめに

その昔、2001年~2007年にかけて、遺伝子発現解析をやっていた頃、SVM (support vector machine)やNeural Networkを使用していました。肝臓由来の細胞に対し肝臓関連の副作用が知られている医薬品と、そうでない医薬品を曝露して、曝露後の遺伝子発現のパターンを見て、医薬品の肝毒性をin vitroで予測する、実験モデルを組み立てようとしていました。あまり、基礎的な経験のない中であれこれ考えても打開策が見つからず、また今思えば、根本的なデザインに無理があったようでもあり、結局なかなかよい出力が得られなかった苦い経験でした。

今回は基礎体力をつける意味で、インターネット上ですでにうまくいっているようなデータやスクリプトを基に自分なりに試してみます。正解があるものをトレースするのは、良い練習になります。

ナイーブベイズ分類器

今回試したのは、「ナイーブベイズ分類器」というものです。なぜこれを試すかと言うと、良い資料を見つけたからです。その資料を基に、試してみたという記事もあるようです。ざっと見たところ、数式でクラクラするのを我慢すると、何をやっているのかおぼろげながら見えてきます。あるカテゴリで相対的に高い頻度で出現する単語を指標にモデルを構築することになるようです。

スクリプト

機能する仕組みは使いながら考えるとして、スクリプトは次のようになります。全くリンク先の資料通りでは本当に芸がなさすぎるので、ちょっとだけ変えてみました。サンプルとしては、森鴎外と夏目漱石の作品を見分けるという課題で、MeCabのサイトで配布されているもの、を学習用の文章として、あとは青空文庫から「草枕」「こころ」（以上漱石）「花子」「あそび」（以上鴎外）をテスト用文章として、用いました。なお、青空文庫の文章はルビがうるさいので、delruby.exeを用いて処理したものでテストしました。

ルビの処理の様子（MS-DOSのコマンドプロンプトから）

delruby asobi.txt > ogai_asobi.txt
delruby hanako.txt > ogai_hanako.txt
delruby kokoro.txt > soseki_kokoro.txt
delruby kusamakura.txt > soseki_kusamakura.txt

これらの出力ファイルとMeCabのサイトから入手したデータをまとめて、setｗｄで指定したディレクトリの下の/data/writers/の下に置いて、次を実行しました。

 

library(RMeCab)

# data is downloaded from
# shift JIS
# http://web.ias.tokushima-u.ac.jp/linguistik/RMeCab/data.zip
# UTF8
# http://web.ias.tokushima-u.ac.jp/linguistik/RMeCab/data.tar.gz

# indicate data folder
setwd(“C:/Users/Oshima/Documents/2018/R MeCab/”)

# convert text files to vector
d <- t(docMatrix2(“data/writers”))

myNaiveBayes <- function(x, y) {
lev <- levels(y) #1
# term frequency in each category
ctf <- sapply(lev, function(label) colSums(x[y == label,])) #2
# term probability in each category smoothed using Laplace smoothing
ctp <- t(t(ctf + 1) / (colSums(ctf) + nrow(ctf))) #3
# number of each class documents
nc <- table(y, dnn = NULL) #4
# class prior
cp <- nc / sum(nc) #5
structure(list(lev = lev, cp = cp, ctp = ctp), class = “myNaiveBayes”) #6
}

predict.myNaiveBayes <- function(model, x) {
prob <- apply(x, 1, function(x) colSums(log(model$ctp) * x)) #7
prob <- prob + log(as.numeric(model$cp)) #8
level <- apply(prob, 2, which.max) #9
model$lev[level] #10!!
}

train.index <- c(1:2, 5:9, 11)
y <- factor(sub(“^([a-z]*?)_.*”, “\\1”, rownames(d), perl = TRUE))
# y; c(“ogai”, “soseki”)

model <- myNaiveBayes(d[train.index,], y[train.index])
predict(model, d[-train.index,])

ファイルは名前順にソートされますので、テストサンプルは、ogai, ogai, soseki, sosekiの順に出力されれば正解です。

おわりに

とりあえず、正解が得られていますが、これは元のリンク先の方の功績でしょう。正確な方法で他の手法と比較して実行時間を測定した訳ではないので印象なのすが、この手法は学習がかなり速いです。いずれにしても、とりあえずこのスクリプトの使い方は理解できたぞ。