■研究法	│エピジェネティックス epigenetics│ 　←→　神経幹細胞/関連遺伝子/タンパク/発生/遺伝子導入/細胞周期/エピゲノム治療薬 　　参考 1/2

• エピ：後成的
• DNAの塩基配列によらない遺伝子発現調節制御
• DNAのプロモーター領域やそれを取り巻くヒストンの化学的修飾によって、DNA塩基配列の違いに依存しない遺伝子発現の多様性を生み出す機構
• クロマチンへの後天的な修飾により遺伝子発現が制御されることに起因する遺伝学あるいは分子生物学の研究分野
• ヒストンやDNA自身が化学的修飾を受けることなどにより、遺伝子発現がさまざまに制御されている。
• DNAの塩基配列情報をゲノムと呼ぶのに対し、そのゲノムに施されたそれ以外の情報をエピゲノムと呼ぶ。
• DNAはヒストンというタンパクに巻きつけられて圧縮されて核内に収納されているが、そのDNAやヒストンにメチル化・アセチル化という修飾が入り、これによりDNA上のどの遺伝子が動き出すかの制御が行われる。
• 「DNA配列の変化によらずに、遺伝子発現を活性化させたり上活性化させたりする仕組み」の総称
• ゲノムの塩基配列に規定されないエピジェネティックな修飾は、個体の発生や分化の過程において時間的・空間的に厳格な遺伝子発現の制御を行ううえで重要な役割を果たしている。
• 遺伝子がどう働くか、どう病気を発症させるかを説明する新しい学問で、がんのような深刻な病気の診断と治療に大きく貢献する可能性を秘めている。
• epigeneticの語源は、17〜18世紀の生物学の中心思想である個体発生の前成説（preformation）に対する後成説（エピジェネシス epigenesis）からきている。前成説によると生物は最初から潜在的に存在した性質が展開されて個体になるとされ、後成説によると生物は発生の過程で順次、内的および外的な影響を受けて個体になるとされた。

  1942年	Conrad Hal Waddington（1905/11/8〜1975/9/29, Edinburgh大学動物遺伝学研究所教授）は「エピジェネティクス」を「表現型を取り込む環境と遺伝子との相互作用」であると定義した。つまり後成説をエピジェネティクスとして提唱した。Waddington博士は獲得形質が遺伝すると主張する学者の一人であり、彼の哲学的な概念は「Waddington's epigenetic landscape」として現在の最先端のエピジェネティックス研究者の間でも支持され続けている。（受精卵を斜面から転がり落ちるボールに例えて、正常な発生の過程で受精卵は決して元の状態に戻ることはなく、またほかの細胞に転換することもない。）
  1958年	David Nanneyがエピジェネティクスを、体細胞分裂と減数分裂において伝達されうる遺伝子機能の多様性のうち、DNA配列の違いによって説明できないものについての研究と定義した。
  1996	Arthur D. Riggsは「DNA配列の変化では説明できない体細胞分裂および/または減数分裂に伴う遺伝子機能における遺伝的な変化の研究」
  2007年	Adrian Birdはエピジェネティクスを「活動状態変化を記録し、伝え、永続させるような、染色体領域の構造的な順応」と定義している。
  2009年	Shelley L. Bergerらは「エピジェネテックな形質とは、DNA塩基配列の変更を伴わない染色体の変化に起因する安定した遺伝性の表現型を示すもの」とした。

  
  
  
  1. DNA塩基のメチル化による遺伝子発現の変化
  2. ヒストンの化学修飾による遺伝子発現の変化（ヒストンのメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化など）
  
  

  DNAメチル化 DNA methylation　←→DNA脱メチル化/メチル化解析/ヒストンメチル化 DNAのメチル化修飾：遺伝子のコードするアミノ酸配列情報を変えることなくその発現を制御すること DNAのメチル化とは多くの場合、DNAに含まれるシトシン5位の炭素（C）に、メチル基（CH3-）を付加して、5-メチルシトシン（5mC）とすること 多くはゲノムDNAのシトシンとグアニンのホスホジエステル結合（CpG配列）が連続している部分の、シトシン塩基（C）の5位炭素原子がメチル基（CH3）に置き換わる。 ある領域のCpG配列の多くにメチル化が生じている状態を高メチル化 hypermethylation、逆を低メチル化 hypomethylation 状態と言う。 DNAのメチル化により、遺伝子の発現が抑制されると考えられていて、生物の体を形作るためには必須である。 真核生物の遺伝子のプロモーター領域に多く見られる5'‐CG‐3'配列は「CpGアイランド」と呼ばれ、このシトシンの5'の位置にメチル基が付加されると、プロモーターは活性を失い、その遺伝子の転写は抑制される。プロモーター領域にCpGアイランドを持つ遺伝子の多くは、組織細胞普遍的に発現しているハウスキーピング遺伝子により偏っていることが知られている。 シトシンのピリミジン環の5位炭素原子や、アデニンのプリン環の6位窒素原子への、メチル基の付加反応 DNAメチルトランスフェラーゼ；DNMTがCpGジヌクレオチドのシトシン5位の炭素にメチル基を付加して、5-メチルシトシン（5mC）とすることによって起こる。 DNAメチル化反応は、S－アデノシル－L－メチオニン（SAM）から，細胞内のDNMTの活性により引き起こされる。 通常CpGアイランドがメチル化されると遺伝子の転写が抑制される。 遺伝子発現におけるDNAメチル化の寄与として、遺伝子プロモーター中のシトシンがメチル化されると遺伝子発現が抑制されることが知られている。このメカニズムは大きく二つに分けられ，一つは転写因子の結合配列中のCpG配列がメチル化された結果、転写因子のプロモーターへの結合が妨げられる機構、もう一つはMeCP2などに代表されるメチル化DNA結合タンパク質がメチル化されたDNA配列に結合し、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）などのリプレッサー因子をリクルートすることで遺伝子発現を抑制する機構である。 DNAメチル化は細胞の分化や老化、がん化などに重要な働きを持つ。 CpGジヌクレオチド　CpG dinucleotides　←→CpGアイランド/ジヌクレオチド C19H26N8O13P2 ヒトゲノムにおいてCpGジヌクレオチドの出現頻度が高くない。 CpGジヌクレオチドは次々にTpGジヌクレオチドへと変異する。 メチルシトシン　Methylcytosine：mC　←→バイサルファイトシーケンス法 5-メチルシトシン　5-Methylcytosine：5mC DNA塩基の一つであるシトシンがメチル化されたもの DNAメチルトランスフェラーゼ：DNMTがCpGジヌクレオチドのシトシン5位の炭素にメチル基を付加して、5mCになる。 シトシンがメチル化されると、転写過程に変化はないが遺伝子発現に変化：エピジェネティクス変化がじる。 5mCはヌクレオシドに取り込まれて5-メチルシチジンとなる。 5mCでは、メチル基は六員環の5位の炭素原子に付加される。このメチル基はシトシンと5mCとを区別する特徴である。 シトシンがメチル化を受けるとメチル化シトシンに特異的に結合するタンパク質（methyl-CpG-binding proteins：MBP）などの働きにより、遺伝子発現の抑制や、染色体の不活化が起こる。 シトシン5位の修飾 高等動物のゲノム上のシトシン―グアニンと続くCG配列のシトシンC5位は可逆的にメチル化修飾を受ける。 ヒトを含めた哺乳類のゲノムDNAでは5′-CpG-3′の2塩基配列のシトシンが5位炭素原子においてメチル化修飾を受けることが知られている。 シトシンC5位のメチル化はDNMTにより修飾される。 脱メチル化経路は未だ不明であり、現在2つの塩基除去修復経路を介した脱メチル化経路が考えられている。 メチル化シトシン：5mCが脱アミノ化されチミン（T）に変換され、MBD4（Methyl-CpG-binding domain protein 4）およびTDG（Thymine DNA glycosylase）がG:Tミスマッチ塩基対を認識しチミン塩基を除去する経路 TETタンパクがメチル化シトシン（5mC）をヒドロキシメチル化（5hmC）：ホルミル化（5fC）：カルボキシル化シトシン（5caC）へと次々に酸化し、TDGがホルミル化シトシン（5fC）とカルボキシル化シトシン（5caC）塩基を除去する経路 発生過程とは、DNAのメチル化が進行する過程である。DNAメチル化は正常な発生に必須である。 DNA複製直後は、新生鎖はメチル化されていないため、DNA二重鎖は両方メチル化された状態から、半分メチル化（ヘミメチル化）された状態になる。 胚性幹細胞では、非CpGメチル化が多い。 特定の領域の遺伝子がメチル化されていると、その領域からの遺伝子発現が抑制される。 DNAメチル化は遺伝子発現の抑制やゲノム安定性の維持に必須である。 DNAメチル化は長期的に遺伝子をサイレンシングするための一種の記憶として機能している。 細胞が持つDNAには全ての遺伝情報が書き込まれているが、細胞ごとの特徴に応じて必要な情報だけが読み込まれ、必要でない情報は働かないように隠されている。DNAのメチル化は、上必要な遺伝情報を隠す機能を担うエピジェネティック機構の１つだが、この遺伝情報が必要になった時には脱メチル化が起きる。　←等先生の研究から DNAのメチル化には、新たにメチル基を導入する「新規メチル化」と、DNA複製に伴ってそれを維持する「維持メチル化」の2種類がある。 新規メチル化 de novo methylation Dnmt3aおよびDnmt3bは新規メチル化に機能する。 維持メチル化 manintenance methylation 細胞のDNA複製サイクルの後も、DNAメチル化が保存されるために必要 Dnmt1は維持メチル化に機能する。 Dnmt１によって常に両鎖がメチル化されているように維持される。 DNAメチル基転移酵素　DNA Methyltransferase：DNMT　　←→TET1 全てのDNAメチルトランスフェラーゼに共通の、10個の配列モチーフを全て含んでいる。 現在DNAのメチル化酵素として、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt2，Dnmt3lの5つが確認されている。 Dnmt1 DNA複製時、娘鎖にDNAメチル化様式を複製するために必要な、維持メチル化トランスフェラーゼ メチル化されていないDNAよりも、すでに片側の鋳型がメチル化されている（ヘミメチル化）DNAを積極的にメチル化させる性質を持つことから、DNA複製時にゲノム各領域のメチル化状態を維持するために働くと考えられる。 Dnmt2 tRNA（シトシン-5-）- メチルトランスフェラーゼ（TRDMT1 ） DNMT2はDNAをメチル化せず、代わりにアスパラギン酸tRNAのアンチコドンループに存在する、シトシン-38をメチル化する。 ヒトとマウスにおいて、Dnmt２のDNAのメチル化活性はほとんど確認できない。 Dnmt3 Dnmt3aとDnmt3b；発生初期にDNAメチル化様式を形成する、DNAメチル化 de novo メチルトランスフェラーゼ Dnmt3Lは、その他のDnmt3タンパク質と相同性があるが、触媒活性を持他ない。代わりに、Dnmt3Lは、de novo メチルトランスフェラーゼのDNAへの結合能を高め、活性を刺激することで、これらの酵素を補助する。 デシタビン　Decitabine ＝ 5-アザ-2'-デオキシシチジン　5-aza-2’-deoxycytidine：5-aza-dC ピリミジンヌクレオシドアナログ DNAメチル化阻害薬、DNMTを標的とするエピゲノム治療薬 DNAを構成するシトシンと化学構造が似ていて、シトシンの代わりにDNAの中に入り込むことで、DNMTによるメチル化を阻害する作用をもつ。この作用によって、がん抑制遺伝子の異常な高メチル化がほぐれて、がん抑制遺伝子が正しくはたらくようになり、治療効果が出ると考えられている。 細胞株を5-aza-dC 1〜5μM程度の濃度で培養する。5-aza-dCがDNA鎖に取込まれた後、DNMTに非可逆的に結合し、その活性を阻害する結果、DNAの脱メチル化が促進する。プロモーター領域CpGアイランドの脱メチル化によりサイレンシングされていた遺伝子の発現が回復する。 近年骨髄異形成症候群（MDS）において、DNAの高メチル化の病態への関与が示され、メチル化阻害薬であるデシタビンが注目されている。FDA2006年承認、日本phase I II 類似のアザシチジン/VidazaはFDA2004年、日本2011年承認

  
  
  
• がんなどの様々な疾患でDNAのメチル化修飾の異常が観察され、疾患と関連があることが報告されている。遺伝子プロモーター領域のメチル化による遺伝子発現の不活化は、発がんの重要な機構と考えられている。
• 長期記憶の形成にも関与
  
  

  O6-methylguanine DNA-methyltransferase：MGMT MGMTはDNA 修復酵素：DNA 中のguanine の O6からアルキル基を除去することによって、アルキル化剤から細胞を保護している。 アルキル化剤はDNA 中のguanine をアルキル化し O6-methyl-guanine（O6-meG）を形成する。O6－meG はDNA 複製の際，チミン（thymine）とミスマッチを形成、細胞はmismatch repair（MMR）system を介して、チミンを除去するが、O6-meG が存在する限り、再びチミンとミスマッチを形成し、このサイクルを繰り返していくうちに細胞死に至る。 腫瘍の遺伝子解析による予後因子に関する報告において、DNA修復酵素O6—MGMTをコードするMGMT遺伝子のプロモーター領域メチル化と予後との相関が挙げられる。MGMTはDNAアルキル化薬（ニトロソウレア系薬剤、DNAメチル化薬）によるDNA修飾を修復する酵素であるが，その遺伝子のプロモーター領域にCpGアイランドがあり、ここがメチル化されるとタンパク発現が抑制される。　* アルキル化剤による腫瘍細胞の殺細胞作用を阻害する。 神経膠芽腫に標準的に使用されるアルキル化剤テモゾロミドの抗腫瘍メカニズムの一つであると考えられている。

  
  

DNA脱メチル化　DNA demethylation　←→DNAメチル化/メチル化解析

• メチル化されたシトシンからメチル基をはずすことにより、サイレントだった遺伝子を働かせる機構
• Tetタンパク質ファミリーはDNA脱メチル化酵素として機能する可能性がある。Gadd45Gが直接Rループに結合し、TET1を動員することによって局所的なDNAの脱メチル化を仲介する。
• 等先生らは、脳ができていく一番最初の過程でDNAの脱メチル化が必要なこと、そしてDNA脱メチル化にGcmが必須であることを初めて証明した。
  　Gcm遺伝子のノックアウトマウスでは、DNAの脱メチル化が起きないためにHes5遺伝子が活性化されず、その結果として神経幹細胞が形成がされない。　[PubMed/参考1/2]
  
• DNA脱メチル化には受動的な機構と能動的な機構とが存在する。

  受動的なDNA脱メチル化 passive DNA demethylation ゲノムの複製に依存して起こるDNA脱メチル化 DNAが複製される時、親鎖側のメチル基を娘鎖側にコピーする「維持メチル化」が起こらないことにより、娘鎖DNAにシトシンが取り込まれ5-メチルシトシンが減少するものである。 細胞分裂時にゲノムが複製されると、新規に生合成されたDNA鎖は当初はメチル化されていないが、DNAメチルトランスフェラーゼDnmt1の働きにより鋳型となったDNA鎖のメチル化の状態を反映してすみやかにDNAメチル化されていく。 Dnmt1のはたらきが抑制されると新規に生合成されたDNA鎖のメチル化は低下するため、数回の細胞分裂の後にDNAは脱メチル化された状態になる。

  能動的なDNA脱メチル化　active DNA demethylation ゲノムの複製なしに起こるDNA脱メチル化 受精直後の精子ゲノム、始原生殖細胞のゲノムや細胞分化後の一部の遺伝子プロモーターでこのようなDNA脱メチル化が観察されている。 早期胚の細胞ではDNAがメチル化されているが、マウスの胎生7.5~8.5日にGcm遺伝子がNotchシグナルの標的であるHes5遺伝子のプロモーターを脱メチル化すると、Notchシグナルが伝わるようになり、神経幹細胞が誘導される。この脱メチル化は能動的脱メチル化である。 提唱されている有力なモデル：メチルシトシンがAID/Apobec1などのデアミナーゼの作用でチミンに変換され、その結果、相補DNA鎖とG::Tミスマッチ状態になる。 このミスマッチのチミンがMBD4やTDGのはたらきで除去され、DNA修復機能によりもとのシトシンになることでDNAが脱メチル化されるという説 しかしすべての能動的なDNA脱メチル化がこの分子機構で起こっているのか、ほかの分子機構があるのかはわかっていない。 TETは能動的DNA脱メチル化機構において、脱メチル化酵素として働くタンパク質 Gadd45-Aが直接Rループに結合し、TET1を動員することによって局所的なDNA脱メチル化を仲介する。

  
  
  

  細胞記憶　cell memory　←→記憶　参考1/2 各細胞の「その細胞らしさ」を決めている情報。細胞分裂を経ても維持される（＝記憶される）。遺伝情報を設計図と見なすなら、細胞記憶は設計図のどの部分を読むか、すなわち遺伝子の発現パターンを決めている。 DNAメチル化パターンは、細胞が分裂しても親細胞から娘細胞へと正確に受け継がれていくため、細胞固有の性質を記録している「細胞記憶」の一つと考えられている。 高等生物では、各器官・組織へと分化した細胞が、それぞれの役割に応じて正常に機能する必要がある。各組織構成の基盤となっている多能性幹細胞ひとつひとつは、自己の遺伝子発現プロファイルの変化を「記憶」しながら、次第にその終末的姿へと分化してゆく。 多細胞生物の各細胞における個々の遺伝子発現パターンの差異は細胞分裂を経ても維持され（細胞記憶）、細胞分裂停止後もその記憶は長期に渡り維持される必要がある。この細胞の「記憶」が何らかの原因で破綻すれば生物体は甚大な障害に直面するので、生物はその進化の過程において、この「記憶」を整理し、維持してゆくためのシステムを獲得したものと考えられている。

  
  
  

  DNAアルキル化　alkylation　←→アルキル化薬 アルキル化とは、一般には置換反応または付加反応により化合物にアルキル基を導入する化学反応の総称である。広義には反応形式としてアルキル基が置換される反応も含める。 アルキル基　alkyl group アルカン（メタン系炭化水素）から水素原子一個を除いた残りの原子団の総称 脂肪族飽和炭化水素から水素原子1個を除いた残りの炭化水素基の総称 炭素原子数3以上のものでは，同じ炭化水素から取除かれる水素原子の位置により，構造の異なった別種のアルキル基ができる。 たとえばプロパンからは n -プロピル基 CH3CH2CH2－ とイソプロピル基 (CH3)2CH－ とができる。前者の末端 CH2－ のC を第一級炭素原子といい、後者の末端 CH－ のC を第二級炭素原子という。 アルキル基はがん細胞などのDNAに結合しDNAの複製を阻害する作用をあらわす。またアルキル基が結合した状態で細胞が分裂や増殖を続けようとするとDNAの破壊がおこり、細胞はアポトーシスを起こす。これらの作用により、アルキル化薬は抗腫瘍効果をあらわす殺細胞性抗がん薬となる。 DNA のアルキル化は全ての塩基で起こり細胞毒性を示す。その主なアルキル化傷害の一つにグアニンの６位がメチル化されて生じるO6-メチルグアニン (O6-meG) があり、それは塩基誤対合やアポトーシスを引き起こすことが知られている。この傷害塩基を修復するために、ほとんど全ての生物種がO6-alkylguanine-DNA alkyltransferase (AGT) という酵素を持っている．この酵素は自身の活性部位のシステイン残基側鎖へアルキル基を転移させることによりDNA 中のO6-meG 傷害を直接的にグアニンへ修復する。

  
  
  

  ヒストン histone　参考1 生体内のゲノムDNAは、ヒストンというタンパク質に巻きついた状態でコンパクトに折り畳まれた状態で存在し、このような構造をクロマチンと呼ぶ。 非常に長い分子であるDNAを核内に収納する役割を担う。 ヒストンはDNAに結合するタンパク質の大部分を占め、ヒストンとDNAの分子量比はほぼ1:1である。 ヒストンとDNAの相互作用は遺伝子発現の最初の段階である転写に大きな影響を及ぼす。古細菌のヒストン様タンパク質を含める場合もある。 DNAはヒストン八量体（ヒストンオクタマー）に1.75回巻きつくことで、ヌクレオソーム構造をとっている。 コアヒストンはH2A、H2B、H3、H4の4種類に分類される。それぞれ2分子ずつ集まり、ヒストン八量体を形成する。 ヒストンは強い塩基性のタンパク質であり、酸性の DNA との高い親和性を示す。 ヒストンテールのリジンやアスパラギン残基はアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化といった化学修飾を受けることが知られている。 ヒストンH1　histone H1 リンカーヒストン：ヒストンH1はコアヒストンとは異なり、ヌクレオソーム間のDNA（リンカーDNA）に結合する。 コアヒストンをほどけないように留めている。 ヌクレオソーム構造およびクロマチンの高次構造の安定化への関与が知られている。 鳥類にはヒストンH5?が存在する。 コアヒストン　core histone DNAが直接巻き付くヒストン八量体を構成する以下のヒストンの総称 C末端側には安定なヒストン八量体を形成するのに必要なフォールドドメイン、N末端側には特定の二次構造を持たないテールドメインという2つのドメインを持つ。テールドメインは細胞内で様々な翻訳後修飾を受ける。 ヒストンH2A　histone H2A コアヒストンのひとつ ヒストンH2Bと複合体を形成する。 ヒストンH2B　histone H2B ヒストンH2Aと複合体を形成する。 monoubiquitylated histone H2B：H2Bub 　←→モノユビキチン化 Bre1＝RNF20はヒストンH2Bをモノユビキチン化する。 ヒストンH3　histone H3 ヒストンH3の末端は自由度が高く、メチル化やアセチル化、リン酸化といった化学修飾によって細胞の増殖などの情報の伝達に関与する。 ヒストンH3の4、9、27、36、79番目のリジン残基に翻訳後修飾としてメチル化が行われることが知られている。 コエンザイムAの不足が起こると、ヒストンH3が胆汁酸によって修飾され、本来の修飾が進行せず大腸がんの発症の原因となることが示唆されている。 ヒストンH4　histone H4 ヒストンH4の20番目のリジン残基のメチル化は、染色体の凝縮やDNA修復応答、DNA複製や遺伝子発現などの機能を制御する。 ヒストンテール　histon tail ヒストンのコア領域に含まれないN末端・C末端側の領域 ヒストンのアセチル化およびメチル化を多く受ける部位のN末端 遺伝子の転写や発現に重要な役割を演じる。 テールドメインは細胞内で様々な翻訳後修飾を受ける。

  ヒストン・アセチル化 histone acetylation　←→ヒストン脱アセチル化 核内タンパクであるヒストンにヒストンアセチル基転移酵素によってアセチル基が付く現象 ヒストンはアセチル化されることでヒストン中の特定のリジン残基のアミノ基（-NH2（-NH3+））をアセトアミド（-NHCOCH3）に変換することにより電荷を中和し、ヒストン-DNA間の結合を部分的に弱める。これにより、DNA鎖に対して転写因子やRNAポリメラーゼIIがより結合しやすい状態になり、結果として転写が活性化される。 ヒストンアセチル基転移酵素 histone acetyltransferase：HAT　←→HDAC ヒストンをアセチルを転移する酵素 ヒストン尾部にアセチル基を付加することで、ヒストンの陽電荷を減少させ、陰に荷電しているDNAとの相互作用を弱めることでクロマチン構造を脱凝縮した状態にし、転写の活性化を促進する。 代表的なHATとして、CBP/p300（CREB binding protein）やPCAF（p300/CBP-associated factor）などが存在する。 ヒストンがHATによりアセチル化された状態ではヒストン-DNA間の結合が緩むことで、転写因子やRNAポリメラーゼIIの結合が可能となり、転写は活性化される。 HATは大きく二つのタイプに分類される。 　Ａタイプ：主に核内に存在し、転写と相関したアセチル化を制御している。 　Ｂタイプ：細胞質に存在し、新規に合成されたヒストンを核内に輸送する時に、決められたリジン残基をアセチル化する。 ヒストン・アセチル化の亢進はクロマチン構造を緩やかな形に導くため、転写因子のゲノムへの結合が容易となり、遺伝子の転写が促進されることに。 長期記憶の形成にも関与 記憶の消去には海馬ーInfralimbic回路のヒストンのアセチル化が関与

  ヒストン・脱アセチル化　←→ヒストンアセチル化/HDAC阻害薬 HDACによって、ヒストンからアセチル基が取り除かれる反応 ヒストン脱アセチル化酵素 histone deacetylase：HDAC　←→HDAC阻害薬 転写抑制因子とコリプレッサーと複合体をつくり、ターゲット遺伝子上のヒストンを脱アセチル化する酵素 HDACは大きく分類するとクラスI，IIになり、クラスIIに属するHDAC6などは核内でなく細胞内に発現して、遺伝子の転写ではなく細胞のタンパクのアセチル化による機能制御に関連している。 ヒストンの脱アセチル化は凝縮したクロマチン形成を促進し転写が抑制される。 HDACによりヒストンが脱アセチル化されると、転写因子、RNAポリメラーゼIIが結合できないため転写は抑制される。 ヒトでは18種類のHDACが同定され、アミノ酸配列の相同性から3つのサブクラスに分類される。 バルプロ酸はHDAC阻害剤でもある。

  ヒストン・メチル化 histone methylation　←→DNAメチル化 ヒストンのメチル化は主にリジン残基にみられ、ヒストンH3ではK4、K9、K27、K36、K79が、ヒストンH4ではK20がメチル化されることが知られている。 ヒストンのメチル化の数は1〜3つ（mono〜tri）存在し、またそれぞれリン酸化される残基の位置によって転写の活性化に関与するものと抑制に関与するものが存在する。一般的にH3K4、K36、K79は転写活性化に関与し、H3K9、K27、H4K20は転写抑制に関与している。 リジン残基だけでなくアルギニン残基もメチル化され、転写制御に関わることが報告されている。 ヒストン・メチルトランスフェラーゼ　Histone methyltransferase：HMT ヒストンリジンメチル基転移酵素　lysine methyltransferase：KMT （リジンの1文字表記は、Lでなくて、K） 補助因子である S-アデノシルメチオニン（S-adenosylmethionine; SAM）の活性メチル基を供与体として、ターゲットとなるヒストンのリジン残基またはアルギニン残基をメチル化する。 リジンに特異的なヒストン・メチル化酵素には数多くの種類があり、またいくつかのグループに分類される。 Su(var)3-9, Enhancer of zeste, Trithorax（SET）ドメイン構造を持ち、ヒストン・テールをメチル化する酵素 SET ドメイン構造を持たず、コアをメチル化する酵素 ヒストン脱メチル化酵素　Histone demethylase：HDM　←→DNMT/TET1 ヒストンリジン脱メチル化酵素　lysine demethylase：KDM ヒストンのメチル化リシン残基を脱メチル化する反応を触媒する酵素で、エピジェネティックに遺伝子の発現を制御している。 LSD1とJHDM の二つのファミリーに分類される。LSD1およびJHDMのアイソザイムのいくつかは、がんなどの病態に関与することも報告されていて、次世代エピジェネティックドラッグとして期待されている。 フラビン依存的脱メチル化酵素　lysine-specific demethylase：LSD H3K4のジメチル体とモノメチル体の脱メチル化反応を触媒し、エピジェネティックに遺伝子発現を制御している。 LSDのアイソザイムの１つである LSD１は種々のがん細胞において、その増殖に関与していて、抗がん剤の創薬標的としても研究されている。 十文字ドメイン含有ヒストン脱メチル化酵素 Jumonji Domain-containing Histone Demethylase：JHDM, Jmjd jumonji 1995年に竹内 隆博士（三菱化学生命科学研究所→鳥取大学医学部教授）が見つけた成育が異常なマウスの原因遺伝子 神経管（将来の脳）の形状が「十文字」（漢字の「十」）に見えたことから、「jumonji」と命名した。 十文字ドメイン　Jumonji domain Jumonjiタンパク質に見つかったドメイン その後多くのタンパク質で類似の構造が見つかり、それらの大部分がヒストンの脱メチル化酵素活性をもつことがわかってきた。 Jumonji domain-containing 1a（Jmjd1a）は十文字ドメインC（JmjCドメイン）を持つヒストンの脱メチル化酵素 Fe2+およびα-ケトグルタル酸依存的脱メチル化酵素　←→αKG依存型ジオキシゲナーゼ メチル化されたヒストンのリジン残基を脱メチル化する酵素で、発がん遺伝子Mdm2、がん抑制遺伝子p53の遺伝子発現制御に関与する。 鈴木、宮田らによって開発されたNCDM-32bは生体内での加水分解によりエステル部位のメチル基が外れたNCDM-32となり、JHDMのひとつであるJMJD2Cの阻害活性を示す。 LSD1阻害剤と組み合わせることで、大腸がん由来のHCT116細胞の増殖を阻害する。 ヒストン H3 脱メチル化酵素　Histone H3 demethylase ヒストン H3・脱メチル化酵素は次の 2 種類に分類される。 モノメチル化およびジメチル化されたアミノ酸残基を脱メチル化する、フラビン・アデニン・ジヌクレオチド（FAD）依存性アミン・オキシダーゼ（Lysine-specific demethylase（LSD）ファミリーなど）。 モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化されたアミノ酸残基を脱メチル化する、Fe（II） and α-ketoglutarate 依存性ジオキシゲナーゼ（Jumonji C（JmjC）ドメイン・ファミリーなど

  ヒストン・ユビキチン化　ubiquitination ユビキチンのC末端カルボキシル基（COOH末端）と基質のリジン残基のε-アミノ基が縮合して結合することをユビキチン化と呼ぶ。 このペプチド結合は主鎖ペプチド結合に対し枝分かれしている側鎖構造でイソペプチド結合という。ただし種々の脱ユビキチン化酵素によりはずされる可逆的結合である。 タンパク質修飾の一種で、ユビキチンリガーゼなどの働きによりユビキチンタンパク質がイソペプチド結合で基質タンパク質に付加される。 多くの場合ユビキチン自身もさらにイソペプチド結合により重合し、ポリユビキチン鎖を形成する。 ユビキチン化のユニークな点は、リン酸化などの修飾系にはみられない修飾が多重におこりうるという点である。ユビキチン自身もタンパク質のため、ユビキチン上のリジン基にもさらに別のユビキチンが結合することができ点これをポリユビキチン化と呼ぶ。 ユビキチン化には、ユビキチンが1個だけ結合する場合（モノユビキチン化）と、ユビキチンにさらにユビキチンが結合して鎖状に連なる場合（ポリユビキチン化）がある。 モノユビキチン化　monoubiquitination ターゲットタンパク質は、1つのリジンに対して1つのユビキチンが結合する。 Bre1＝RNF20はヒストンH2Bをモノユビキチン化する。　←→H2Bub マルチユビキチン化　multiubiquitination 多数のリジンに1つのユビキチンが結合する。 ポリユビキチン化　polyubiquitination 最初にタンパク質のリジンに結合したユビキチンが連続してユビキチン化されてユビキチン鎖となる。 ポリユビキチン修飾されたタンパク質はプロテアソームにより認識されタンパク質分解を受ける。 近年ユビキチン修飾がタンパク質分解以外にも、エンドサイトーシス・DNA修復・翻訳調節・シグナル伝達などさまざまな生命現象に関わる。 ユビキチン修飾系は1978年にエネルギー依存的タンパク質分解系の一部として発見されたタンパク質翻訳後修飾系であり、細胞周期・シグナル伝達・転写調節など数多くの生命現象を制御している。 ユビキチン ubiquitin　←→ユビキチン陽性封入体　参考1 ユビキチンは76個のアミノ酸（約8kDa）からなるタンパク質で、酵母からヒトまで普遍的に存在する進化的には保守的なタンパク質である。 至る所にある (ubiquitous) ことからこの名前がついた。 ユビキチンは「分解シグナル」としての役割が集中的に解析された。なかでも細胞周期進行に必須なことで生命科学の表舞台にでた。現在ではアポトーシス、免疫、シグナル伝達、転写調節、DNA修復、膜通行メンブラントラフィックなどにも必須の役割を果たしていることが明らかになっている。 ユビキチンはユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、ユビキチンリガーゼ（ユビキチンにより標識されたタンパク質をプロテアソームで分解する系はユビキチン―プロテアソーム系と呼ばれ、細胞周期制御、免疫応答、シグナル伝達といった細胞中の様々な働きに関わる機構である。 ユビキチンは細胞内タンパク質に鎖状に共有結合し、その機能や寿命を制御する翻訳後修飾因子の一つであり、物理的・化学的に極めて安定なタンパク質として有名である。 脳内凝集体の多くは共通して、ユビキチンを含むことが確認されているが、なぜユビキチンが細胞内で凝集体を形成するのかは解明されていない。 ユビキチンはポリマー（ポリユビキチン鎖）を形成することにより熱力学的に不安定化し、アミロイド様線維を含む凝集体を形成する。また、これらの凝集体形成は細胞内でも観察でき、形成したユビキチン含有凝集体はオートファジーと呼ばれる分解機構で除去される。 Aaron Ciechanover、Avram Hershko、Irwin Roseの3人が「ユビキチンを介したタンパク質分解の発見」の功績により2004年ノーベル化学賞を受賞した。 プロテアソーム proteasome　←→プロテオーム タンパク質の分解を行う巨大な酵素複合体 プロテアソームは全ての真核生物と古細菌に存在する。真核生物の細胞において、細胞質および核内のいずれにも分布している。 ATP駆動型のタンパク質分解活性を有する巨大酵素複合体 ポリユビキチン標識されたタンパク質を分解する。 細胞周期制御、免疫応答、シグナル伝達といったさまざまな細胞機能に関与する。 活性型の26Sプロテアームは、タンパク質分解実行ユニットである20Sプロテアソームの両端に、それを制御する19S 複合体が２つ結合した巨大複合体（分子量250万、サブユニットタンパク質数約100個）。 小胞体に蓄積したミスフォールドタンパク質は、小胞体から細胞質に逆輸送されて、細胞質のプロテアソームによって分解される。この機構はERAD (ER associated degradation) と呼ばれている。 ユビキチン―プロテアソーム系 ubiquitin-proteasome system：UPS　←→タンパク質の品質管理 不要なタンパク質を選択的に分解するシステム。分解すべきタンパク質にはユビキチンという目印タンパク質がつけられ、これをプロテアソームという大型のタンパク質分解装置が認識して分解する。 ユビキチン―プロテアソーム系はタンパク質に付加されたユビキチン鎖をプロテアソームが認識し、ATP依存的で、迅速かつ不可逆に標的タンパク質を分解するシステム 標的タンパク質へのユビキチン付加反応はユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、ユビキチンリガーゼ（E3）によって行われる。 この系は不要タンパク質の分解、抗原提示、細胞周期調節など重要な役割を果たしていて、この系の異常はがんや感染症などの発症に関与すると考えられている。 分裂を止めていた細胞が休止期から増殖を開始すると、まずサイクリンDが発現する。サイクリンDとCDK4/6複合体がRbタンパクをリン酸化して不活化して、E2F転写因子をRbタンパクから解放する。解放されたE2FがS期サイクリンであるサイクリンEなどの転写を促進して、S期への進行をすすめる。増殖シグナルがなくなると、サイクリンがユビキチン・プロテアソーム系で分解され、細胞周期が停止する。 c-Mycの発現は増殖細胞においては低く、またユビキチン・プロテアソーム経路によって速やかに分解されることから、その半減期は30分間程度と、極端に短い。 UPSは、オートファジー・リソソーム・パスウェイ：ALPと単一のネットワークを構成している。UPSが処理能力に追われたり、機能が抑制されるとALPは代わりに異常タンパク質を除去する。ALPはUPSとは対照的に傾向としてはタンパク質複合体、オリゴマー、凝集体など高分子の物質を分解することができる。 ゲルダナマイシン：GMは、がん細胞においてATPがHSP90に結合するのを妨ぎ、その結果Hsp90と誤って折りたたまれたタンパク質の複合体が蓄積される。そしてユビキチン―プロテアソーム系が刺激されてタンパク質複合体が破壊され、最終的には成長を制御している信号伝達経路が破壊されてがん細胞は死滅する。 ユビキチンはユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、ユビキチンリガーゼ（E3）の3種類の酵素が連続的に作用することにより、標的タンパク質に共有結合する。 まずユビキチンはATP依存的にE1へ転移し、そのC末端はE1のSH2基とジスルフィド結合し活性化され、高エネルギー状態となる。 その活性化を保ったまま、ユビキチンはE1から結合/転移酵素（E2）に移動する。 　ユビキチンとE2の結合はE2のシステイン残基を介したエステル結合である。 最後に連結酵素/ リガーゼ（E3）の働きによりユビキチンは基質へと受け渡される。 E3はE1,2に比較し桁違いの多様性をもち、E3が基質の特異性を決定するユビキチン化鍵因子と推察される。 E1：2種類 E2：40種類 E3：600種類 ユビキチン活性化酵素　ubiquitin activating enzyme：E1 enzyme 分子量：約110kDaの単量体 すべての真核生物において1種類だけ存在する。 ATP依存的にユビキチンC末端のGly76のカルボキシル基とE1の活性中心Cys 残基との間に高エネルギーチオエステル結合を形成する。 ユビキチン結合酵素 ubiquitin-conjugating enzyme：E2 enzyme、ubiquitin-carrier enzymes E1によって活性化されたユビキチンは、その活性中心のCys 残基にE1からユビキチンが転移され、E1と同様にチオエステル結合を形成する。 E2は出芽酵母で13種、ヒトでは約30種存在する。 分子量：約15~30K 　→Parkin ユビキチン転移酵素、ユビキチンリガーゼ　ubiquitin ligase：E3 enzyme　←→リガーゼ ユビキチンと結合したE2はE3の活性中心と結合し、ユビキチンはE3と結合している標的タンパク質のLys残基と結合する。 E3はその活性中心の特徴から、HECT型E3、RING型E3、Uボックス型E3に大別できる。 Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus：HECT型E3ユビキチンリガーゼ HECT型E3はユビキチンとE2を結合するHECTドメインと、基質と結合するタンパク質-タンパク質結合ドメインが存在し、HECTドメインを介してユビキチンを基質へ転移させる。 HECT型E3ユビキチンタンパク質リガーゼのC末端にある、分子量約40 kDa（350アミノ酸残基）の触媒ドメインである。 このドメインは、特異的なE2 酵素に結合し、E2 からユビキチンを受け取ってHECT 活性型システインとユビキチン-チオエステル中間体を形成する。そして、基質のリジンのε-アミノ基、あるいはポリユビキチン鎖の伸長側の末端にユビキチンを転移する。ユビキチンのチオエステル中間体の形成はHECT E3 リガーゼに独特で、他の型のE3リガーゼにはみられない。 HECT型は全体5%であり、28種類のHECT型がある。 →後期促進複合体　anaphase-promoting complex：APC/C really interesting new gene：RING型E3ユビキチンリガーゼ　←→　RING フィンガードメイン/RNF20 ユビキチンとは直接結合せず、ユビキチンを結合した特異的なE2をリクルートし、かつ、ユビキチン化されるべき基質タンパク質を特異的に結合する。 RING-finger型E3は数が多く、細胞周期制御や発がんなどに重要な役割を果たす。 RING-finger型E3には単量体型と、Cullin型E3とよばれるような複合体を形成する一群がある。 E3はE2と標的タンパク質の両方に結合し、両者を近傍配置することで、ユビキチンのE2から標的タンパク質への移動を触媒する。 SCF複合体型ユビキチンリガーゼ　SCF ubiquitin ligase complex 　＝cullin ring ubiquitin ligase：CRL SCFユビキチンリガーゼ複合体は、真核生物の重要な調節タンパク質を適切な時期に分解させる役割を担う。 構成成分としてSkp1、Cul1、F-Boxタンパク質をもつのでSCF複合体という。 Cul1は足場タンパク質として機能し、RINGフィンガータンパク質Rbx１、アダプタータンパク質Skp１、基質認識サブユニットFボックスタンパク質を会合させ、SCF複合体を構築する。 不要になったタンパク質に目印としてユビキチンを多数つけるユビキチンリガーゼの一種 後期促進複合体：APC/Cは活性化サブユニットで、11から13のサブユニットからなるタンパク質で、Cullinサブユニット（Apc2）とRINGサブユニット（Apc11）といった、SCF複合体と類似した触媒サブユニットが含まれている。 ユビキチンをつける標的タンパク質の認識に関与するFボックスタンパク質は多数種存在し（ヒトでは約60種）、多数の標的タンパク質に対応できる。 Cullin1を含むSkp1-Cul1-FboxよりなるSCFはCRL1と、Cullin4を含むCul4-DDB1の場合はCRL4と呼ばれる。 S期キナーゼ関連タンパク質1　S-phase kinase-associated protein 1：Skp1 約160アミノ酸からなる小タンパク アダプタータンパク質 26Sプロテアソームよるタンパク質分解を媒介するSCF型E3ユビキチンリガーゼのコアコンポーネントとして、Skp1は細胞周期の進行、転写調節、シグナル伝達、真核生物における多くの細胞プロセスに重要な役割を果たす。 Cul1、Cullin 1 Cullinファミリー由来の 遺伝子 タンパク質分解およびタンパク質ユビキチン化において重要な役割を果たす。 Cul1は長い柄と球状ドメインからなる引き伸ばした形のタンパク質である。 Cul1は足場タンパク質として機能する。 Cullinサブユニット（Apc2）は、後期促進複合体：APC/Cの触媒サブユニット Fボックスタンパク質ファミリー F-Boxタンパク質ファミリーは、タンパク質-タンパク質相互作用部位として機能する約50アミノ酸からなるFボックスモチーフを含むタンパク質 F-Boxタンパク質ファミリーの名前は、最初にFボックスモチーフ（Skp1の結合に必要なアミノ酸約40個からなるドメイン）が見つかった、サイクリンF（Fbxo1ともよばれる）に由来する。 Fボックスドメイン 42-48個の保存されたアミノ酸残基からなるドメインで、FボックスのN末端に見出される。 共通して持つFボックスドメインがSkp1への結合部位として働き、残りの部分でリン酸化された標的タンパクを認識・結合しており、基質結合ドメインは、WD40ドメインを有するFbwファミリー、ロイシンに富むリピートを有するFblファミリー、そのどちらにも属さないFbxファミリーに分けられている。 タンパク質間相互作用モジュールであり、サブユニットCullinと相互作用してユビキチン化酵素であるSCF複合体を形成する。 Skp1との相互作用を媒介するが、これによってF-Boxタンパク質が、Rbx1、cdc53/Cul1、およびE2 接合酵素のcdc34 からなるユビキチンーリガーゼ複合体のコア（核）につながる。 Fボックスタンパク SCFユビキチンリガーゼ複合体を構成するタンパク質成分の一つとして最初に報告された。 基質認識サブユニット リン酸化を介したユビキチン化を行うSCF複合体の内部にあるE3ユビキチンリガーゼアダプタータンパク質のモジュラー（調節器）として作用する。 哺乳類では、少なくとも60種類が存在し、標的タンパクへの基質特異性を決定している。 哺乳類ゲノムには約70のFボックスタンパク質がコードされているが、機能がわかっているものはごく少数である。 3本の-αヘリックスからなるコンパクトなドメインを形成する50残基程度の配列をもつタンパク質 Fボックスタンパク質のC末端部分もまた、標的となる基質としばしばリン酸化依存的に相互作用するさまざまなモジュラードメインから構成される。 β-transducin repeat-containing protein：β-TrCP Fボックスタンパク質の一種 SCF複合体型ユビキチンリガーゼの構成成分としてユビキチン化する標的タンパク質に結合する。 タンパク質リン酸化を指標に結合することが多く、細胞増殖がん化に関与するIκB、βカテニンや細胞周期調節に関わるCdc25、Emi1などのユビキチン化を制御することが知られている。 Wntシグナルオフ状態ではCKIとGSK3βの協調的な作用によってβカテニンが適切なリン酸化を受けると、ユビキチン化と、β-TrCP/SKP複合体を介したプロテアソームによる分解に至り、βカテニンの細胞内レベルは低く保たれている。 U-box型E3ユビキチンリガーゼ RING-finger型E3の亜型 RING-finger型E3は金属をキレートしているが、U-box型E3は金属を構造に必要としない。 RING-finger型E3と同様、E2と標的タンパク質の両方に結合し、両者を近傍配置することで、ユビキチンのE2から標的タンパク質への移動を触媒する。 E3はE1,E2と比較して非常に多くの種類が存在するため、E3がユビキチンの多様な役割を保証する鍵因子であると考えられている。 ユビキチンリガーゼは基質タンパク質のdegronと呼ばれる配列を認識して結合する。 degron 基質タンパク質に存在するタンパク質分解のシグナルとなる固有のアミノ酸配列やそれによって作られる構造 細胞内でのタンパク質分解において、ユビキチンシステムによって認識される、基質タンパク質のアミノ酸配列や構造 Bre1＝RNF20はヒストンH2Bのユビキチンリガーゼ RNF20は転写の際にヒストンH2Bをモノユビキチン化することによりRNAポリメラーゼIIの関与するmRNA伸長反応を促進する。 　→参考（RNF20に依存的なヒストンH2Bのモノユビキチン化の機能） E3ユビキチンリガーゼであるシノビオリンは、その活性が滑膜細胞の増殖及び関節リウマチ（RA）の発症に深く関与している。 キイロショウジョウバエの熱痛覚過敏に関連する遺伝子HighwireもE3ユビキチンリガーゼコードする遺伝子であり、BMPシグナル経路が関与する。 直鎖状ユビキチン鎖 直鎖状ポリユビキチン鎖は刺激依存的なNF-κB活性化に関与すること、その形成不全により、免疫不全、慢性炎症を惹起することを同定した。 NF-κB活性化には多様なポリユビキチン鎖の関与が知られている。

  
  
  

  Notch 1914年 John S.Dexterがキイロシロショウジョウバエ Drosophila melanogasterの羽に羽に切り込み（ノッチ）を持つ変異体を同定した。 1917年に Thomas H, Morganがノッチの遺伝子は劣性の対立形質として特定した。 1980年代 遺伝子産物の生化学的な解析や遺伝子の配列解析は1980年代にSpyros Artvanis-Tsakonas と Michael W. Youngによって独立に行われた。 1983年 Spyros Artvanis-TsakonasがNotchの原因遺伝子をクローニングした。 細胞系譜決定 剛毛の形成では、1つの細胞系譜からシャフト細胞、ソケット細胞、グリア、ニューロンが分化するが、Notchシグナルが欠損するとニューロンのみが分化する。 境界形成 翅の縁でNotchシグナルが働き、背側と腹側の境界をつくる。この過程においてNotchシグナルが欠損すると、その部分にへこみ（Notch）が生じる。 側方抑制　lateral inhibition　参考* 発生過程で細胞の運命決定が行われる時、細胞間シグナル伝達経路を介して隣接する細胞が特定の運命を辿ることを抑制する現象 ハエの感覚毛の基となる細胞はNotchシグナルを介して周囲の細胞が同じ運命を辿ることを抑制することにより、感覚毛と表皮の細胞の運命決定が微調整されている。 ショウジョウバエの腹側神経予定域では、ニューロンに分化する細胞はDeltaリガンドを強く発現し、隣接細胞が発現するNotch受容体を活性化することで、周囲の細胞がニューロンに分化するのを抑制している。 トランス活性化　transactivation　←→トランス因子 遺伝子が他の遺伝子にコードされる転写活性化因子で発現を亢進される現象 隣接細胞からのリガンドとNotch受容体の相互作用を誘導するシグナル伝達経路の活性化（トランス-活性化）、同じ細胞から配位子との相互作用を阻害するシグナル伝達（シス阻害）。トランスとの間の適切なバランス-活性化とcis-抑制は、ノッチは動物の開発時にいくつかのコンテキストにおけるシグナル伝達の最適なレベルを確立するのに役立つ。 転写因子は高度にモジュール化された構造を持つ。転写制御に関与する様々な機能を持った領域（ドメインとも呼ばれる）が、一つの転写因子の中に組み込まれている。各機能領域の配列や数は転写因子によって異なり、シグナル検知とトランス活性化機能は同じ領域に含まれることが多い。 トランス活性化領域　transactivation domain：TAD 他のタンパク質（共役転写調節因子など）と結合するための領域 この部分は「活性化機能（activation functions）」と呼ばれることが多い。 シス阻害　cis-inhibition　←→シス因子　参考* Notchシグナルは細胞間でリガンドと受容体が結合することでシグナルが伝わる。しかし、リガンドと受容体が同一の細胞に共発現していると、リガンドは受容体がシグナルを受けとることを阻害し、受容体はリガンドがシグナルを送ることを阻害する。この阻害をcis-inhibitionという。 24〜29番目のEGFリピートを介して起こる。 EGFリピート4〜6が、Serrateを介するシス阻害に必要 膜貫通型受容体であるNotch受容体が、近傍細胞（シグナルを送る細胞）上に存在するその膜貫通型リガンドの1つと結合することでプロテアーゼによる切断が生じ、膜からNotch細胞内ドメインが放出される。これが核内移行して、シグナルを受容する細胞で標的遺伝子の発現を促進することができる。しかし、同一細胞に存在するリガンドにNotchが結合すると、シグナル伝達は阻害される。 Notchは哺乳類やそのほか多くの多細胞生物に広く保存されている。 ほ乳類には4つのNotch受容体と5つのリガンド（DSLリガンド：Jag1, Jag2, DII1, DII3, DII4）を持つ。 後生動物で進化的に保存された分子機構があり、動物の様々な臓器の発生過程、成体でのホメオスタシス、幹細胞機構、腫瘍形成などに関与している。 発生過程における細胞運命の指定とパターン形成に関与する。 Notchタンパクは細胞膜に結合して、細胞外からの情報を細胞内に伝達する役割を果たす受容体であると考えられている。 試験管内の神経幹細胞でNotchシグナルを活性化すると、ニューロンへの分化が抑えられ、アストロサイト分化が誘導される。 NOTCH遺伝子 Notch遺伝子は局所的な細胞-細胞相互作用を通して細胞の運命を制御する機能をもち、線虫からヒトまで進化的に保存されている。 心血管系においても、多くのNotchシグナル因子（リガンド・受容体・標的因子）が血管に発現し、それらの遺伝子改変動物の多くが血管形成異常を呈する。Jagged1の変異が原因のAlagille症候群とNotch3変異によって起こるCADASIL症候群は血管系の異常を呈し、血管平滑筋の異常がその病因であると考えられている。 ほ乳類に4つのNOTCH遺伝子：NOTCH1、 NOTCH2、 NOTCH3 および NOTCH4があり、それぞれ約50％程度の相同性が認められている。 4種類のNOTCHとも同じリガンドでシグナル伝達が活性化されることから、発現の時期や局在がその機能に深く関係している可能性がある。 NOTCH1はおもに神経細胞や造血細胞の分化を、NOTCH2はグリア系細胞の増殖に関係していることが報告されている。またNOTCH1およびNOTCH2ノックアウトマウスは中胚葉分節形成異常により致死となるが、NOTCH3およびNOTCH4ノックアウトマウスでは発生や形態的異常は認められず正常であるので、NOTCH1およびNOTCH2は胚発生に重要な働きを担っていると考えられる。 ヒトのゲノムにはNOTCH2遺伝子と4つのNOTCH2NL遺伝子が存在する：NOTCH2NLA遺伝子、NOTCH2NLB遺伝子、NOTCH2NLC遺伝子、NOTCH2NLR遺伝子 ヒトに固有なNOTCH遺伝子：NOTCH2NLB遺伝子 　参考１　ヒトに固有なNOTCH2NLB遺伝子はNotchシグナルの制御を介して大脳皮質のニューロンを増加させる@鈴木郁夫先生　Cell. 2018 May 31;173(6):1370-1384.e16 1/2/3 /a/b/c /d/e Notch homolog 2 N-terminal-like：NOTCH2NL NOTCH2NL遺伝子はNOTCH2遺伝子のN末端側の領域ときわめて高い相同性を示す遺伝子として発見された。 ヒト特異的NOTCH2NL遺伝子の３つのパラログはradial gliaに高発現している。 ヒトのゲノムにはNOTCH2遺伝子に加え、NOTCH2NLA遺伝子、NOTCH2NLB遺伝子、NOTCH2NLC遺伝子、NOTCH2NLR遺伝子の4つのNOTCH2NL遺伝子が存在する。 Notchシグナルの受容体をコードするNOTCH2遺伝子は脊椎動物に広く保存されているが、タンパク質をコードするNOTCH2NL遺伝子はヒトにだけ存在することが類人猿のゲノムの比較解析から明らかにされた。 4つのNOTCH2NL遺伝子は完全に同一ではなく少数のアミノ酸置換や欠失があり、もっとも高く発現するNOTCH2NLB遺伝子がもっとも長いタンパク質をコードする。NOTCH2NLBはN末端側から順に、シグナルペプチド、6つのEGFリピート、機能未知の24アミノ酸残基、の3つのドメインから構成される。 このうち、シグナルペプチドおよびEGFリピートはNOTCH2とのあいだにきわめて高い保存性をもち、機能未知の24アミノ酸残基はNOTCH2NL以外のいかなるタンパク質とも配列の類似性はなかった。 脳の発生異常や、統合失調症、自閉症などと関わる染色体領域1q21.1領域に全部で3種類の遺伝子重複で発生した遺伝子が並んでいる。 NOTCH2 N-terminal like B：NOTCH2NLB →Notch homolog 2 N-terminal-like protein B NOTCH2NLB遺伝子はヒト以外の生物種には存在せず、ヒトのゲノムにおいて脳の容積の異常と関連するゲノム領域にコードされている。 オランウータンとゴリラが分離するとき、NOTCH2から重複して、PDE4DIP遺伝子と結合した偽遺伝子として生まれた。その後400万年前、NOTCH2とNOTCH2NL間の組み換えが起こり、偽遺伝子から機能的NOTCH2NLがヒトで発生し、その後２回の遺伝子重複でNOTCH2NLBとNOTCH2NLCが生まれることで、組み替えによる遺伝子変異が起こりやすい遺伝子座ができあがった。 ヒトはチンパンジーと分岐した後に、NOTCH2NLB遺伝子を獲得したことにより、より長期間にわたりニューロンの産生が続くようになり、その結果より多くのニューロンにより構成される大きな大脳皮質を獲得したと考えられた。 ヒトのES細胞は30日で皮質細胞に分化する。培養20日でクローンサイズは倍になり、クローン中の皮質前駆細胞マーカーであるSOX2陽性細胞の割合は減少するが、NOTCH2NLB発現クローンでは3倍になるので、SOX2陽性細胞の割合はそれほど減らない。 NOTCH2NLB遺伝子はヒトの大脳皮質の前駆細胞においてNotchシグナルを活性化することにより、前駆細胞を未分化なまま維持する効果をもつ。30日目にレンチウイルスでNOTCH2NLBをヒトの皮質細胞に過剰発現させ、7日目の免疫組織化学染色では、PAX6陽性細胞（前駆細胞のマーカー）をコントロールよりも増加させたが、βIIItubulin（未成熟ニューロンのマーカー）は増加させなかった。クローンの増幅に対するNOTCH2NLBの効果は自己複製能の亢進によるものである。 NOTCH2NLA/Bは、皮質サイズを爆発的に増加させることと関連するouter radial glia：oRG細胞でも高く発現している。 NOTCH2NLBはN末端側から順に、シグナルペプチド、6つのEGFリピート、機能未知の24アミノ酸残基、の3つのドメインから構成される。NOTCH2NLBはEGF様リピートを介してヒトの皮質前駆細胞の維持を促進させる。 4つのNOTCH2NL遺伝子は完全に同一ではなく少数のアミノ酸置換や欠失があり、もっとも高く発現するNOTCH2NLB遺伝子がもっとも長いタンパク質をコードする。NOTCH2NLBはN末端側から順に、シグナルペプチド、6つのEGF様リピート、機能未知の24アミノ酸残基、の3つのドメインから構成される。 NOTCH2NLBを発現する神経前駆細胞においては，NotchのリガンドであるDLL1の機能が抑制されるためNotchシグナルのレベルが高まり，結果として、ニューロンへの分化が抑制され、前駆細胞として維持される傾向が強まる。 NOTCH2NLA遺伝子、NOTCH2NLB遺伝子、NOTCH2NLC遺伝子は第1染色体の染色体領域1q21.1領域にコードされる。1q21.1領域における重複および欠失は脳の大きさの異常と関連するという複数の報告がある。脳の発生に異常を示すヒトにおいて少なくとも1つのNOTCH2NL遺伝子にコピー数の異常のあり、NOTCH2NL遺伝子が脳の発生に関与する可能性が示唆された。 Notchシグナル伝達系　　参考1/2/3/4 Notchシグナルは、ショウジョウバエから哺乳動物にまで広く保存されたシグナル伝達経路の一つである。このシグナル伝達の特徴は、細胞間の物理的な接触を必要とする近距離間でのシグナル伝達経路である。 Notchシグナル伝達経路は、多細胞生物において進化的に保存された経路で、発生の過程及び幹細胞において細胞の運命の決定を調節する。 Notchシグナル伝達系は細胞間シグナル伝達を担う主要なシグナル伝達系のひとつであり、隣接する細胞のあいだの受容体とリガンドとが相互作用することにより互いの状態を伝達する。 Notch経路は、神経、心臓、免疫及び内分泌系の発生において、多様に整列した細胞の運命が制御される、隣接する細胞間の接触分泌型（Juxtacrine）シグナル伝達を媒介する。 Notchは細胞の表面において隣接する細胞に発現したリガンド（DeltaあるいはSerrate/Jagged）と結合し、続いてタンパク質切断酵素の作用により活性化される。これにより、Notchの細胞内ドメインは切り離されて核へと移行し、コアクチベーターや転写因子と相互作用することにより標的遺伝子の転写を促進する。 個々の神経前駆細胞はリガンドであるDll1（Delta Like 1）と受容体であるNotchをさまざまなレベルで発現する。 となりあう細胞どうしはつねにNotchシグナルをやりとりとし、周囲の細胞よりも高いレベルでNotchシグナルを受容した細胞はニューロンへの分化が抑制され前駆細胞として維持される。NotchシグナルはDLL1の発現を抑制するため、相対的に高いレベルのNotchシグナルを受容した細胞はとなりの細胞へ伝達するNotchシグナルのレベルが低下する。 逆に、DLL1を高く発現する細胞はとなりの細胞へ伝達するNotchシグナルのレベルが上昇するため、結果として、自らが受容するNotchシグナルのレベルが相対的に低下しニューロンへと分化しやすくなる．実験的にDLL1を少数の神経前駆細胞において過剰発現するとニューロンへと分化する傾向が強まり、逆に、DLL1をノックアウトした神経前駆細胞は前駆細胞として維持されやすくなる。 Notchシグナルは神経幹細胞の維持に関わっている。　参考1 神経幹細胞の自己複製能にはNotchシグナルが重要な役割を担っている。 Gcm遺伝子がDNAを脱メチル化させることによって、Hes5遺伝子が動きだし、Notchシグナルを活性化させて、神経幹細胞が生成される。 ゴルジ体膜タンパク質であるRer1をマウスの脳形成時に欠損させると、脳内のγ-セクレターゼが減少することによりNotchシグナルが低下し、神経幹細胞の量が減少する。 Notchシグナル活性の減弱によって成体脳の神経幹細胞が維持できなくなる。 細胞間シグナル伝達を担う主要なシグナル伝達系の一つであり、隣接する細胞間の受容体とリガンドとが相互作用することにより互いの状態を伝達する。 Notchシグナル伝達系は発生においてさまざまな形態形成および臓器形成についての指示を伝達する役割のほか、成体においても幹細胞の維持や分化およびニューロンの機能にかかわる細胞間シグナル伝達において重要な役割を担う。 マウスやヒトの発生期の皮質前駆細胞において、Notchシグナルは自己複製能を促進し、分化を阻害 (Kageyama et al., 2009, Lui et al., 2011)する。 ニューロンが過剰に誕生することから、Notchシグナルは幹細胞からニューロンへの分化を抑え、アストロサイトの分化を促進すると考えられている。 大脳皮質形成においてNotchシグナルが神経細胞の分化と神経幹細胞の維持に関与していることが示されている。 canonicalシグナル伝達経路 Notchシグナルは隣接細胞間における膜タンパク質NotchとDeltaによる相互作用によって伝達されるシグナル伝達経路である。 細胞表面上で起こるNotchリガンド（DeltaやJagged）とNotchとの相互作用によって、Notchタンパク質が細胞膜から切り出される。 Deltaにより活性化されたNotchは膜から切り出され、細胞内ドメイン：NICDが核内へと輸送され、標的遺伝子（Hes遺伝子など）の発現を誘導する。 Notch受容体は細胞外に位置するEGF様リピートでDSLリガンド分子と結合する。 DSLリガンド分子は膜貫通タンパク質であり、細胞表面につなぎ止められていることから、Notchシグナル伝達は隣接する細胞の間で行われる。 リガンド結合に起因するγセクレターゼ切断（S3分離）によってNotch細胞内ドメイン（NICD）は細胞膜から遊離する。 NICDは核へ移行し、DNA結合因子CSLと直接的な結合をする。 CSLはNotchシグナル不活性化（NICD上在化）ではSMRT（転写コリプレッサー）やHDACなどの転写抑制因子とともに働き、下流遺伝子の発現を抑制している。 下流遺伝子の内でbHLHタイプの転写抑制因子Hes1とHes5はニューロン分化を促進する遺伝子群の発現を抑えることが報告されている。 Mib、Neurはユビキチン修飾によりDeltaリガンドの活性制御を行う。 mRNAから翻訳されたNotch受容体タンパク質はFurin様プロテアーゼ（TACE）によって切断（S1分離）され、Fringeによる糖修飾を受けることで機能的に成熟し細胞表面に提示される。 Notchシグナル伝達は細胞分裂前に作用し神経前駆細胞の非対称分裂と細胞運命決定を促す　参考　1 細胞内分子Numbは非対称分裂時に上均一に分配され、Numbを含む娘細胞ではNotch分子のエンドサイトーシスとユビキチン化によってシグナルが抑制される。 ユビキチンリガーゼであるDeltexはショウジョウバエの遺伝学的解析からNumbとは逆にNotchシグナルを正に制御していることが示されている。 Notchは隣り合う細胞に存在するリガンドよりシグナルを受け取ると、その細胞内領域を細胞質中へと切り離し、切り離された細胞内領域（NICD）は核内へ移行し、転写因子CSL (RBPJκ/Su(H))及び転写共役因子Mastermindと三者複合体を形成し、標的遺伝子の転写を活性化する。 参考 隣接する他の細胞の膜に存在する「Delta」や「Jagged」と呼ばれるタンパク質と結合することにより活性化し、細胞内のタンパク質産生を促したり、抑制したりする。 Notch受容体 ほ乳類には4つのNotch受容体と5つのDSLリガンドファミリーを持つ。 1回膜貫通型の膜タンパク質として作られたNotchはFurinという分解酵素によって切断され、二量体として細胞膜上で機能する。 Notch受容体は1回膜貫通型タンパク質で、機能的な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる。 NotchのリガンドのDelta（1回膜貫通型タンパク質）と細胞接触にて結合して、細胞分化や維持に関わっている。 Notch受容体は細胞外に位置するEGF様リピートでDSLリガンド分子と結合する。 Notch受容体は、細胞膜につながれた転写因子として働き、NotchリガンドのDelta、Serrate、Lag-2ファミリーの構成要素によって活性化される。この活性化は、２回連続するタンパク質分解による受容体の切断により起こる。2回目の切断により、Notchの細胞内ドメインが放出され、これが核に移動して転写調節因子のCSLファミリーと相互作用し、Notch標的遺伝子活性化複合体の一部を形成する。 DeltaがNotch受容体に結合すると、NotchはTACE（メタロプロテアーゼ）によって細胞外部分で切断された後、γセクレターゼにより細胞内部分で切断される。 切断されたNotchは自身の持つ核内移行シグナル（NIS）で核へと移行してその作用を示す。 Notch細胞外ドメイン　Notch extracellular domain：NECD Notch受容体は細胞外に位置するEGF様リピートでDSLリガンド分子と結合する。 EGF様リピート　epidermal growth factor (EGF)-like repeats Notch受容体の細胞外領域は36個のEGFドメインがタンデムに並んだリピート構造（EGFリピート）をとっていて、その多くのEGFドメインがO-フコース型修飾を受ける。 Notch受容体の細胞外ドメインには、29〜36個のタンデムにつながったEGFリピートがあり、この領域でリガンドと相互作用する。隣接細胞間とのシグナル伝達（trans-interactions）は、11番目と12番目のEGFリピートによってなされる。 また、同一細胞内におけるリガンド分子との相互作用（cis-inhibition）においては、24〜29番目のEGFリピートを介して起こる。EGFリピートの多くはカルシウムイオンと結合することが知られているが、これらのカルシウムイオンはNotchレセプターの構造やリガンド分子との親和性を制御することによって、シグナル伝達効率を制御していると考えられている。 →膜貫通ドメイン　transmembrane domain：TM, TMD Notch細胞内ドメイン　Notch intracellular domain：NICD Notch分子はDeltaやJaggedと結合すると、γセクレターゼによってNICDが切断され核内へと移行する。 細胞表面上で起こるNotchリガンド（DeltaやJagged）とNotchとの相互作用によって、Notchタンパク質が細胞膜から切り出される。NotchのNICDは、核内へと輸送され、RBPj/CSLなどのDNA結合タンパク質と複合体を作り下流の標的遺伝子の発現を誘導する。 移行したNICDはRBPjやMastermindと複合体を形成し、標的遺伝子の転写を制御する。 抗cleaved Notch1抗体でNICDが染色される。 DSLリガンド Delta/Serrate/LAG-2 Notchの主要なリガンドで、Notchの細胞外ドメインにあるEGF様リピート領域に結合し、Notchホモ二量体の形成に関与する。 DSLリガンド分子は膜貫通タンパク質であり、細胞表面につなぎ止められていることから、Notchシグナル伝達は隣接する細胞の間で行われる。 DSLリガンドはショウジョウバエの Delta/Serrate/LAG-2にその呼称を由来する。 NotchはDeltaとSerrate/Jaggedとを分子的に見分けていて、それには糖転移酵素の一つであるFringeによるNotchの糖鎖修飾が重要な役割をはたしている。 Delta Serrate LAG-2 ヒトにはDelta-like1(Dll1)、Dll2、Dll4と、Jagged1、Jagged2の5つのNotchリガンドが存在する。 Delta-like protein 1：Dll1 Delta Like Canonical Notch Ligand 1 Notch Deltaリガンドのヒトホモログで、DSL（Delta / Serrate / Lag-2）ファミリーに属する。 分子量90〜100 kDaのⅠ型膜貫通糖タンパク質 成長過程および成人組織の形態形成や再形成において重要な働きをする。 E7.5に神経上皮細胞にHes1 およびDll1が発現する。 様々ながんで過剰発現していることが確認されていて、腫瘍形成への関与も示唆されている。 DLL1はNotchファミリーに属する4種類のレセプターを介して活性を示す。これらのレセプターは，他のcanonicalシグナルNotchリガンド（DLL3 / 4, Jagged-1 / 2）に対する応答も仲介する。 DLL1と非カノニカルリガンド（Contactin-1 / Contactin-2, DNER, MAGP-1 / 2, NOV, Pref-1など）とは構造が異なるが、いずれもNotch活性を調節する役割を有す。 成体の脳で神経幹細胞を維持するニッチシグナルである：Dll1を成体脳で人為的に失くすと、神経幹細胞は維持されなくなる。 Dll1は分裂中に偏った局在し、非対称分裂でニューロンに分化する娘細胞に上とされる。Dll1のシグナルは神経幹細胞が分裂後に休眠状態に戻るのにも必要である。　参考 Hes1によるAscl1の抑制がquiescentに関与する。　参考1/2 Delta-llike protein 2：Dll2 Delta-like protein 4：Dll4 Jagged1：Jag1 Jagged2：Jag2 これらのリガンドのほかに、非典型的Notchリガンドと呼ばれ、Notchシグナルにさまざまな様式でかかわるタンパク質の存在も知られている。 これらは、EGF様リピートをもつものともたないもの、膜貫通型、 GPIアンカー型、分泌型と、多様なタンパク質のを含んでいる。 一般に、受け手側の細胞とは別の細胞から（transに）提示されるDSLリガンドはNotchシグナル伝達に促進的に、受け手側の細胞自体から（cisに）提示されるDSLリガンドは抑制的に働くとされる。 CSL：CSL (CBF1/Su(H)/Lag-1) ファミリー転写因子複合体 転写因子複合体 centromere binding factor 1：CBF1 Suppressor of hairless：Su(H) Vertebrate CBF1, fly Su(H) and worm Lag-1 proteins share striking sequence conservation over a central region of 412 amino acids Notchシグナルによる遺伝子発現の制御は、CSL（転写因子）とその共制御因子により行なわれている。 CSLはNotchシグナルに関連する遺伝子発現の抑制と促進を両方とも行なっている。 Notchシグナルがないときには、CSLは標的遺伝子の発現を抑制する。CSLが転写抑制因子と複合体を形成し、DNAの構造を転写が起こりにくい状態に変化させることで引き起こされると考えられている。 RBP-J：Recombining binding protein suppressor of hairless　＝CBF1：centromere binding factor 1　←→CSL DNA結合タンパク質、Notchシグナルの中枢分子 核内へと輸送されたNICDはRBPj/CSLなどのDNA結合タンパク質と複合体を作り下流の標的遺伝子の発現を誘導する。 RBP遺伝子がコードするタンパク ショウジョウバエの遺伝子Suppressor of Hairlessのヒトのホモログ RBP-Jのプロモーター領域は古典的にはNotch1 シグナルに使われる。 Mastermind：Mam 共役因子　コアクチベーター、活性化補助因子 MastermindはNotch細胞内ドメインと、核内でRbp-jと三量体を形成し、標的遺伝子を活性化する。 Mam遺伝子のうちMamL1のヘテロ欠失マウスが、ヒト統合失調症症状の一部を構成するドパミン反応性の亢進を示す。

  Hairy and enhancer of Split：Hesファミリー　参考1 ショウジョウバエにおいて神経分化を抑制する哺乳類相同遺伝子群 hairy and enhancer of splitの頭文字からHESと名付けられた。 hairy ショウジョウバエの発生の間に少なくとも2つの異なる段階で機能するbHLH型転写因子タンパクをコードする：1）体節の形成における primary pair-rule geneとして関与する胚形成期、および　2）成体のハエの感覚毛　sensory bristlesのパターン決定に否定的に機能する幼虫段階に機能する。 proneural gene achaeteの転写を直接抑制する。proneural gene achaeteの異所性発現と剛毛の異所性形成を防止するために、羽と脚のimaginal discsの広い領域において必要とされる。 enhancer of split：Espl bHLH型転写因子 prepattern geneとして、proneural gene achaeteの転写を直接抑制する。 Espl複合体遺伝子の活性化は、胚期と成体の神経新生における速報抑制のプロセスでのNotchシグナルによって活性kされる神経原性遺伝子である。 Espl遺伝子を活性することによって、proneural clustersの大部分の細胞における大量のproneural proteinの蓄積がブロックされ、それによって神経細胞に運命づけることを妨げる。 転写を負に制御する抑制型のbHLH型転写因子であり、多くはNotchシグナルのエフェクターである。ホモあるいはヘテロ二量体を形成して機能する。 Hesは主に分化促進型のbHLH因子を抑制することによって、幹細胞や未分化性細胞の維持に機能していると考えられている。 bHLH、Orange、WRPWの三つのドメインで構成される。 Hesは次の二つの異なるリプレッサー機能がある。 active repression ホモ二量体、あるいは、他の抑制型bHLH転写因子とヘテロ二量体を形成し、ターゲットDNA配列に結合する。WRPWドメインでコリプレッサーであるTLEと結合し、TLEに結合しているヒストン脱アセチル化酵素をリクルートすることによってクロマチン構造変化を引き起こし、ターゲット遺伝子の転写を抑制する。 Transducin-like Enhancer of Split：TLE Passive repression 活性化型のbHLH型転写因子と結合して認識DNA配列への結合を阻害することにより、間接的にターゲット遺伝子の転写を抑制する。例えば、構成的に発現しているbHLH転写因子であるEタンパク質と結合し、認識配列であるE-boxへの結合を阻害する。 ショウジョウバエにおいて神経分化を促進するachate-scute遺伝子のマウスホモログMash1は、Eタンパク質とヘテロダイマーを形成して機能する活性化型の転写因子であるが、HesはEタンパク質との結合によるpassive repressionと、Mash1のプロモーターのclass C siteに直接結合するactive repressionの二つのメカニズムで、二重にMash1の活性を制御している。 Hes1 神経分化における未分化性細胞の維持や分化のタイミングを制御している。 E7.5に神経上皮細胞にHes1およびDll1 が発現する。 神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイト分化を制御する。 古典的なNotchシグナルの標的遺伝子だが、一方で自分自身を標的とするネガティブフィードバック機構により、mRNA およびタンパク質レベルで発現が数時間周期でoscillationする。 Notchシグナル以外に、BMP、FGF、NF-κB、Shh、Wntタンパクにより発現が誘導される。 Hes5 Notchシグナルの標的遺伝子 Hes5遺伝子プロモーター領域のDNA脱メチル化は、ゲノム複製を必要としない能動的DNA脱メチル化 Gcm1およびGcm2によるHes5遺伝子プロモーター領域のDNA脱メチル化がNotchシグナルの活性化に先行し、神経幹細胞の形成に重要である。 脊髄後角にHES5を発現するアストロサイトが局在し（Hes5-CreERT2マウスによる解析）、これらのアストロサイトは青斑核から脊髄に投射する下行性ノルアドレナリン神経で刺激すると、痛覚過敏が生じる。選択的にノルアドレナリン神経シグナルを抑制したマウスでは、カプサイシンによる痛覚過敏反応が顕著に抑制されたことから、これまで痛みを抑える作用が常識であったノルアドレナリン神経に、まったく逆の作用があることがことがわかった。＠津田先生1/2/3 Hes1、Hes3、Hes5は発生期の脳に発現し、神経分化を抑制して神経幹細胞/前駆細胞の増殖、維持に働く。 Hes1、Hes5は放射状グリアの維持に、Hes1、Hes3、Hes5は神経上皮細胞の維持に必須であることが示されている。 Hes1, Hes3, Hes5は発生期の脳の境界構造の維持にも重要である。間脳の前視床と視床を区切る境界構造であるzona limitans intrathalamica：ZLIは、Hes1、Hes5がないと構造自体が失われる。 Hes1、Hes3、Hes5がないと、中脳と後脳の境界構造である峡部：isthmusで、また、神経管の左右を区切る境界構造（背側側の蓋板、腹側側の底板）で、遺伝子発現や構造の異常が生じる。この異常は、これらの領域でHesにより抑制されていた神経分化が昂進することによると考えられる。 Hes1の発現のオシレーション 神経幹細胞においてHes1、Ascl1タンパク質は2〜3時間周期で、Olig2タンパク質は5〜8時間周期で振動発現（オシレーション）している。　参考1 Hes遺伝子の発現は、特徴的なネガティブフィードバックループを形成している。 Hes1、Hes7は自身のプロモーター配列に複数のN-box配列を持っており、自身の転写発現を抑制することができる。しかし、Hes1、Hes7共にmRNA、タンパク質が上安定で速やかに分解されるため、転写抑制が解除される結果、再び発現が誘導される。 この繰り返しによって、Hes1、Hes7の発現は、特徴的な短周期の周期的オシレーションを示すことが報告されており、マウスでは約2時間の周期性を示す。 この周期的な発現パターンは、胚発生の過程において重要な役割を担っていることが分かってきた。 Hes1は神経分化における未分化細胞の維持や分化のタイミングの制御に、Hes7については周期的な体節形成のタイミングを測る時計として機能する。 Hes1については、線維芽細胞での発現振動や、ES細胞での発現振動が報告されており、線維芽細胞では細胞の増殖に、ES細胞では分化の上均一性に寄与している。 神経幹細胞においてHes1タンパク質は2〜3時間周期で振動発現している。 Hes1によるAscl1の抑制がquiescentに関与する　参考1/2 成体脳に内在するquiescentの神経幹細胞ではHes1の発現が持続しているが、Ascl1はHes1によって持続的に抑制されるために発現していない。 ウイルスベクターを用いて休眠状態の神経幹細胞にAscl1を導入すると、成体脳に内在する神経幹細胞を活性化し、神経細胞を産生する。 Hes1の発現が振動するとき（Ascl1の発現も振動）に神経幹細胞は活性化し、持続するとき（Ascl1は発現しない）には神経幹細胞が休眠化する。

■関連 遺伝子/タンパクなど　←→遺伝子/タンパク/増殖因子

Glial cells missing：Gcm　参考1/2/3/4/5/6/Resources ショウジョウバエの神経幹細胞からグリアと神経細胞を分化させるスイッチ遺伝子 細谷俊彦先生、堀田凱樹先生らが1995年に発見した。 等誠司先生ら（当時生理研）は、脳ができていく一番最初の過程でDNA脱メチル化が必要なこと、そしてDNA脱メチル化にGcmが必須であることを初めて証明した。 Gcm1/2遺伝子はNotchシグナルの下流で働くHes5遺伝子のプロモーター領域でDNAを脱メチル化することによりエピジェネティックに遺伝子発現制御を行なっている。 Gcm2：副甲状腺だけに限られて発現する唯一の転写因子　Nature 副甲状腺の発生過程は副甲状腺に特異的に発現する Gcm-2遺伝子によって制御されていて、 Gcm-2 遺伝子を欠いたヒトやマウスでは副甲状腺が欠損して生まれる。 JAK/STAT経路が下流で働く。

Bre1 =　Ring finger protein 20：RNF20　　←→RING フィンガードメイン　参考1 Brefeldin A-sensitivity protein 1 　（Brefeldin A：小胞輸送を特異的に阻害するマクロライド系抗生物質、細胞内タンパク輸送の阻害剤：　Brefeldin Aの存在下で細胞を培養するとゴルジ体へのタンパクの輸送が阻害され、小胞体にタンパクが蓄積する。） RNF20は転写の際にヒストンH2Bをモノユビキチン化することによりRNAポリメラーゼIIの関与するmRNA伸長反応を促進する。 Bre1：C端にring finger domainを持つ、ヒストンH2BのE3ユビキチンリガーゼ ヒトでBre1のホモログのE3はRNF20とRNF40があり、複合体を作る。RNF20がH2Bユビキチンにかかわる。 ヒストンH2Bがモノユビキチン化されると、ヒストンH3の４番目リジン残基のトリメチル化を誘導し、遺伝子発現に対して促進的に働く。 Drosophilaにおいて、Bre1がNotchシグナルを修飾する可能性が指摘されている。 神経幹細胞に気分安定薬を添加すると、Bre1の発現が低下する。 Bre1遺伝子ノックアウトマウスは初期発生に異常が生じ、胎生E3.5までに致死となる。ヘテロノックアウトマウスは正常に出生する。 Bre1は胚期では脳室帯−脳室下帯に、マウスの成体脳では側脳室に局在する。 神経幹細胞の増殖や分化に重要な遺伝子：胎児期の神経幹細胞で人為的にBre1aの発現を低下させると、神経幹細胞の分化が抑制される。分化の抑制にはHes5の活性化も関与している。 マウスE13.5に子宮内電気穿孔法を用いて、神経幹細胞のBre1aの発現を抑制すると、神経幹細胞の分化と、大脳皮質内側から外側への移動が障害される。　→inside-out Bre1aの発現が低下した神経幹細胞では細胞周期が延長して、分裂頻度が低下する。 脊髄のRNF20が関与するヒストンH2Bのモノユビチキチン化はアロディニアに関与するmGluR5の転写を制御する。　*

Krüppel-like factor：KLF　　参考1 Krüppel：ショウジョウバエの形態形成遺伝子 ショウジョウバエ体節構造形成に関連する分節遺伝子（segmentation genes）には３種類ある。　参考1 　→ギャップ遺伝子/ペアルール遺伝子/セグメントポラリティー遺伝 ギャップ遺伝子 gap genes 体節形成に重要な遺伝子 胚を大まかに区分けする働きがある。 Kruppel遺伝子は胸部第１節から腹部第５節までの8節の形成に関与している。 hunchback遺伝子は下唇と胸部３節の形成に関与している。 これらの突然変異体では、該当する体節を欠いた胚が生じる。 ペアルール遺伝子 pair-rule genes ギャップ遺伝子群のはたらきによって大まかに分けられた各部域に体節構造を作り上げることに関与している。 ftz（fushi tarazu）の突然変異によって奇数番の体節を欠いた胚が生じ、eve（even-skipped）遺伝子の突然変異によっては偶数番の体節を欠いた胚が生じる。 hairy（＠HES）はペアルール遺伝子として働くbHLH型転写因子 セグメントポラリティー遺伝子 segment-polarity genes 体節の数は正常だが、それぞれの体節の一部が欠失したり、ミラーイメージのものに置き代わったりする。 gooseberry突然変異体では、それぞれの体節の後半がすぐ直前の体節のミラーイメージになる。 Krüppel-like factor （Krüppel様因子）：KLF：Krüppelに相同性を持つファミリー遺伝子 マウスおよびヒトでは17遺伝子群から構成される。 KLFファミリーはC末端惻にジンクフィンガードメインを有する転写因子として機能している。 KLFファミリーは細胞分化、がん化、生活習慣病など多彩な生理局面に関与 Krüppel-like factor 2： KLF2　参考1 肺の発達、胚赤血球形成、上皮組織の完全性、T細胞の生存能などの様々な生化学プロセスに関与する。 胸腺細胞やT細胞の移動の調節因子として機能する。 Sp1はKlf2およびKlf4の発現を直接に制御している。 Krüppel-like factor 4： KLF4　参考1 iPS細胞誘導に用いられる。 Klf4はYamanaka factors（Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4）の１つ 山中4因子の中でもKlf4は初期胚発生およびES細胞の未分化性維持には必ずしも必須ではない。 Klf4はES細胞の分化を抑制するが、Klf5とは異なり、増殖は抑制的に作用する。 Klf4はLIF非存在下でマウスのES細胞の分化を抑制する。 ES細胞においては特にKlf2，Klf4およびKlf5が重複した機能を持つことにより自己複製能を維持している。 未分化なマウスES細胞では、Klf4だけでなくKlf2、Klf5が高発現しているが、分化に伴って減弱していく。 それぞれ単独のKlf遺伝子ノックダウンでは、未分化性維持に影響はないが，3遺伝子のノックダウンにより未分化性の指標であるアルカリホスファターゼ活性の消失が認められ、未分化性の破綻が示唆された。 KLF4は食道を含む胃腸管の分化状態の上皮細胞で発現している。KLF4は食道上皮分化に不可欠な多くの遺伝子を調節し、食道扁平上皮がんではKLF4の発現が減少している。* Krüppel-like zinc-finger transcription factor 5： KLF5 　=Basic transcription element-binding protein 2：BTEB2 KLF5/BTEB2：ジンクフィンガー型転写因子 C2H2タイプのzinc fingerが3個並ぶチトクロームP 450のCYP1の転写制御研究から同定されていた。 Cyp1a1遺伝子のプロモーター近傍に存在する構成的転写制御に関わるBTEに結合する。 BTEB2/KLF5は血管狭窄、臓器線維化、心肥大、炎症反応、血管新生等の臓器リモデリングに関与する。 KLF5は腸上皮幹細胞から腫瘍が発生するのに必要なスイッチの役割をする分子である。参考1/2 KLF4は食道を含む胃腸管の分化状態の上皮細胞で発現するのに対し、KLF5は食道を含む胃腸管の増殖細胞に見出される。* KLF4とKLF5は多くの場合、細胞増殖に対して対照的な効果を発揮する。KLF4は細胞の増殖を阻害するのに対し、KLF5は増殖を促進する。* KLF4は水痘症を引き起こす。　参考 幹細胞の未分化性維持に働く遺伝子：Klf5ノックアウトES細胞は未分化状態を維持できず分化してしまう。 Klf5は内部細胞塊からのES細胞樹立過程に必須である。Klf5がES細胞の分化を抑制すると同時に増殖を促進することで、ES細胞の自己複製を制御している。一方iPS細胞誘導に用いられるKlf4は、ES細胞の分化を抑制する点に関してはKlf5と同様な機能を有するが、増殖に関しては抑制的に作用する。　* AzamiらはKlf5はFGF4-ERK経路を抑制することで、エピブラストの発生を制御していることを報告した。Klf5を欠損した胚盤胞期胚では､多能性を有するエピブラストが消失している。Klf5KO胚ではエピブラストを分化誘導するFGF4-ERK経路が活性化している。　参考1/2 AzamiらはKlf5 KO胚の内部細胞塊ではNanog陽性細胞が消失しているが、この経路の遮断によりNanog陽性細胞が出現したことに加え、ES細胞を樹立することに成功した。参考1 KLF5遺伝子は、MAPキナーゼカスケードに位置する。 ERK5はSp1を介してKlf2およびKlf4の発現を制御している。参考1 DNA chip解析により、統合失調症死後脳前頭前野において13qに位置するKLF5遺伝子の発現量が減少　参考1/2/3 Krüppel-like zinc-finger protein Gli-similar 1：Glis1 Glis1はiPS細胞の誘導において、がん遺伝子でもある転写因子c-Mycに代わり、Oct3/4、Sox2、Klf4と協調的に細胞の初期化（幹細胞化）を強く促進するが、腫瘍の発現性はない。





myelin proteolipid protein　ミエリン・プロテオリピドタンパク： PLP　参考1 1951年にJordi Folch（1911〜1979, ハーバード大）とMarjorie B Lees がラットの脳で発見した、水に難溶性のリポタンパク質（276 to 280 アミノ酸） 中枢神経系のミエリン（髄鞘）の細胞膜の主要なタンパク質 中枢神経系のミエリンには、PLPとミエリン塩基性タンパク（myelin basic protein：MBP）の2つの主要構成タンパク質がある。 PLPは細胞膜に、MBPは細胞質に局在する。 PLP1は発現量依存的にオリゴデンドロサイトの分化を抑制する。 PLP過剰発現トランスジェニックマウスはミエリンの再生が阻害され、脱髄疾患のモデル動物となる。 Wntタンパク：脊髄背側から分泌されるオリゴデンドロサイト発生を抑制する因子 Nkx2.2はPLPのプロモーターに結合してその発現を調節する。 PLP遺伝子：ペリツェウス・メルツバッハー病（ PMD）や伴性劣性家族性痙性対麻痺SPG-2の責任遺伝子 ジンピーマウス jimpy mice　←→マウス 　参考1/2 ジンピーマウスはPLP遺伝子の点突然変異のため正常PLPが発現されず、その結果中枢神経系でのみ髄鞘形成が障害される。 ジンピーマウスは生後約3週で強直性痙攣で死ぬ。 ペリツェウス・メルツバッハー病（Pelizaeus-Merzbacher disease：PMD）　←→脱髄性疾患 1885年 Friedrich Pelizaeus（1850〜1917, ドレスデン）が3世代家系5例を報告した（Arch Psychiatr Nervenkr）。 1910年 Ludwig Merzbacher（1875〜1942, チュービンゲン大、Robert Gauppの助手）がPelizaeusの患者の１例を剖検し、9臨床例を追加した。 1989年 Hudson LD （NIH ベセスダ）らがＸ染色体長腕にあるプロテオリピドタンパク遺伝子の異常であることを発見した。 中枢神経系におけるミエリン形成の異常により発症する遺伝性脱髄疾患 小児おける中枢神経系の先天性髄鞘形成不全症（白質と髄鞘の形成不全）：白質ジストロフィー症の１型 欧米での頻度は20〜50万人出生に１人の割合で発症と報告されている。日本での患者数は約100例程度と推定される X染色体上のPLP1遺伝子の異常による：X連鎖劣性遺伝病 乳児期に出現する眼振、筋緊張低下、発達遅延で発症し、重度の形成麻痺や運動失調へと進行する。 PLP遺伝子の発現低下と過剰発現のどちらもが原因となりうる。

myelin basic protein　ミエリン塩基性タンパク： MBP　←→MAG ←→methyl-CpG-binding proteins：MBPとは別物 ミエリン及びミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイトやschwann細胞に局在するタンパク質 成熟オリゴデンドロサイトマーカー ミエリンの細胞質に局在するタンパク質　←→PLP 神経線維から髄鞘が剥がれると、MBPが髄液中で増加する。多発性硬化症（MS）の診断目的で髄液MBP濃度を測定する。MSではMBPに反応するT細胞が高頻度で存在し、MBPに対する自己免疫が働いていることが示唆されている。 シバラー（shiverer）マウス ：ミエリン形成障害マウス　shiverer：shi 　←→マウス rodent Mbp gene mutations that cause dysmyelination 　参考1/2/3 常染色体劣性突然変異 ミエリン形成の障害の原因：オリゴデンドロサイトやschwann細胞自身の障害 ミエリン塩基性タンパク質：MBPの4-7エキソンが欠失 20〜22週齢という若さで、運動失調、非協調(dyscoordination)、痙縮および痙攣により死亡する。 振戦マウス　quaking mice　　 　参考1





DNA polymerase subunit gamma：POLG ヒトのミトコンドリアDNA複製酵素　DNAポリメラーゼ・ガンマ：POLGは、現在までにミトコンドリアにおいて見つかっている唯一のDNAポリメラーゼ ヒトのmtDNAの複製酵素POLGは、POLG (POLG1)遺伝子にコードされた140 kDaのcatalytic subunit：p140と、POLG2遺伝子にコードされた55 kDaのaccessory subunit：p55によるヘテロダイマーとして存在する。 気分障害を併発する慢性進行性外眼麻痺症候群：CPEO原因遺伝子の一つである PolgAに変異をもつheteroノックインマウスの脳と筋において、加齢とともに指数関数的な欠失mtDNAの蓄積促進が観察された。脳と筋特異的なmrDNA欠失蓄積はheteroマウスがCPEOモデルマウスとして妥当なことを示唆する。また、このheteroマウスは一般行動解析においては異常を示さなかったが他のモデルマウスと同様の行動の日内リズムに障害が見られ、脳での欠失mtDNAが気分障害を引き起こす可能性が示された。　参考1





fucosyltransferase9: FUT9　参考1 α1,3-フコース転移酵素遺伝子 Lewis X抗原がES細胞や神経幹細胞の未分化性と深く関わる。 幹細胞の未分化性に深く関わる糖鎖 →FUT9/FUT10/FUT8/ フコース fucose 糖鎖を構成する単糖の一つ デオキシ糖の一種である6-デオキシ-ガラクトース 天然にはL型がL-フコシドの形で、動椊物に幅広く存在する。 名前の由来：ヒバマタ Fucus（海藻）の細胞壁多糖類であり、昆布のねばねば成分としても知られるフコイダン Fucoidanで発見された。 哺乳類と植物では細胞表面のN結合糖鎖上で見つかる。　Ｏ型糖鎖？ ヒトではABO式血液型のH抗原やルイス抗原として存在する。 フコース転移酵素 fucosyltransferase 糖鎖の根元のアセチルグルコサミン（GlcNac）にフコースを付加させる酵素 転移酵素 transferase 一方の基質から他方の基質へと原子団〈転移基〉を移動させる反応を触媒する酵素 糖転移酵素 glycosyltransferase ゴルジ体や小胞体の中に存在する酵素群 糖供与体である糖ヌクレオチドから糖をタンパク質に付加する酵素 糖転移酵素 基幹領域 糖 H酵素：FUT1 Se酵素：FUT2 Le酵素：FUT3 ST酵素 A酵素 B酵素 1型糖鎖の基幹領域 Galβ1→3GlcNAc 2型糖鎖の基幹領域 Galβ1→4GlcNAc Gal GlcNac GalNAc Fuc NeuAc Fringe 糖転移酵素のひとつ ショウジョウバエの麹の形態形成に関与する細胞間シグナル分子として同定された。 N末端にシグナル配列を有し，そのコア領域は糖転移酵素と構造上の類似性を示す。 ゴルジに局在し，Notchの0一結合型糖鎖修飾に関与することが示された。 Notchシグナルを調節する糖転移酵素 3種類のフコース転移酵素と遺伝子がクローニングされている。 α1,2-フコース転移酵素（α1,2FUT） FUT1、FUT2 1型糖鎖（Galβ1, 3GlcNac）のガラクトース残基にα1,2結合でフコースを転移することにより、H1型糖鎖を合成する。 2型糖鎖（Galβ1,4GlcNAc）のガラクトース残基にα1,2結合でフコースを転移することによりH2型糖鎖を合成する。 H抗原を生合成するα1,2-フコース転移酵素遺伝子が後根神経節の小径神経細胞に特異的に発現する。フコシルGM1が軸索伸長の抑制に関与する。 α1,3-フコース転移酵素(α1,3FUT) FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT9 a1,6フコース転移酵素(a1,6FUT) FUT8 FUT1=H 酵素 α1,2-フコース転移酵素の一つ 1型抗原（Galβ1-3GlcNAcβ1-）のガラクトース（Gal）に、フコースを結合させる酵素 赤血球上のH1型抗原の合成に必須 FUT2=Se酵素：secretor enzyme 分泌型遺伝子酵素 α1,2-フコース転移酵素の一つ 2型抗原（Galβ1-4GlcNAcβ1-）のガラクトース（Gal）に、フコースを結合させる酵素 唾液中のH2型抗原の合成に必須 FUT3=Le酵素：Lewis enzyme α1,3とα1,4の両方の活性があるフコース転移酵素 ルイス抗原遺伝子酵素 FUT4〜FUT7 α1,3-フコース転移酵素 Lex, sLey, sLex FUT5：Myeloid-type FUT6：Plasma-type FUT8 1996年に谷口直之らが発見した糖転移酵素の1つ α1,6-フコース転移酵素 N結合型糖鎖のN-アセチルグルコサミン（GlcNac）の6位にフコースを1個結合させる酵素 FUT9 Lewis X抗原に対するフコース転移酵素 未分化性の神経幹細胞においてFUT9の発現量が高く、分化後に顕著に減少 脳で発現しているα1,3-フコース転移酵素遺伝子 Fut10 新規のα1,3-フコース転移酵素遺伝子 幹細胞におけるLewisX抗原の生合成に関わる シアル酸転移酵素：ST酵素　←→シアル酸 ルイス抗原（Lea、Leb）にシアル酸（NeuAc）を結合させる酵素 シアリル化によりシアリルLewis A抗原とシアリルLewis X抗原にする。 フコシル化　←→ガングリオシド フコースを付加する反応 フコシル化はゴルジ体で起こる。ゴルジ体でフコース転移酵素がドナー基質であるGDP-フコースを利用してフコースを転移する。 ルイス式血液型 Lewis blood groups　←→ABO式血液型 ヒト血球と抗 Lea、抗 Leb凝集素との反応によって分けられる血液型 Le (a＋b＊) 、Le (a＊b＋) 、Le (a＊b＊) の3つの型がある。その割合は約2：7：1である。 Se式血液型と関係があり、(a＋b＊) 型＝se型、(a＊b＋) 型＝ Se型、(a＊b＊) 型は大部分が Se型で、一部分が se型である。 ルイス式血液型抗原　←→ABO式血液型抗原 タンパク質あるいは脂質によって輸送される糖鎖抗原で、赤血球表面では糖脂質に存在する。 赤血球表面だけでなく、内皮細胞や消化管など上皮細胞にも存在する。 ルイス抗原を運ぶ糖脂質は血漿中を循環し、血漿リポタンパクに結合あるいは水分散性の形で、受動輸送により赤血球に吸収される。 ABO式血液型糖タンパクおよびルイス式血液型糖タンパクは共通の基礎構造（ガラクトース（GAl）とN-アセチルグルコサミン（GlcNac）を持つ。 糖転移酵素により、1型糖鎖の基幹領域に、糖を結合して、合成される糖鎖抗原 ルイス抗原にはLewis A抗原（Lea）、Lewis B抗原（Leb）、Lewis X抗原（Lex）、Lewis Y抗原（Ley）がある。さらにLeaおよびLexがシアリル化されたsLeaとsLexがある。 Lewis A抗原（Lea） Galβ1,3（Fucα1,4）GlcNAc-R FUT3=Le Lewis B抗原（Leb） （Fucα1,2）Galβ1,3（Fucα1,4）GlcNAc-R FUT2=Se Lewis X抗原（Lex） Galβ1,4（Fucα1,3）GlcNAc-R FUT9 シアリルLewis A抗原（sLea） NeuAc,Galβ1,3（Fucα1,4）GlcNAc-R ST酵素 シアリルLewis X抗原（sLex） NeuAc,Galβ1,4（Fucα1,3）GlcNAc-R ST酵素 Lewis A抗原：Lea ☆Galβ1,3（Fucα1,4）GlcNac-R ☆フコースが1個結合 Le酵素（FUT3酵素）によって、Galβ1→3GlcNAcのN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）に、フコース（Fuc）を一個、１→４結合させて、合成される。 膵臓、胆嚢、胃、大腸のがん細胞や、少量だが正常の上皮細胞に存在する。 Lewis B抗原：Leb ☆Fucα1,2Galβ1,3（Fucα1,4）GlcNAc-R ☆フコースが2個結合 Se酵素（分泌型遺伝子酵素：FUT2酵素）によって、Galβ1→3GlcNAcのN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）に、フコース（Fuc）を一個、１→４結合させて、合成される。次いで、基幹領域のGalβ1→3GlcNAcのN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）に、Le酵素により、もうひとつフコース（Fuc）を、１→４結合させ、合成される。 Lex抗原：Lewis X Antigen：Lex 　＝stage specific embryonic antigen 1 ：SSEA-1抗原　＝CD15 lact-N-（neo）fucopentaeose-Ⅲ分子 Galβ1,4（Fucα1,3）GlcNAc-R stage-specific embryonic antigen 1：SSEA-1：未分化性のマーカー 幹細胞の未分化性に深く関わる糖鎖 SSEA-1抗原はルイス式血液型に関連する糖鎖抗原で、cluster designation 15：CD15としても知られている。 ヒトの骨髄単球系の細胞に発現していて、好中球、好酸球、一部の単球に存在するが、正常赤血球や血小板、好塩基球やリンパ球には発現していない。 SSEA-1はマウスにおいてはES細胞、iPS細胞において多能性を示す細胞表面マーカーとして使われている。 ヒトにおいては初期分化段階の細胞に発現している。 Lex抗原はLewis A抗原と相似して、フコースがN-アセチルグルコサミン（GlcNac）に結合しているが、Lewis A抗原では、基幹構造がGalβ1→3GlcNAc（1型）なのに対して、Lewis X抗原ではGalβ1→4GlcNAc（2型） FUT9により、Galβ1にGlcNAcを結合させる酵素 血漿中に存在する型前駆物質のN-GlcNacの4位にフコースを添加する酵素をコードしている遺伝子(Le)によって調節されている。 結節硬化型・混合細胞型・リンパ球減少型ホジキンリンパ腫の Reed-Sternberg 細胞の大部分は、抗 CD15抗体陽性となる。 急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病で CD15 陽性、急性リンパ芽球性白血病において低レベルの CD15 の発現が報告されている。 さまざまな臓器由来の腺がん、扁平上皮がん、未分化大細胞がん/小細胞がんでも CD15 の発現が認められる。 神経幹細胞上のLewis X糖鎖は、Notchシグナル伝達系を活性化することにより、幹細胞性の維持を担う。 糖鎖エピトープは、細胞膜に発現する糖脂質や糖タンパク上に存在している。 シアリルLewis A抗原：sLea：Sialyl Lewis a=CA19-9 LeaがST酵素により、シアル酸（NeuAc）が２→３結合した構造 膵臓、胆管系および消化管のがんで大量に作られ、血清中に増加する。 がん細胞表面に存在するsLeaやsLexはセレクチンリガンドとして、血管内皮細胞などのセレクチンと結合する。 腫瘊マーカーのCA19-9が測定する抗原 シアリルLewis X抗原：sLex=SLX LexがST酵素により、シアル酸（NeuAc）が結合した糖鎖 肺、膵、卵巣がんなどの腫瘊マーカーとして、また転移能の評価・経過観察の指標となる。





ネスチン nestin　→参考1 ニューロフィラメント、αインターネクチン、シネミンと同類のIV型中間径フィラメントに分類される細胞骨格タンパク Lendhal & McKayがNeuroepithelial stem cellに因んでNestinと命名した（1990）。 中枢神経系の形成過程で選択的に発現し、分化が進むと発現は消失する。 ネスチンは発達中の中枢神経系の神経幹細胞で発現している。この組織特異的発現は、ネスチン遺伝子の2番目のイントロンの神経幹細胞特異的エンハンサーによって駆動される。 neural tissue-specific marker genes：E7.0–E8.0に検出される。 胎生期の中枢神経系の形成過程での幹細胞に選択的に発現し、ニューロンやアストロサイトに分化が進むと発現は消失する。 神経幹細胞／神経前駆細胞に特有の中間径フィラメント、マーカー 未分化神経前駆細胞の一つであり、海馬歯状回においてはGFAP陽性細胞である1型細胞と、PSA-NCAMを発現する2型細胞がネスチンを発現する。 V-SVZのquiescent・B1型細胞はネスチンは発現していないが、activated B1型細胞はネスチンを発現していて、C型細胞を生み出す。 脳が損傷を受けた場合にも、アストロサイトにネスチンが発現する。 脳室周囲白質軟化症などの病変周囲においてnestinが増加することから脳損傷の修復や再生の指標とされている 中枢神経系以外では消化管のinterstitial cells of Cajal（カハール間質細胞）、膵臓の前駆細胞、横紋筋の神経筋接合部や筋腱接合部での横紋筋細胞での発現が確認されている。 nestin-Creマウス nestin promoterでCre recombinaseを発現するマウス　←→Creドライバーマウス Behavioral phenotyping of Nestin-Cre mice: Implications for genetic mouse models of psychiatric disorder 1/2  Nestin-CreERマウス　←→レポーターマウス/Floxed mouse/Emx1-Creマウス ネスチン遺伝子のプロモーター下にタモキシフェンによる遺伝子改変を誘導するシステム タモキシフェンを投与した時にCreERが発現している細胞が、GFPで標識される。 タモキシフェン投与時に存在する神経幹細胞、神経前駆細胞が標識される。 タモキシフェンを胎生11日齢マウスがいる母マウスに投与し、胎生14日にneurosphere assayを行うと、Nestin-CreERマウスからはGFP陽性のneurosphereが形成されるが、Olig2-CreERマウスのneurosphereはすべてGFP陰性である。胎生11日〜胎生14日にはオリゴデンドロサイトは産生されていない。 Olig2-CreERマウス タモキシフェン投与時に存在するオリゴデンドロサイト前駆細胞群が標識される。　←→オリゴデンドロサイトの発生 →Nestin-CreERT2マウス 内在性のエストロゲンに反応しないように改良された。 マウス成体において、タモキシフェン投与により神経幹細胞に効率の良いCre組み換え活性を誘導できるので、成体の神経幹細胞の解析研究のための貴重な動物モデルである。 →Cre-loxPシステム /Cre /CreERTM /loxP配列




Ten-eleven translocationファミリー：Tetファミリー　←→Tetシステムとは無関係 　参考1/2/3 DNAの脱メチル化に関与するmethycytosine dioxygenaze （メチル化シトシン特異的ジオキシゲナーゼ＝メチル化シトシンヒドロキシラーゼ）（酸素添加酵素）（水酸化酵素 DNA hydroxylases） 名称は、がんにおける一般的な転座にちなんで名付けられた。第10染色体と第11染色体との間で転座が起こり、mixed-lineage leukemia (MLL)-TET1融合タンパク質が生成される。 能動的DNA脱メチル化機構（DNA複製に依存しない脱メチル化機構）において、脱メチル化酵素として働くタンパク質 Anjana Raoのグループが2009年に、5-メチルシトシンのメチル基を酸化する酵素を同定するために、α-ケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼドメインに相同性をもつ哺乳動物ホモログをデータベース検索し、Tetファミリータンパク質Tet1、Tet2、Tet3を同定した。 いずれも1800〜2100アミノ酸残基からなり、C末端側にFe2+およびαケトグルタル酸：α-KGを補酵素とする酸化酵素に共通したドメインであるdouble stranded β-helix domain：DSBHドメインをもつ。　←→αKG依存型ジオキシゲナーゼ TETはシトシンの5位のメチル基（5mc：5-メチルシトシン）を水酸化し、5hmc（5-ヒドロキシメチルシトシン）に変換するが，この反応の際にTCA回路の代謝物であるαケトグルタル酸を補酵素として利用する。 Fe2+およびαケトグルタル酸を補酵素として、5メチルシトシン（5-methylcytosine：5mC）を、5-ヒドロキシメチルシトシン（5-hydroxymethylcytosine：5hmC）へと酸化する。さらに5フォルミルシトシン（5-formylcytosine：5fC）、5-カルボキシルシトシン（5- carboxylcytosine：5cCaC）へと酸化するすべてのステップを触媒し、5-mCの脱メチル化を促すと考えられている。さらに、DNAグリコシラーゼのTDGにより塩基除去修復されることによって、DNAの脱メチル化が起こる。 TET1　Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1 (TET1) Tet1は着床前初期胚において核に局在し、胚盤胞期には主に内部細胞塊に発現する。 内部細胞塊から樹立されるES細胞での維持にTet1が必要 参考1 受精後の最初の細胞系列の決定にTet1が重要な役割をはたす。 Tet1はES細胞でゲノム全体にわたって結合していて、結合部位の多くはCpGが豊富なプロモーターの転写開始点：TSSや遺伝子内に位置している。　参考1 TET1ノックアウトマウスは胚性致死 神経管閉鎖不全に関わる。 DNA脱メチル化酵素として機能する可能性がある。　←→ヒストン脱メチル化酵素/DNAメチル基転移酵素：DNMT siRNAを用いたノックダウン実験により，マウスES細胞ではTet1が自己複製の維持に重要であることが明らかになった。　参考 ES細胞が分化する間TET1の発現が低下し、Nanogの発現低下とプロモーターのメチル化が付随する。 TET1はNanogプロモーターに直接結合することで、高メチル化から保護 TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation　参考1 Gadd45Aが直接Rループに結合し、TET1を動員することによって局所的なDNAの脱メチル化を仲介する。 記憶の消去で重要な役割を果たす遺伝子　関連1 記憶の固定にも関与 TET2 TET2のみCXXCジンクフィンガードメインを持たない。これは、進化の過程において、染色体逆位が起こり、CXXCドメインと触媒活性ドメインの分節が分割されたためだと考えられている。 TET2のCXXCドメインはIDAXと呼ばれていて、各生物種において保存されていることが明らかとなっている。 TET3　参考1 受精卵中の父方ゲノムは、雌雄の前核が融合する前に、能動的DNA脱メチル化を受け、同時に5-メチルシトシン（5mC）が酸化されて5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）になる。Guらは、ジオキシゲナーゼTet3の触媒活性が失われる条件的ノックアウトマウスを作製した。Tet3欠損受精卵では、父方ゲノムでの5mCから5hmCへの変換が起こらず、5mCの量が変わらないままだった。さらに、父親由来のOct4やNanog遺伝子の脱メチル化も妨げられていた。したがって、Tet3を介した5mCの酸化は、受精卵中の父方ゲノムにおける脱メチル化と遺伝子活性化に寄与している。　参考1/2 →Tet on/offシステム /Tet-onシステム /Tet-offシステムとは別物

Nanog 遺伝子 ホメオドメインをもつ転写因子 遺伝子の働きを調節する因子で、ケルト語で常若の国を意味する「Tir Na Nog」から命名された。 マウスE4.5のNanog positiveの原始外胚葉は分化多能性を維持し、将来胎仔を形成するすべての細胞の源となる。 自己複製マーカー 米ウイスコンシン大学が発表したiPS細胞の4因子（Oct4, Sox2, Nanog, Lin28）には含まれているが、ES細胞の自己再生（=無制限の複製）に必要不可欠な遺伝子 山中先生がES細胞の全能性を維持（未分化維持）するのに必須の因子として同定したが、Yamanaka factorsには入っていない。 Nanog遺伝子を除去するとES細胞は全能性を失い、逆にNanog遺伝子の働きを強めると、全能性の維持される。 ES細胞ではTet1とDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT；DNMT1，DNMT3a，DNMT3b）がNanog遺伝子プロモーターのメチル化状態を競合的に変換している。　参考1 DNMTがシトシンをメチル化してTet1が機能しない場合（Tet1非存在下）には、メチル化CpG結合タンパク質を含むリプレッサー複合体がNanog遺伝子プロモーターに結合し、Nanog遺伝子は発現抑制をうける。 Tet1存在下では，Tet1は5-メチルシトシンを5-ヒドロキシメチルシトシンに変換し、受動的なDNA脱メチル化あるいは能動的なDNA脱メチル化によってNanog遺伝子の発現が維持される。

→Oct

→Olig2

■細胞周期 cell cycle関連、ニューロン新生関連　←→細胞周期、ニューロン新生研究

→cyclin/CDK/CDK抑制因子/Cdt1/Cdc10




→BrdUによる分裂細胞標識 →EdUによる分裂細胞標識 →Ki67/PCNA/PH3

→DNA ligase I S期後期からG2期初期に発現し複製されたDNAの結合に関与する。

DNA helicase B　←→DNAヘリカーゼ S期後期に発現しDNAの二重らせんをほどいていく。




DNA含量解析による細胞周期解析 Cell Cycle Analysis　←→1/2/3/4 取り込まれたBrdUの免疫蛍光染色とフローサイトメトリー分析を組み合わせると、DNAを合成している各細胞の割合と特性を高分解能で分析できる。 BrdUによる免疫蛍光染色には、7-AADの様な全DNAに結合する色素による染色が組み合わされます。 2カラー染色フローサイトメトリー分析　縦軸：BrdU（FITC）、横軸：7-AAD 細胞周期の位置：G0期/G1期、S期またはG2/M期）ごとに、活発にDNAを合成している細胞の数と特徴を解析することができる。 G1期は数値的には細胞周期中最も優勢な期であり、フローサイトメーターで測定した場合､最も大きなピークとして現れる。 DNAを染色する蛍光色素 ：DNA染色剤 DNA-binding dyes　←→蛍光/蛍光色素/共焦点走査型レーザー顕微鏡　参考1 色素名 結合様式 コメント 励起波長 蛍光 PI DNA二重鎖へのIntercalations DNA含量によく相関 488nm／536nm 617nm 7-AAD G-C塩基対によく結合 多重染色に用いやすい 546nm 647nm Hoechst33342 A-T塩基対によく結合 生細胞のDNA染色可 343nm 483nm DAPI A-T塩基対によく結合 RNAに結合しにくい 345nm 455nm TO-PRO-3 DNAに結合 多重染色に用いられる 642nm 661nm ヨウ化プロピジウムでDNAを染色し、フローサイトメトリーを用いてDNA含量を分析することで、細胞周期を同定することができる。




fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicators：Fucci　←→R26-mice 細胞周期を時間空間的にリアルタイムで可視化できる：G1期とS期/G2/M期を見分けることができる蛍光マーカー 細胞周期の特定の時期だけに発現する2つの制御タンパク質であるCdt1とGemininを利用している。 ． Cdc10-dependent transcript 1 protein：Cdt1 DNA複製ライセンス化因子、DNA複製の開始因子 G1期に複製開始点に局在し、一度複製されたDNAが再複製されないように制御している。G1期に発現量が高いが、S期に入るとユビキチンープロテアソーム系により分解される。 ヒトCdt１：全長546アミノ酸の調節領域をコードする部位（機能領域を除く） Cdt1タンパク質レベルはG1期に最も高く、S期に移行すると低下する。 Cdt1を赤色蛍光タンパク質monomeric Kusabira-Orange2: mKO2との融合タンパク質として発現させる。 Geminin DNA複製ライセンス化抑制因子、Cdt1機能の抑制因子 GemininレベルはS期に上昇し、S期/G2期/M期の間は維持され、G1期前には分解される。 Gemininを蛍光タンパク質のmonomeric Azami-Green1: mAG1との融合タンパク質として発現させる。 G1期 S/G2/M期 Fucci mKO2 mAG1 Fucci 2 mCherry Venus cell division cycle 10：Cdc10 細胞周期を制御する遺伝子 Res1(Sct1)あるいはRes2(Pct1)と複合体を形成したMCB配列に結合し、DNA合成に必要な遺伝子のいくつかを転写誘導する。 ヒトCdt1遺伝子の部分配列にmKO2（あるいはmCherry）の遺伝子を、ヒトgeminin遺伝子の部分配列にはmAG1（あるいはVenus）の遺伝子を融合させ、mKO-hCdt1と mAG-hGem を作製し、これら2つの遺伝子をレンチウイルスを使ってHeLa細胞内へ同時に導入して発現させると、G1期の核はオレンジ色の蛍光を示し、S/G2/M期の細胞の核は緑色の蛍光を発する。 　←→エレベーター運動 発生初期の脳室帯で、緑色を呈する細胞（S/G2/M期）は移動して脳室面に到達すると分裂し、生じた2つの娘細胞は赤色（G1期）に変化して脳室面から中間帯へ移動する。 中間帯にある赤色を呈する細胞（G1期）は、脳室面へ移動を開始すると同時に黄色（G1/S期移行）を経て、緑色（S/G2/M期）に変化した。

■レポーター遺伝子 reporter gene　←→レポーターマウス/→マーカー遺伝子/レポーターアッセイ

• 細胞内でのある遺伝子の発現を可視化するための外来遺伝子
• 目的の因子の機能を知るために代用される遺伝子
• 産物の活性が簡単に測定もしくは可視化でき、なおかつバックグラウンドが低いことが使用上の条件となる。遺伝子の発現様式を調べる場合には、目的遺伝子のプロモーター配列とレポーター遺伝子のエレクトロポレーションあるいはアグロバクテリウムを利用してトランスフェクションした後、簡便には一過性に発現したレポーター活性を測定することで、また形質転換植物を作製すれば，目的遺伝子の発現組織・時期の特定などが可能。目的遺伝子とレポーター遺伝子を融合タンパク質として発現できるようにした遺伝子を植物細胞へ導入すれば、タンパク質の細胞内局在，あるいは細胞外移行などを調べることができる。
• トランスフェクション後の遺伝子産物のアッセイを容易にするための遺伝子で、成功的に導入された細胞の選別や遺伝子発現調節の研究のためのマーカーとして、あるいはトランスフェクション効率の標準化のためのコントロールとして使用される。
• 発現を可視化したい遺伝子の発現制御領域下に蛍光タンパクなどをコードした塩基配列を挿入することによって、その遺伝子の発現と同調して細胞が蛍光を発する。
• 理想的なレポーター遺伝子は、その研究で使用される細胞に含まれないか、天然型の遺伝子と容易に識別可能な遺伝子であり、簡便にアッセイ可能で、広範囲でリニアな検出範囲を持つものです。また、レポーター遺伝子の存在が導入された細胞の正常な生理機能や全般的な健康状態に影響しないことは重要である。
• 特定の基質と反応して発光あるいは発色する酵素や、励起光によって蛍光を発する蛍光タンパク質の遺伝子がレポーター遺伝子として用いられる。
• これらの光や色を測定することで、組み換え遺伝子の発現を見ることができる。
• 現在、様々な生物の遺伝子がプロモーターの活性やタンパク質の挙動を知るためのレポーター遺伝子として利用されている。
• レポーター遺伝子は、ある遺伝子のプロモーターの下流に連結し、その融合遺伝子の産生物の活性を測定することによって元の遺伝子の発現の有無や、その発現の強さを知るために用いられる。
• 逆にレポーター遺伝子の上流にランダムなDNA断片を挿入し、プロモーター活性を持つ配列を検索するためにも用いられている。
• レポーター遺伝子としての条件として、その遺伝子産物の活性の測定が容易である、細胞毒性がない、組織または個体レベルでの検出が可能性あるといったことが要求される。
• 代表的なレポーター遺伝子としては、GFP，GUS(β-グルクロニダーゼ)、LUC(ルシフェラーゼ)などがある。
• lacZ、CAT (クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)などがもレポーター遺伝子として使用されている、
  
  

  Green Fluorescent Protein：GFP　→EGFP/YFP/Venus 2008年下村脩先生のノーベル化学賞受賞 1962年に下村脩先生がオワンクラゲ Aequorea victoriaの発光器官から発見した蛍光タンパク質 紫外線（波長395nm）を当てると、黄緑色（波長508nm）に蛍光を発する。 セリン、チロシン、グリシンの3 つのアミノ酸が、自己触媒的に環化、脱水、酸化を行い、蛍光発色団を形成している。 1992年にGFPの遺伝子配列が明らかになり、GFPを用いたバイオイメージングが一気に普及した。 GFPはプロモーター解析と局在解析のいずれにも利用可能で、励起光を照射するだけで緑色の蛍光を発するので生体観察に適している。 GFPおよび、GFP変種の蛍光タンパク質のほとんどは、約pH 6.0以下で蛍光を失うので、固定用の4%パラホルムアルデヒド（PFA）溶液はpH 7.4に調整する。 グリーンマウス GFP遺伝子を全身で発現するグリーンマウス 大阪大学の岡部勝教授の開発した。

  β-グルクロニダーゼ：GUS GUSは大腸菌由来で、プロモーター解析に最も一般的に用いられてきたレポーター解析であるGUSは大腸菌由来で、プロモーター解析に最も一般的に用いられてきたレポーター遺伝子である。 GUS遺伝子産物は安定だが、活性の獲得に四量体形成が必要で、通常染色前には固定処理をする。

・蛍光タンパク fluorescent protein：FP　←→細胞周期/蛍光タンパク質/レポーター遺伝子/蛍光色素/ルシフェラーゼ　参考1

Enhanced Green Fluorescent Protaion：EGFP　←→GCaMP 赤方偏移励起に改良されたGFP 緑色蛍光タンパク Green 励起波長：488nm, 蛍光波長：509nm 蛍光強化型 GFP ＝ Enhanced GFP ＝ EGFP 青色の励起光を照射すると，黄緑色に光る。

Yellow Fluorescent Protein：YFP 緑色蛍光タンパク GFPの黄色変異体 カリフォルニア大学サンディエゴ校のRoger Yonchien Tsien博士（錢永健, 1952/2/1〜2016/8/24　米国の生化学者　2008年に下村脩先生らとともにノーベル化学賞を受賞）が発見した。 203 番目のThrをTyrなどの芳香族アミノ酸に変換すると、発色団のフェノール基の電子配列に影響し、励起極大波長が超波長側にシフトする。

Venus　←→Fucci2 宮脇敦史（理研）らが開発した改変YFP 夜空で最も明るい星“金星”にちなんで「Venus」と命名した。 黄色蛍光タンパク Yellow 励起波長：515nm, 蛍光波長：528nm 細胞膜 蛍光をより明るくミューテーションしたEGFPを、さらに発色団をより安定化するために、そのまわりのアミノ酸を変えた。

monomeric Kusabira-Orange2: mKO2　←→Fucci Kusabira-Orange イシサンゴに属するヒラタクサビライシ（Fungia concinna）から単離されたされたオレンジ色の蛍光タンパク質 2量体（KO1）と単量体 monomeric（mKO1、mKO2）がある。 強い蛍光とpH安定性を示し、mKO1は褪色しにくい、mKO2は素早く光る、という特徴を持つ。 Midoriishi-Cyanと組合わせて蛍光エネルギー共鳴移動法　FRETに使用できる。 励起波長：548nm, 蛍光波長：561nm オレンジ色の蛍光を発し、pH安定性を示す。 細胞内小器官を簡単に標識できる。(細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、核質標識用プラスミド) コドンをヒト化したべクターも揃えている。 G1期のインジケーター

Discosoma赤色蛍光タンパク質：DsRed 花虫綱 （サンゴやイソギンチャクの仲間）・ホネナシサンゴ目・イソギンチャクモドキの一種 （Discosoma sp. mushroom）由来 GFPとDsRedの相同性が19％しかないことから、一般的にGFP抗体はDsRedタンパク質を認識することはない。 DsRedタンパク質は、その全体的な折り畳み方（β-can）及び発色団の構造の化学的性質という点でオワンクラゲのGFPと似ている。 DsRedは発色団の成熟課程でにおいていくつかのステップを経て、4量体構造を形成する。 部位特異的変異誘発を用いて、DsRedタンパク質の多数のバリアントが作製され、単量体成熟した赤色蛍光タンパク質も存在している。 DsRed単量体バリアントには、単量体ミュータント mRFP1、mBanana、mCherry,、mHoneydew、mPlum、mOrange、mStrawberry、mTangerineなどがあり、幅広い蛍光色を呈す。 フルーツ蛍光タンパク Fruit Fluorescent Proteins, mFruits 2004年にNathan C. ShanerとRoger Tsienが開発した、DsRedバリアントに変異を導入して得られた蛍光タンパク質 mRFP1（単量体型のDsRedバリアント）に直接変異を導入して得られた色彩の異なる8種類のバリアント 長波長域の蛍光波長（553〜649 nm）、安定な発現、融合タンパク質としての有用性が特長 tdTomato以外は単量体の蛍光タンパク質 mPlum, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, tdTomato, mOrange, mBanana （mTangerine, mHoneydew） フルーツ蛍光タンパク質シリーズだけでなく、Living Colors蛍光タンパク質シリーズが製品として販売されている。

mCherry　←→Fucci2 赤色蛍光タンパク質、FarRed DsRedを改変した赤色蛍光タンパク 励起波長：587nm, 蛍光波長：610nm 緑色〜黄色の励起光を照射した時に、赤い蛍光を発する。 フルーツ蛍光タンパクの一つ

tandem dimer Tomato：tdTomato　ティーディートマト　←→tdTomatoマウス＠レポーターマウス　参考1/2/3/4 極大波長581nmを有する非常に明るい赤色蛍光タンパク質 赤色蛍光は波長の短い青色光などに比べて散乱しにくいので、組織中の観察に適している。 EGFPの2.5倍の蛍光強度を示す。 DsRedバリアント：サンゴから単離されたDsRedに改変を加えて作製された7種類のフルーツ蛍光タンパクの一つ Roger Tsien（錢永健, 1952/2/1 〜 2016/8/24　米国の生化学者　2008年に下村脩先生とともにノーベル化学賞を受賞）の研究室で開発された。 dTomato（dimeric Tomato）遺伝子2つをタンデムにつなぎ合わせ、タンデム2量体を形成するよう設計されているので、非常に明るい蛍光シグナルが得られ、しかも凝集性は極めて低く抑えられている。 大きいので、融合タンパク質をつくると巨大になってしまうことでは不利 大塚正人先生（東海大学）らが独自にトランスジェニックマウスを開発した。 CAGプロモーター下に連結したtdTomatocDNAをRosa26遺伝子座上に導入することにより作製されている。

ミドリイシサンゴ　monomeric Midoriishi: mMC ミドリイシサンゴの一種 (Acropara sp.) から単離されたシアン色の蛍光タンパク質であるMidoriishi Cyanを単量体化したもの Midoriishi Cyanと同様にシアン色の蛍光をもつ。 mMCは代表的なシアン色蛍光タンパク質であるamFP486と62%のアミノ酸配列相同性を持つが、両者の蛍光特性には違いがあり、mMC (励起ピーク: 469 nm, 蛍光ピーク: 496 nm) はamFP486 (励起ピーク: 453 nm, 蛍光ピーク: 486 nm) よりもやや長波長側に励起・蛍光ピークがある。 このため、mMCは一般的な緑色蛍光タンパク質とamFP486の中間の蛍光特性を持つ。

monomeric Azami-Green1: mAG1　←→Fucci 緑色蛍光タンパク Green 励起波長：492nm, 蛍光波長：505nm

Midoriishi-Cyan ミドリイシ(Acropara sp.)の触手よりクローニングされた蛍光タンパク質 青緑色の蛍光を発す。 Kusabira-Orange単量体と組合わせて蛍光エネルギー共鳴移動法　FRETに使用できる。

AmCyan1 青色蛍光タンパク Cyan 励起波長：458nm, 蛍光波長：489nm

→lacZ　←→X-gal染色/lacZ α

○蛍光カルシウムセンサー
　→GECI/GCaMP/RCaMP/IP2.0
　←→蛍光/蛍光色素/蛍光タンパク
　←→カルシウムシグナリング/カルシウムイメージング/カルシウム指示薬/カルシウムキレーター

• 神経発火により細胞内カルシウム濃度が上昇することから、神経発火を検出する方法として蛍光カルシウムセンサーを用いて神経活動をイメージングできるようになった。
• これを応用して、数百～数千個のニューロンの活動を同時に記録することにより、脳のはたらき方の原理をはじめとして、記憶障害や精神疾患の原因を解明することが重要な課題となっている。特に遺伝子にコードされた蛍光カルシウムセンサーは特定の種のニューロンに発現させることができ長期にわたる観察が可能であることから、広く用いられている。

  遺伝子でコードされたカルシウムカルシウム指示薬　Genetically Encoded Calcium Indicator：GECI　←→カルシウム指示薬 遺伝子でコードされたカルシウム感受性蛍光タンパク質 GCaMPをはじめとする遺伝子にコードされたカルシウムセンサー GECIの性能を決めるものとして4条件（ダイナミックレンジ、高感度、Hill係数、Ca2+指示薬に比べ、1. 細胞種特異的な発現・観察が可能　2.非侵襲的であるため長期間に渡る観察が可能　という２つの大きな利点がある。 Ca2+イメージングによる神経活動計測は1982年にRoger Tsienらが低分子蛍光色素を開発したことに端を発し、1997年に宮脇博士らが2つの蛍光タンパク質のスペクトルの変化を利用したFRET型のcameleonを開発したことによりGECIの歴史が始まった。この知見を基に、2001年に中井博士らが緑色単色のG-CaMPを開発したことにより、標準的な顕微鏡システムにおいてCa2+濃度変化の計測を可能にした。GCaMPは改変GFPとカルモジュリン（CaM）およびCa2+/CaM結合領域であるMLCK由来のM13配列からなり、Ca2+濃度の上昇に伴い蛍光強度が増加する。さらに、中井グループ、Janeliaがこれを改良し、GCaMP3–8およびjGCaMP7と順次開発し、Ca2+フリーとCa2+飽和状態のダイナミックレンジを最大化させる努力してきた。これにより、哺乳類in vivoで発火の有無を検出できるようになったが、未だ発火パターンを精密に解読するのが困難であった。

  カメレオン　cameleon カルシウムセンサー蛍光タンパク質 Ca2+結合能の結合に依存して相互作用する(CaM)と、M13 ペプチドを連結し、それをGFPの青緑色変異体と黄色変異体でサンドイッチした構造を持つタンパク質 永井健治らはCa2+の濃度に応じて青緑色から緑黄色へと蛍光色が変化するためカメレオンと命名した。

  yellow cameleon Ca2+の結合に依存して相互作用するタンパク質であるカルモジュリン（CaM）とM13を連結し、さらにそれを緑色蛍光タンパク質のシアン色変異体（CFP）と、黄色変異体（YFP）でサンドイッチした構造を持つタンパク質 黄色蛍光タンパク質YFPを、カルモジュリンを介して結合した青緑色蛍光タンパク質　CFPを励起すると、エネルギーの一部が共鳴エネルギー移動（FRET）によって近くのYFPに伝わり、CFPからの青緑だけでなくYFPの黄色蛍光も観察される。カルモジュリンはカルシウム濃度に応じて形態が変化するため、CFPとYFPの位置関係が変化し、FRETの効率が変わるために青緑と黄色の蛍光強度比が変化する。 Ca2+の結合により、CFPからYFPへのエネルギー移動（FRET）効率が上昇し、シアン色から黄色へと蛍光色が変化する。

  yellow cameleon-Nano：YCnano 機能解析用のカルシウムセンサー 従来のyellow cameleon ではCaMとM13の間が2アミノ酸（GlyGly）からなるリンカー配列で連結されていたが、2アミノ酸で連結されたCaM-M13は立体構造的に窮屈な形をとっているため、Ca2+に対する親和性が低くなっている。リンカー長を段階的にのばした結果、リンカー長 4 アミノ酸で Kd= 30nM、リンカー長 5 アミノ酸で Kd = 15nM まで向上した。 最強のCa2+キレーターとして知られるEGTAよりも10倍も強くCa2+と結合するセンサー 世界最高のCa2+親和性を有する改良型センサーを nM レベルの Ca2+濃度を測定できることにちなんで yellow cameleon-Nano と命名された。

  GCaMP　参考1　←→EGFP/細胞内カルシウム GCaMPは主として緑色蛍光タンパク（EGFP)、カルモジュリン(CaM)、ミオシン軽鎖フラグメント（M13）を遺伝子工学的に結合させたカルシウムセンサータンパク質 GFPを人工的に改造して、カルシウムイオンが結合するとより明るく光るようしたタンパク質がGCaMPであり、GCaMP蛍光強度の変化が、カルシウムイオン濃度の変化に対応する。 このタンパク質はEGFP)の片側（N末端側）にカルモジュリンを、もう片側(C末端側)にはミオシン軽鎖M13フラグメントを結合した形をしている。 カルシウムイオンがカルモジュリンと結合すると、Ca2+/CaM複合体がM13と相互作用してEGFP)（蛍光団）の立体構造を変化させ、これによって蛍光強度が変化する。これを利用することによってカルシウム濃度の変化をGCaMP蛍光強度の変化として検出することができる。 タンパク質であるため遺伝子に組み込むことが可能であり、特にモデル動物において組織・細胞特異的プロモーターと組み合わせることによって目的の組織・細胞種のみをカルシウムイメージングすることができる。 GCaMPはLoren L. Looger（ハワード・ヒューズ医学研究所Janelia Research Campus Looger Lab）らのグループと中井淳一、大倉正道（埼玉大学脳末梢科学研究センター中井研究室）らのグループをはじめとした複数の科学者によって改変・改良されていて、現在では様々な種類のGCaMPが存在する。GCaMP3の導入された遺伝子改変動物は広く普及しており、これを用いた研究は今も発表されている。

  RCaMP 中井研究室では、GCaMPのGFPドメインを mApple 由来の構造に置換して作製された GECI である R-GECO1 にランダム変異を導入し、R-GECO1 よりも大きな蛍光反応を示すクローンを探索した結果、R-CaMP1.07を見出した。 RCaMP2* 超高感度・超高速赤色カルシウムセンサー 井上昌俊・尾藤晴彦ら（東京大学大学院医学系研究科 神経生化学分野）が作出した赤色Ca2+センサー。赤色GECIのR-CaMP1.07を骨格として用い、M13配列をckkap配列と置換した結果、既存の赤色Ca2+センサーに比べ感度が3倍も向上し、かつ、Hill係数が1付近であることから線形性が圧倒的に高い赤色Ca2+センサーが作出された。 従来の赤色GECIは脳スライス標本においてまでしか発火を検出できていなかったことから、生体内において複数細胞種の神経発火を同時にかつ精密に解読することが困難であった。 RCaMP2は高頻度神経発火の計測も可能な、超高感度・超高速赤色Ca2+センサー 井上らはさらに、R-CaMP2と従来の緑色Ca2+センサーとを組み合わせることにより、マウスの大脳皮質における興奮性と抑制性の2つの異なる種のニューロンの神経活動を同時に計測することに成功した。

  inverse-pericam 2.0：IP2.0 従来のGECIの蛍光タンパク質のほとんどは、カルシウムイオン濃度の上昇に伴い蛍光が強くなるため、細胞内のカルシウムイオン濃度減少の計測には適していなかったが、九大の石原 健　教授のグループは「神経活動の抑制」を鋭敏に測定することができる新しいGECIの開発に成功し、IP2.0を開発した。*

□治療薬	│ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬：HDAC阻害薬　Histone deacetylase inhibitor│　←→HDAC　参考2/3

• HDACはがん抑制遺伝子の発現に関与し、HDAC阻害薬は抗がん活性を示すことが知られている。
• HDAC 阻害薬がiPS細胞の作製効率を向上させることも報告され、再生医療の実現におけるHDAC 阻害薬の重要性も示されている。
• ラット及びマウスのMCAOモデルでは、虚血脳全体のヒストンのリジン残基でアセチル化が抑制されるが、この変化はHDAC阻害剤の投与により梗塞体積の減少と共に回復される。ラットのMCAOモデルでは傷害後のバルプロ酸、酪酸ナトリウム、トリコスタチンの投与により、状態の改善がみられることが示されている。
• 酪酸ナトリウムを投与したMCAOラットでは虚血脳で、神経新生の増加が確認されるが、これはBDNF-TrkBの経路を遮断すると消失する。
• HDAC阻害薬の投与は虚血によって引き起こされるp53の発現上昇を抑制し、heat-shock protein 70（HSP70）の発現を誘導することが知られている。
• HSP70はマウスMCAOモデルでHSP70- I-κBα- NF-κBの安定な複合体を形成することにより、 NF-κBを不活性化することで抗炎症作用を示すことが明らかにされている。

  トリコスタチンA trichostatin A：TSA　参考1 抗真菌抗生物質として働く有機化合物 1976年に、塩野義製薬の辻らによってStreptomyces hygroscopicusから単離された。 TSAは抗がん剤としての潜在能力を有する。TSAがアポトーシス関連遺伝子の発現を促進し、がん細胞の生存率を低下させ、がんの進行を遅らせる。 TSAはクラスIおよびIIほ乳類ヒストン脱アセチル化酵素ファミリーに属する酵素を選択的に阻害するが、クラスIII HDACは阻害しない。 TSAは成長期の開始時期の間に真核生物の細胞周期を阻害する。 TSAはヒストンからアセチル基を取り除く酵素の活性を妨げることによって遺伝子発現を変化させるのに使用することができるので、DNA転写因子がクロマチン内のDNA分子にアクセスする能力を変化させる。 TSAはマウスフレンド白血病細胞に強力な分化誘導活性を示すとともに正常線維芽細胞の増殖をG1とG2で可逆的に停止させる新しい細胞周期阻害剤であり、その標的分子はヒストン脱アセチル化酵素であることが明らかになっている。 TSAはマウスN9株化ミクログリア細胞およびラット初代ミクログリア細胞においてIL-1β）/LPS（リポ多糖）/IFNγによって誘導される一酸化窒素合成酵素 (NOS) 2の発現を抑制する。

  ボリノスタット Vorinostat：VS・（ゾリンザ®） 別名：スベロイルアニリドヒドロキサム酸　suberoylanilide hydroxamic acid：SAHA 世界で初めてのHDAC阻害の作用機序を有する薬剤、エピゲノム治療薬 2000年2月に米国で抗悪性腫瘊剤としての臨床開発され、米国で2006年10月6日に承認を取得した。 日本では2010年6月16日に皮膚T細胞性リンパ腫：CTCLに対する治療薬として希少疾病用医薬品の指定を受け、2011年7月に「皮膚T細胞性リンパ腫」の適応で承認を取得しました。 1971年にジメチルスルホキシドが赤白血病の赤血球系異常幼若細胞を分化させることが発見され、分子探索の結果、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）が発見された。 クラスⅠ（HDAC1、2及び3）及びクラスⅡ（HDAC6）のHDACの触媒ポケットに直接結合し、その酵素活性を低濃度（IC50≦86nM）で阻害する。また、培養細胞においてヒストンアセチル化を誘導し、種々の培養がん細胞において細胞周期の停止、アポトーシス又は分化を誘導することが示されている。 ボリノスタットはHDACの活性中心に結合し、同部位に在る亜鉛イオンをキレート化する。 HDACが阻害されることでアセチル化されたヒストン等のタンパク質が蓄積する。その中には、細胞の分化を決定づけるのに必要な因子も含まれている。その因子の高発現の結果、脱分化（=がん化）が抑制される。

  フィンゴリモド fingolimod：FTY720（イムセラ®、ジレニア®）　参考1 免疫抑制剤：リンパ球がリンパ節から体液中に出るのを妨げて免疫を抑制する。 多発性硬化症の再発予防薬：再発寛解型MSの再発予防および身体的障害進行抑制の治療効果 冬虫夏草菌の一種であるIsaria sinclairii」由来の天然マイリオシンMyriocin、ISP-1）の構造変換により得られた化合物 京都大学の藤多哲朗教授と台糖、吉富製薬（FTYの名称は三者にちなむ）の共同研究でMyriocin、ISP-1に免疫抑制効果が見出されたことから、この化合物の構造に基づいて新たに合成され、その後三菱ウェルファーマ（現・田辺三菱製薬）等で開発が行われた。 腎移椊および多発性硬化症に対する治験が行われ、現在は多発性硬化症治療薬として発売されている。アメリカ合衆国では2010年9月、日本では2011年11月28日に発売された。 米ヴァージニア・コモンウェルス大学のSarah Spiegelらは、フィンゴリモドがヒストン脱アセチル化酵素を抑制し、過去のトラウマ的な体験の記憶を根こそぎ消し去り、患者が恐怖症や摂食障害、性的な悩みなどを克朊できる可能性を示唆する研究を行った。　←→恐怖記憶関連薬剤　参考1

  酪酸ナトリウム Sodium butyrate：SB ES細胞の自己増殖を促進する。 細胞増殖を停止させ細胞分化を誘導する。 酪酸ナトリウムを投与したMCAOラットの虚血脳で、はBDNF-TrkBの経路を遮断することによって神経新生を更新させる。

  →バルプロ酸 気分安定薬、抗てんかん薬 頭痛予防薬、神経障害性疼痛治療薬

Pain Relief