■基礎の基礎

│発生と進化│

■新研究

←→神経の発生/大脳皮質/原基/幹細胞/皮質板形成/エピジェネティックス/マウス

　　→胚期/細胞周期
　←→興奮性ニューロンの発生/抑制性ニューロンの発生

神経系の進化

• 海綿動物・平板動物は神経系を持たない。それ以外の動物門は、それぞれに独特の神経系を持つ。神経系の発達は、体制の発達を考えた場合に、一つの高等さの指標となる。
• 散在神経系 - 神経細胞が体表にあり、分散型のネットワークを形成する。中枢神経が分化しない。（クラゲなどの腔腸動物）
• 集中神経系
  • 管状神経系 - 中枢神経系は背面中央に１本あり、管状。前方部分が脳に分化するものが多い。（ヒトなどの脊椎動物を含む脊索動物）
  • はしご形神経系 - 中枢神経系は腹面左右に1本ずつあり、各体節ごとに神経細胞が集まってその両者を連結する神経節が存在する（昆虫類などの節足動物、環形動物）。節足動物の昆虫などでは、頭部と胸部の神経節が発達して脳を形成する。
  • かご形神経系 - 神経細胞が頭部に集まって神経節をつくり、その他の部位では、はしご状に連絡する神経索が存在する（プラナリアなどの扁形動物）。
  
  

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  前核 pronucleus 多細胞動物において，減数分裂によってできた卵の核および精子の核が，合体を起すまでの間

  透明帯 zona pellucida 哺乳類の卵母細胞の細胞膜を取り囲む糖タンパク質のマトリックス 透明帯が精子と結合して、先体反応（acrosome reaction）を開始させる。 子宮へ移動中の胚が卵管の壁に付着することを防いでいる。 子宮に着床する際には胚は透明帯を破り「孵化」する必要がある。 透明帯を除去した受精卵にレンチウイルスベクターを感染させると、約7割の胎仔および胎盤に遺伝子が導入される。ゲノムの複数の箇所に1コピーずつが組み込まれる。

  卵黄囊 Yolk sac、Vitelline sac、Saccus vitellinus 胎生期初期にみられる、卵黄を包む袋状の膜 ヒトでは発⽣第2週の2細胞期胚に形成される。下胚盤葉から胚盤胞腔へ細胞移動による⼀次卵⻩嚢と⼆次卵⻩嚢 ヒトの卵黄嚢では、魚類などと違い嚢内に卵黄はなく、液が入っている。臍小胞 umbilical vesicle とも呼ばれる。 受精の後、胚の体外に卵黄嚢が形成されるが、それを包み込む組織の一部の細胞が増殖し、血島と呼ばれる細胞集団が生じる。 卵黄嚢の血管形成にFz5が関与する。 血島は随所に生じ、これら同士が融合することによって、血島の外周に位置していた細胞群は血管の細胞となり、内側の細胞群は血球（原始赤芽球）となる。 子宮外電気穿孔法では卵黄囊の外側から電気パルスを与える。

  
  

  内胚葉 endoderm：胃の内膜、消化管、肺

  中胚葉 mesoderm：筋肉、骨、血液、泌尿生殖器 間葉 Mesenchyme、間葉系結合組織 主として中胚葉から発生した胚内の未分化の疎性結合組織の一種 間葉は、個体発生のごく初期に生じる非上皮性組織で、突起によって連絡し合って細網線維細胞および未分化細胞の緩やかな集合体とその間を満たす細胞間物質によって形態学的な特徴としている。 間葉細胞は、骨、軟骨、リンパ系、循環器系などの結合組織に発展することができる。 間葉系幹細胞 Mesenchymal stem cell：MSC　参考1 中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞 骨髄液の中に間葉系幹細胞が約0.1%程度含まれている。 間葉系に属する細胞への分化能をもつ。 採取する組織により特性が異なるため、採取する組織ごとに骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞などとも呼ばれる。 間葉系幹細胞と近縁な関係にある成体内の前駆細胞が、内胚葉由来・中胚葉・外胚葉のいずれにも分化できる「多能性」を備えていることが報告されている。 マウスをモデルにした研究で、発生過程で最初に生じる間葉系幹細胞の一部が、体幹部の神経上皮に由来している。* 骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。 間葉系幹細胞は組織再生や免疫調整等の作用を有し、さまざまな疾患への臨床応用が試みられている。 日本国内では、造血幹細胞移植後の急性移植片対宿主病（graft-versus-host disease：GVHD）を適応とする再生医療等製品として、2015年に他家骨髄由来MSC（テムセル®HS注，JCRファーマ株式会社）が製造販売承認され、2018年には、外傷性脊髄損傷に対する再生医療等製品として、自家骨髄由来MSC（ステミラック®注＠ニプロ株式会社-札幌医大）が製造販売承認された。 東京女子医科大学の岡野光夫教授らは、間葉系幹細胞を静脈内投与すると、間葉系幹細胞の表面にあるたんぱく質が周辺の血液を固めて、血栓を生じさせるため、肺塞栓を引き起こしやすくなることを実験的につきとめた。 脂肪由来幹細胞 bone Adipose derived stem cell：ASC 脂肪組織中に含まれる間葉系幹細胞 ASCは高い分化能を有し、様々な治療分野での利用が研究されている。脂肪組織中に大量に存在することから、成人の間葉系幹細胞源として期待されている。 脂肪組織は大量のMSCを含むとともに、脂肪組織から樹立したMSCは増殖が速く細胞活性も高いため有望な細胞ソースと考えられている。 脂肪組織由来MSCを利用した基礎研究、前臨床試験は、血行再建、心筋再生、軟部組織修復、尿失禁、抗炎症、免疫療法（組織片対宿主病、腎障害、肝障害、膠原病など）、造血支持療法などの分野で進められていて、有望な結果が報告されている。 脂肪組織の中には、多能性幹細胞（Muse：Multilineage-differentiating stress-enduring）が他の組織よりも豊富にあることが判明している。 骨髄由来幹細胞 bone marrow stem cell：BMS 骨髄に含まれる間葉系幹細胞 骨格筋や心筋などの中胚葉由来の組織に分化する能力を持っている。 骨髄間質細胞が分化誘導されることにより、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）になる。 最近では、さらにグリア細胞（外胚葉由来）、肝臓（内胚葉由来）など、中胚葉性でない組織にまで分化できる可塑性を持っていることが示されている。 札幌医大とニプロは自己骨髄由来幹細胞を脊髄損傷患者の静脈内に点滴する再生医療を始めた。

  外胚葉 ectoderm 表層外胚葉 皮膚、爪、毛、乳腺、皮膚腺、歯のエナメル質など 神経外胚葉 神経堤 脳神経系、感覚神経系、副腎髄質など 神経管 中枢神経系、網膜、松果体、下垂体後葉など 神経デフォルト説　neural default hypothesis　←→Fate−restricted progenitor説 未分化外胚葉細胞は外部から何もシグナルを受け取らなければ神経化するという仮説 アフリカツメガエルのアニマルキャップ（初期胚の未分化細胞からなる細胞集団）をバラバラにすると、BMPシグナルが薄まるために、細胞同士の相互作用が失われて細胞は神経化すると推測された。 しかしその後の研究から、原腸形成期の外胚葉細胞では神経誘導因子の作用を受ける時期に細胞内でERK（MAPキナーゼ）があらかじめ活性化されていて、このことが神経化に必須であることが明らかとなった。実際にFGF8が原腸形成期に発現している。FGF/ERKシグナルが活性化している細胞は神経以外にも分化するため、FGF/ERKシグナルは直接細胞を神経化する因子というわけではないが、細胞に神経化する能力（反応場）を持たせるという意味では重要である。 また、原腸形成期の細胞があらかじめ発現している遺伝子の組み合わせも神経化に重要である。このように、神経誘導因子を受けて神経化するためには細胞に一定の条件、つまり「誘導因子に対する反応能」が必要であり、この細胞の特質のことを「コンピテンス」と呼ぶ。したがって、「神経デフォルト説」はこのコンピテンスの成立が前提となっている。 コンピテンシー 狭義にはシグナルへの応答性・感受性 細胞が特定のシグナルに応答できるようになり、もっている能力を発揮することができる状態になっていること コンピテンス　competence 細胞の内部状態 一般に特定の細胞運命決定には、周辺組織からの「誘導（induction：誘導因子による細胞外部からの制御）」と、受け手細胞の「コンピテンス（competence：細胞の内部状態）」が一致しなければならない。 神経誘導の場合、両条件が一致するのは発生期では原腸形成期前後のみであり、これが神経誘導が胚発生の一時期にしか起こらないことの理由である。

  原始線条、原条　Primitive streak 鳥類や爬虫類、哺乳類の胚発生初期の胞胚に現れる線条 動物の発生初期に、将来の体細胞を形成するエピブラストが増殖しながら左右両側から細胞移動することによって，胚の後方に形成される線状の窪み構造 原始線条は左右対称性を確立し、原腸陥入が起こる場所や胚葉形成の開始の決定に関与する。 原始線条は正中線を通って拡張し、左右と頭尾の体軸をつくるとともに、原腸形成の合図になる。このプロセスは中胚葉前駆細胞の入り込みと移動を含む。 原始線条を通過したエピブラストが胚の内部へと侵入し将来の内胚葉と中胚葉を形成する一方で，陥入せずに残った細胞が外胚葉の元となるとされる。

  
  
  

  神経板 neural plate 脊索動物の胚発生初期において、胚の背側に形成される肥厚した組織であり、中枢神経系の原基 マウス胚の神経板はE7.5以降、転写制御の異なるいくつかの領域に分かれて発生する。最前部神経板は、Hesx1遺伝子の活性化で特徴付けられる。 神経板→神経ヒダと神経溝→神経管、頂上部分が神経提

  神経管 neural tube 脊椎動物の発生過程において形成される外胚葉性の管状構造物 脳および脊髄の原基：中枢神経系は神経管として形成され、体の前後軸に沿ってのびる。 外胚葉に由来する板状の神経板がダイナミックに形態変化することで形成される。 発生初期に、領域特異的に発現する分泌性因子やその下流で働く転写制御因子の作用により細胞運命が決定され、様々な種類のニューロンやグリア細胞が神経管の前後軸・背腹軸に沿って生み出される。 E8.5〜10.5に、神経上皮細胞で構成される神経ヒダの両端が立ち上がり、屈曲・近接し、融合することにより形成される。 神経幹細胞の分裂は神経管の前部で他の部位よりも激しいので、その結果、神経管の前部だけが膨れることになる。 神経板と表皮外胚葉との境界付近の隆起（neural ridge）や神経板正中に神経溝（neural grove）が形成されることで、管構造の形成が開始される。神経板を構成する神経上皮細胞の頂端側に豊富に存在するアクチン細胞骨格が収縮することで神経板に歪みが生じ、神経板が湾曲する。その後、神経板の左右の隆起が癒合することで、神経板は表皮外胚葉から最終的にくびれ切れ、管状の構造へと変化する。このような発生様式は、一次神経形成 (primary neurulation) と呼ばれている。 神経管の膨れた部分が将来の脳であり、それ以外の部分が脊髄になる。神経管の内側の空洞は、成体になっても残され、脳の中の脳室、脊髄の中の中心管となる。 神経管閉鎖障害　Neural tube defects：NTDs ヒトでは、妊娠4〜5週の時期に神経管がうまく形成されず一部分がふさがり脳や脊髄の機能に異常をきたす膝下軟 神経管の下部がきちんと作られない場合「二分脊椎症」、上部に異常が現れる場合「無脳症」を発症する。 TET1

  神経提 neural crest 神経管の背側に形成される末梢神経の原基 Wilhelm Hisは脊髄後根神経節細胞の由来を調べる研究において、1868年にニワトリ胚の表皮外胚葉と神経上皮に介在する細胞群を神経節原基として同定し、間索（Zwischenstrang）と呼んだ。 神経提細胞が移動・分化・増殖してメラノサイト、後根神経節細胞、自律神経節細胞となる。 後根神経節にある神経細胞は、発生中に神経管の背側に形成される神経堤から細胞が両側に遊走した後分化する。神経節に定着した細胞からは、二本の平行した神経突起が出るが、その突起は間もなく二方向にそれぞれ伸びることとなる。一方の突起は脊髄に向かい後根を形成しながら脊髄内へ進入し、脊髄髄質で種々の中継核に接続する場合が多いが、中継なしに後索を上行する線維もある。他方の突起は逆に伸長して、皮膚に終わったり、種々の感覚器と結合する。こうして、末梢の感覚神経が脊髄に運ばれる情報の中継点として、後根神経節の細胞が機能することになる。 交感神経の発生では、まず神経堤細胞が脊髄の両側に沿って移動し、そこに交感神経幹を作る。交感神経幹から器官に投射するニューロンが起こるが、腹腔神経節、上下の腸間膜神経節は器官と交感神経幹に介在する神経節として存在する。）交感神経幹ができた後に白交通枝ができて脊髄と連絡する。 副交感神経系の発生では、中枢神経系から節前線維がまず発生する。これが器官に枝を伸ばしてできる（節後ニューロンは器官の神経叢に起こる）。 神経堤に由来する細胞の中にTrkAをもつものがあって、それが神経成長因子NGFの標的になる。

  発生中 神経管の膨れた部分が将来の脳であり、それ以外の部分が脊髄になる。神経管の内側の空洞は、成体になっても残され、脳の中の脳室、脊髄の中の中心管となる。 神経管の頭部レベルでは、形態的なくびれにより、前脳胞 prosencephalon、中脳胞 mesencephalon 、および菱脳胞 rhombencephalon からなる一次脳胞が形成される。前脳胞の側方部では、将来の網膜になる眼胞が突出する。 前脳胞は、終脳 telencephalonと間脳 diencephalonに細分化され、その後、眼胞は脳からくびれ切れる。 前脳は前方と後方の２つに領域化され、後方は間脳と呼ばれ、さらに前視床・視床・視蓋前野の3つの領域に分割される。 前視床と視床はzona limitans intrathalamica：ZLIによって区切られている。 zona limitans intrathalamica：ZLI 間脳の前視床（腹側視床） prethalamus と視床 thalamus を区切る境界構造 表面の横方向の収縮によって生じた、間脳の神経管を横断する脳室隆起 ZLIは前方化因子と後方化因子が交差し互いに抑制しあう領域に生じると考えられている。 ZLIはHes1、Hes5がないいと構造自体が失われる。 FezおよびFezlを共に欠損したマウスでは、前視床やZLIの完全な欠損、視床の萎縮といった顕著な異常が見つかった。 発生が進むと、神経管は峡部 (isthmus) と呼ばれる中脳・菱脳境界の背側部での形態的くびれが特に明瞭になり、中脳を境に神経管が腹側に大きく屈曲する。菱脳の後方部においても神経管は腹側に屈曲し始める。菱脳の背側領域（蓋板に相当する）は薄い単層の上皮組織からなり、他の神経管領域における蓋板に比べ特殊化している。さらに発生が進むと、菱脳胞は後脳（metencephalon）と髄脳（myelencephalon）に細分化され、5胞脳からなる二次脳胞が形成される。この時期までに、神経管の後脳・髄脳境界付近では神経管は背側に著しく屈曲する。終脳胞の背側領域からは将来の大脳が形成され、腹側領域からは将来の大脳基底核が形成される。間脳からは視床、視床下部が派生し、後脳からは橋（pons）および小脳 (cerebellum)、髄脳からは延髄が形成される。 菱脳胞　rhombencephalon 脊椎動物の脳の発生途上、神経管上端部に生じる三個の膨大部の最後部 やがて前後に後脳と髄脳とに分化する。 後に菱脳の前部からは小脳と橋、後部からは延髄が分化してくる。 菱脳の内腔は第四脳室と呼ばれる。えらに関係する神経が出入りして菱形に膨らんでいるために菱脳の名がある。 哺乳類以外の菱脳の腹側表面には，哺乳類にみられる大脳皮質と関係した橋の基底部，錐体などは認められない。 各機能区域は生活様式と関連して変異を示す。 菱脳は種に関係なく7〜8個の菱脳分節 (rhombomere) からなる。

  
  

  フロアープレート、底板　floor plate：FP 底板とは脊髄尾部から吻側の中脳にかけて、神経管の腹側正中部に形成されるグリア細胞から成る組織 脊椎動物の発生期において、中枢神経系のパターン形成に関わる分泌因子や接着因子を発現することで、脊髄の運動ニューロンに代表される神経管腹側で生まれる神経細胞の分化誘導、底板で正中交差を形成する交連ニューロンの軸索ガイダンス、さらには小脳前核神経細胞などの底板付近での細胞移動に重要な役割を果たしている。 胎児期に神経軸索は誘引分子と反発分子の働きにより標的細胞へ誘導され神経回路が形成される。Ramón y Cajalは、胎児脊髄において背側に位置する交連神経細胞の軸索が腹側へ伸張するのは腹側正中部に存在するフロアープレート細胞から分泌される化学物質が交連軸索を誘引するためだという化学向性説（chemotropic theory）を提唱した。

  交連ニューロン　commissural neuron　←→交連線維 交連ニューロンはより遅く産まれるニューロン群であり、そのほとんどが大脳皮質II/III層に位置し、一部はV層、VI層にもみられる。 交連ニューロンは皮質形成期を通じて産生される。VI層に位置する交連ニューロンはマウスではE (embryonic day)12.5に、V層に位置する交連ニューロンはE13.5に産まれる。しかしほとんどの交連ニューロンは浅層に位置し、これらはE15.5-E17.5に産生される。この様に交連ニューロンの産生が大脳皮質発生過程のほとんどの時期にわたることは交連ニューロンが広汎な神経前駆細胞から生み出されることを意味するのみでなく、進化過程で大脳皮質の増大と交連ニューロンの産生量が増えることが関連していることを示唆している 哺乳類の浅層ニューロンは基本的に脳室下帯：SVZから産生され、霊長類では内側脳室下帯と外側脳室下帯とに分けることができる。ヒトではとくにSVZが著しく拡張されて外側脳室下帯となり、交連ニューロンの数を更に増大させることで、皮質全体のサイズ、神経回路やニューロン種の複雑さを作り、脳機能の発達の進化発生学的原因となっている可能性がある。

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パターン形成　pattern formation または patterning　←→記憶のパターン分離

• 分化した細胞が正しく配置され、機能的な器官や個体が作られる過程
• 生体中で異なる細胞集団が幾何学的に一定の規則をもって配置されるとき、そのような配置の様式（パターン）が形成されること。成体における体表の模様や体節動物の各体節における付属物の配置、さらに広くすべての動物の体制をパターンとみなすことも可能である。
• パターン形成は生物のからだの成り立ち考える上で最も重要な概念と言える。
• 生物種ごとに体の大きさや形が異なっているのを見ても分かるように、パターン形成のプログラムはゲノムに書き込まれている。
• Notchシグナルはパターン形成にかかわる。
• 脊椎動物のHox遺伝子群も体軸に沿ったパターン形成にかかわることが明らかになっている。

モルフォジェン、モルフォゲン　morphogen　参考1

• 多くの器官では特定の因子の濃度勾配を位置情報として用いていると考えられていて、濃度依存的に細胞の発生運命を決定する物質をモルフォゲンと言う。
• 発生、変態、再生の際に局在する発生源から濃度勾配を持って発せられ、形態形成を支配する物質である。発生源の近くの組織で高濃度に達したり、時には長く持続したりして空間的情報を与える。
• シグナル分子の濃度勾配依存的に組織内の細胞に位置情報を与える仕組みであり、動植物の組織パターン形成において必須の役割を果たす。
• モルフォジェン研究の歴史は古く、1950年代から70年代にかけてTuring、Wolpert、クリックらによって概念的な土台が築かれた。
• ヒト胚やその後のショウジョウバエ胚といったほとんどの発生系で、シンシチウムは（骨格筋のように）まれであり、モルフォゲンは一般的に分泌されたシグナルタンパク質である。これらのタンパク質は膜貫通受容体タンパク質の細胞外ドメインに結合し、シグナル伝達の産生過程をモルフォゲンのレベルを核へ通信するために使用する。
• Decapentaplegic、Hedgehog、Wingless、Notch、EGF、EGFといった少数の相同性のタンパク質は、多くの種でよく知られたモルフォゲンである。
• モルフォゲンは化学的ではなく概念的に定義されるものであり、レチノイン酸のような単純な化学物質がたびたびモルフォゲンとして作用する。

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マウス　←→ヒトの皮質形成過程/皮質の発生/神経新生/分子マーカー/マウス　参考1

• マウス着床前胚は受精後、2細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、morula、blastocystと、卵管から子宮へと移動しながら発生し、受精後4.5日で子宮に着床する。
• これらの胚は簡単な操作によって卵管あるいは子宮から回収ができ、そのままblastocyst後期までin vitroで培養が可能である。
• 受精後2.5日胚までは卵管から回収でき、これ以降の時期の胚は卵管から子宮へと移行していため、回収は子宮の灌流によっておこなう。
  
  

  E0.5：1-cell, 受精卵 Fertilized egg

  E1.5：2-cell stage embryos ラミニンの発現

  E2.0：4-cell

  E2.5：8-cell　卵管から回収できる。 Oct3/4およびCdx2のdouble positiveな細胞集団から、single positiveな多能性細胞（Oct3/4-positive）および栄養外胚葉 (Cdx2-positive)の２種類の異なった細胞種が出現する。 少し遅れて、NanogおよびGata4により内部細胞塊および原始内胚葉が運命付けられる。

  E2.5：桑実胚, morula, 8-16-cell E2.75：early morula, compacted 8-cell E3.25：late morula, 16〜32-cell

  E3.5：胚盤胞, blastocyst, 32〜64-cell 　栄養外胚葉＋内部細胞塊 胚は内腔を生じ、胚盤胞を形成する。 栄養外胚葉と内部細胞塊の分化には1対の転写因子、Cdx2とOct3/4が重要な役割を果たしている。 桑実胚のうち、内側の細胞が内部細胞塊となり、外側の細胞の大部分は栄養芽細胞となり、栄養外胚葉を形成する。 胚盤胞 blastocyst　←→胚盤胞補完法（neural blastocyst complementation；NBC） 卵割腔形成後から着床前の胚形成初期に形成される構造 生物の初期発生過程において卵割が起きてから着床前の胚形成初期に形成される構造であり、ヒトの場合、70〜100個の細胞を含有する塊より生じる。 内部細胞塊あるいは胚結節を持ち、外側に外細胞塊あるいは栄養芽細胞が形成される。 発生初期の胚盤胞期胚にES細胞を注入すると、全身の一部の細胞が注入したES細胞に由来するキメラマウスが得られる。 内部細胞塊 inner cell mass：ICM 哺乳類の早期胚発生において、胚盤胞の内側に形成される細胞集団 内部細胞塊は身体のあらゆる細胞に分化する多分化能がある。 着床前胚において見られる未分化細胞集団 ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊から樹立された。 内部細胞塊の細胞を単離し、フィーダー細胞上で培養すると多能性を持ったES細胞が得られる。 受精後の最初の細胞系列の決定にTet1が重要な役割をはたす。 Tet1は着床前初期胚において核に局在し、胚盤胞期にはおもに内部細胞塊に発現する。 内部細胞塊から樹立されるES細胞の維持にTet1が必要 内部細胞塊は胚盤葉上層と原始内胚葉の2層に分離し、二層胚盤 bilaminar germ disc と呼ばれる構造を形成する。 マウスでbrachyuryは胚盤胞の内部細胞塊、続いて原始線条で発現する。 栄養芽細胞 trophoblast 内部細胞塊の外側の細胞の大部分は栄養芽細胞となり、栄養外胚葉を形成する。 栄養外胚葉 trophectoderm：TE 内部細胞塊と胞胚腔を覆うように胚盤胞の外部に存在する細胞 胚盤胞の外側を構成し、内部細胞塊と胞胚腔を取り囲むように存在する。 栄養外胚葉は将来胎盤や胚膜へと分化する。 Cdx2single positive Bre1・ノックアウトは初期発生に異常が生じ、E3.5までに致死

  E4.5：late blastosyst, 64〜128-cell 　栄養外胚葉＋内部細胞塊（原始外胚葉 primitive ectoderm　＋原始内胚葉 primitive endoderm：PrE 子宮に着床 implantation pluripotent epiblast vs. primitive endoderm salt-and-pepper distribution of cells fated to form (Nanog-positive) EPI or (Gata6/Sox17/Gata4-positive) PrE (∼64-cell stage)　参考　1 原始外胚葉 primitive ectoderm 分化多能性を維持し、将来胎仔を形成するすべての細胞の源となる。 エピブラストになる外胚葉 pluripotent epiblast：EPI　←→多能性幹細胞/エピブラスト幹細胞 Nanog-positive　＠salt-and-pepper 原始内胚葉 primitive endoderm：PrE 内部細胞塊の割腔に面した表面の細胞 内部細胞塊の内部に分化出現し、その後内部細胞塊の最外層に移動（sorting）して内部細胞塊を取り巻く単層の細胞層を形成する。 Gata6/Sox17/Gata4-positive　＠salt-and-pepper 原始内胚葉は胚体外の層であり、胚体の細胞は作らず卵黄嚢を形成する。 原始内胚葉はやがて一部の細胞は胚本体から離れた部分の栄養外胚葉層の内側へ遊走しながら移動して、遠位壁側内胚葉細胞となり、細胞外マトリックスを分泌してライヘルト膜をつくる。一方、胚体部分の近くの原始内胚葉細胞は前側臓側内胚葉と呼ばれる細胞層をつくる。これらはすべて胎仔本体を保護して栄養物や老廃物を母体との間で交換供給するための支持組織である。 ライヘルト膜 Reichert's membrane 胎盤形態形成中に栄養外胚葉の内面上に形成され、遠位壁側内胚葉によって分泌される非血管外胚基底膜 母体間の栄養素交換に必要であり、胚後発育に重要である。 壁側内胚葉細胞と栄養膜細胞との間の厚い多層基底膜

  E5.5〜7.5：胚盤葉上層期 epiblast期 　胚体外外胚葉　extra-embryonic ectoderm　＋胚体外胚葉　embryonic ectoderm　＋胚体内胚葉 胚体外外胚葉　extra-embryonic ectoderm マウス着床後胚においてエピブラストに隣接して存在する将来胎盤へと分化する組織 BMP4タンパク質を分泌し、隣接するエピブラストから生殖細胞を形成させる重要な役割を担っている。 胚体外胚葉　embryonic ectoderm ＝胚盤葉上層 epiblast 　←→エピブラスト幹細胞　参考 発生初期に現れる、すべての体細胞と生殖細胞の起源になる一層の上皮細胞 内部細胞塊→原始外胚葉由来 原始外胚葉の内側の細胞は細胞死を起こし、胎仔側の原始内胚葉である臓側内胚葉と接する一層の上皮様の構造、胚体外胚葉を形成する。 胚盤葉上層からは胚体と羊膜が形成される。 原始外胚葉からの着床後エピブラスト細胞の発生には、DNAメチル化やX染色体不活化を含む、大幅な遺伝子発現の変化やエピジェネティックな変化が関与するが、これはロバストにエピジェネティックな障壁を作り出し、細胞が原始外胚葉様の状態に逆戻りすることを防いでいる。 LIF–STAT3シグナル伝達に不応性であるが、アクチビン/FGFに反応して、自己複製するエピブラスト幹細胞を形成する。 エピブラスト幹細胞は胚盤葉上層細胞に不可欠な特性を示し、原始外胚葉に由来するES細胞とは異なっている。 LIF反応性の未分化神経幹細胞が存在　参考H 臓側内胚葉 visceral endoderm 遠位臓側内胚葉 Distal visceral endoderm：DVE P5.5に子宮から最も遠い位置に存在する数個の内胚葉細胞の集団 P5.5には最も遠位の臓側内胚葉が肥厚し、将来の前方へと移動する。 Rosa Beddingtonらのグループが、マウス卵筒胚の遠位端にある遠位臓側内胚葉の細胞集団が一側方向へ移動し、移動した側が胚の前方（頭側）になることを明らかにした。 前側臓側内胚葉：AVEはDVEが前方へ移動したものであると考えられてきたが、AVEはDVEと異なる細胞系譜をもつことが明らかになった。DVEはAVEの前方移動をガイドするために必要とされる。　参考 Nodalシグナルは臓側内胚葉細胞の増殖を促進することでDVEが移動する原動力を与えていて、その拮抗阻害因子であるLefty1とCerlは将来の頭部側のDVEでNodalの活性を非対称的に抑制することにより、移動の方向を決定する。　参考 ノーダル nodal 細胞へシグナルを入れる分泌性のタンパク質 左右の決定では、左側決定因子として働く。 頭尾の決定においては、細胞分裂を上昇させる活性を持つ。 レフティ lefty ノーダルシグナルが細胞へ入るのを抑制する因子 レフティもサール Cerlもノーダルの活性を抑制する働きを持つ因子 頭尾決定の局面ではレフティ１、左右決定の時にはレフティ１とレフティ２の両者が働く。 前側臓側内胚葉、前方臓側内胚葉 anterior visceral endoderm：AVE さまざまな遺伝子が発現していて、胚体部分に頭部誘導シグナルを与え、前後軸が形成し、頭部を誘導する。 AVE細胞に発現するHex、Hesx1、Otx2、Lim1遺伝子は、正常な前脳形成に必須である。 AVEは遠位臓側内胚葉：DVEが前方へ移動したものであると考えられてきたが、AVEはDVEと異なる細胞系譜をもつことが最近明らかになった。 AVE細胞は両生類の頭部オーガナイザーと同様に、CerberusやDkk1 を発現する。Cerberusは後方から分泌されるNodalによって、前方に原始線条が形成されないように抑制的に働く。 遠位壁側内胚葉 distal parietal endoderm

  E6.5：原腸形成期 始原生殖細胞は胚体外胚葉の最も近位部の後部側から生じ、原腸陥入に伴い、胚体外中胚葉尿膜基底部においてクラスターを形成する。 始原生殖細胞　primordial germ cell　←→germinal zone 精子及び卵子の源となる細胞 マウスにおいては胚齢6.5日前後にBMP4タンパク質の作用を受けてエピブラストから分化する。 その後、生殖巣へ移動し、生殖巣内の体細胞からのシグナルを受け、精子、もしくは卵子へ分化していく。 霊長類において、始原生殖細胞がいつ、どのように形成されるかは全くわかっていない。

  E7.0〜E8.0 　胚体外外胚葉＋胚体外胚葉＋胚体外中胚葉　＋始原生殖細胞 NestinやSox1が検出される。

  E7.5：神経板形成 神経上皮細胞にHes1 およびDll1が発現するが、Hes5 の発現は認められない。

  E8.5〜10.5 神経管形成ー拡大再生産期 FGF2に反応性の増殖性の神経幹細胞へ分化する。 Notchシグナル経路を構成する全ての遺伝子と、Hes1/Hes5が発現 brachyuryは中胚葉形成、および脊索分化、前肢芽後側形成に関わる。

  E10.5：脳胞期、約30体節期

  E11：ニューロン分化期、発生中期 マウスではE11頃からプレプレートは出現する。 ニューロンが産み出される。

  E12〜14　＝皮質形成初期〜中期 皮質神経細胞の最初の集団（マウスのE12日に産生された集団）は、明確な多極性細胞からロコモーションへの転換をせずに移動が達成される。この時期の移動には足場としての放射状線維は必要としない。皮質形成初期〜中期（マウスのE12〜14）に誕生した一部の皮質神経細胞は多極性細胞を経ずに細胞体トランスロケーションにより脳室帯から辺縁帯直下に至ることが観察されている。 E13日頃から辺縁帯とサブプレートの間に皮質板と呼ばれる神経細胞層が同定できるようになる。 胎生期のオリゴデンドロサイト前駆細胞：OPCの出現する。　＠オリゴデンドロサイトの発生

  胎生12.5日　E12.5 子宮外電気穿孔法で遺伝子導入が可能 内側基底核原基由来の介在ニューロンはマウスではE12.5日頃に大脳皮質の外側部から侵入する。

  E13.5 子宮内電気穿孔法で遺伝子導入が可能

  E14：１次歯状回神経上皮細胞に、顆粒細胞を生み出す神経前駆細胞が出現　←→顆粒細胞の発生

  E15 皮質形成後期（マウスの胎生15〜16日目）になると、脳室帯に直接由来する神経細胞と、脳室下帯でさらに分裂する集団での移動様式の違いが明確になってくる。

  E16 網膜のTypeⅠアストロサイトが出現する。

  E17：グリア形成期、胎生後期? オリゴデンドロサイトが産み出される。

  （胎生後期〜）生後 アストロサイトが産み出される。

  
  
• 発生の過程では、神経管から脳および脊髄が形成される。
• 神経系の発生を特徴づける次の段階は、神経細胞が本来あるべき正しい位置に配置され、それぞれの神経細胞が正しくシナプスで結合することである。
• 大脳などの皮質構造をなす場所では、神経細胞は層状に配置され、また神経核においては、細胞が集合する。
• 神経細胞からは、軸索および樹状突起が伸長し、神経回路形成が行われる。
• 神経発生の初期に形成される神経堤という領域は、末梢神経系のニューロンやグリアを生みだすばかりでなく、頭部においては硬組織や血管平滑筋、血管周皮細胞などを形成するといった多様な分化能を有する。

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ヒトの皮質形成過程　　←→ マウス/皮質の発生/神経新生/分子マーカー/神経細胞の遊走

神経胚形成 　Primaryneurulation：胎生3-4週

終脳発達　Telencephalic development：胎生2-3ヶ月

神経細胞増殖　Neuronal proliferation：胎生2-4ヶ月

神経細胞遊走　Neuronal migration：胎生2-5ヶ月

組織化　Organization：胎生5ヶ月〜生後

髄鞘化　Myelination：周生期〜生後

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生後　参考1/1

• juvenile　少年期　(PND 21＝3w)
• adolescent　思春期　(PND 35＝5w)　
• early adult　(PND 56＝8w)

  ヒト	マウス
  23〜32週	PND1〜3	脳の分画化/オリゴデンドロサイトの成熟期/免疫系の発達/血液脳関門の形成
  36〜40週	PND7〜10	脳の成長のピーク/免疫系の確立/グリア形成のピーク/樹状突起、軸索突起の密度の増加/免疫系の確立
  juvenile　少年期　(PND 21＝3w)
  2〜3歳	PND20〜21	脳重が成体の90〜95%に達する/シナプス密度は成体の50%/ミエリン化のピーク/神経伝達物質の受容体の交換
  4〜11歳	PND25〜35	前頭皮質のネットワーク形成/灰白質のボリュームと皮質の厚さのピーク
  adolescent　思春期　(PND 35＝5w)
  12〜18 歳	PND35〜49	シナプス密度は成体のレベルへと減少/認知発達回路の改善/ミエリン化/白質量の増加/分画の異方性
  early adult　(PND 56＝8w)
  20歳+	PND 60+	神経伝達物質は成体のレベル/シナプス密度は成体のレベル/ミエリン化/灰白質の減退

  
  

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胚盤胞補完法 neural blastocyst complementation；NBC　←→胚盤胞　参考1/2 臓器がない（つくられない）特殊な環境を動物体内に誘導し、この空間を多能性幹細胞の増殖・分化の場として活用し、多能性幹細胞由来の臓器を形成させる方法 遺伝的改変マウスは一般に、多能性胚性幹（ES）細胞を野生型宿主の胚盤胞に顕微注入してキメラの子孫を作製することにより得られ、改変対立遺伝子の生殖系列への伝達やホモ接合性の確保には交配が必要である。 RAG2欠損マウスを使う胚盤胞補完法は免疫系の研究を促進するための手法である。RAG2欠損マウスはV(D)J組換えが起こせないので、B細胞系譜もしくはT細胞系譜の細胞は前駆細胞段階から分化が進まない。RAG2欠損胚盤胞に十分量のRAG2を持つドナーES細胞を注入すると、成熟リンパ球の全てがドナーES細胞由来である体細胞キメラマウスが生じる。この方法により、成熟リンパ球でマウスの発生にもっと広く必要とされる遺伝子の機能解析が可能になる。胚盤胞補完法：NBCの応用は膵臓の器官形成にまで広がっていて、他の複数の組織や器官の作製にも用いられている。　参考1/ In Vivo Genetic Ablation by Cre-Mediated Expression of Diphtheria Toxin Fragment A　参考1/ 特定の前脳領域の発生や機能を調べる胚盤胞補完法：NBC 発生の間にジフテリア毒素サブユニットAを使い、宿主由来背側終脳前駆細胞を標的として除去する。この除去により、前脳が存在しない空のニッチが作り出され、これは大脳皮質や海馬の無形成につながる。 ジフテリア毒素サブユニットAを用い前脳特異的ターゲティング処理を行った胚盤胞へドナーES細胞を注入すると、ドナー由来の背側終脳前駆細胞が宿主胚中の空のニッチに生着できるようになり、新皮質と海馬が生じる。 背側終脳特異的遺伝子Emx1のプロモーターの制御下にCre組換え酵素を発現するEmx1-Creマウス Emx1-Cre; R26-DTA blastocystsのDTPsを ablation してforebrainを空にし、donor ESCを注入すると、脳が再構成される。 Emx1-Cre; R26-DTA mice dorsal telencephalic progenitors：DTPs これらは学習と記憶形成に関して形態学的および神経学的に正常である。 ダブルコルチン：DCX欠損ES細胞（CRISPR–Cas9法により作製）を用いて作られたNBCキメラは、従来の生殖系列ダブルコルチン欠失マウスの表現型を忠実に再現した。 体性感覚野　層特異的マーカー　II-IV層（Cux1; red）, V層（Ctip2; green）, and nuclei （DAPI; blue） Dcx−/y NBC chimeras Novel Object Recognition (NOR)/Morris Water Maze (MWM) immunofluorescence images of oligodendrocytes (Olig2), astrocytes (GFAP), microglia (Iba1)

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細胞周期 cell cycle　←→関連物質/エレベーター運動/細胞増殖解析法/label retaining法/quiescent　参考1/2

• 1つの細胞が2個（以上）の娘細胞を生み出す過程で起こる一連の事象、およびその周期
• 細胞はその中身を倍加し、その後に2分することで増殖を行う。
• 細胞周期の最も基本的な機能は核内の膨大な量のDNAを正確に複製し、そのDNAを2つの娘細胞に正確に分配することである。
• G0期　→　G1期　→　S期　→　G2期　→　M期　→　G0期
• 細胞の分裂にはタンパク質、細胞小器官の倍加と分離も必要であるが、ほとんどの細胞ではタンパク質と細胞小器官の倍加に必要な時間は、DNAの倍加と分離に必要な時間よりもはるかに長い。
  　→G0期：「Gap phase：間の時期」

  静止/老化 quiescent/ senescen	G0期：Gap 0：静止期 細胞が周期から去った、または分裂を止めている休止期 多くの細胞ではG0期に入ると中心体は細胞膜の近傍へと移動し，母中心子が基底小体となり一次繊毛が形成される。
  間期 Interphase	G1期：Gap 1：合成準備期、DNA合成前期 細胞は大きくなる時期 G1/Sチェックポイントで次のDNA合成への準備ができているかが確認される。 Cdt1タンパク質レベルはG1期に最も高い　＠Fucci Ki67はG1後期からM期に発現している。 ステロイドはG1に働く。
  	S期：Synthesis：DNA合成期 DNAの複製が行われる時期 GemininレベルはS期に上昇　＠Fucci BrdUはS期特異的にDNAに取り込まれる。 S期に発現する抗原：PCNA II型トポイソメラーゼ阻害薬のエトポシドはS期後半及びG2期にある細胞に対し殺細胞作用を示す。
  	G2期：Gap 2：分裂準備期、DNA合成後期 DNA合成から有糸分裂が起こるまでの間、細胞は成長し続ける。 G2/Mチェックポイントで次のM期への準備ができているかが確認される。 リン酸化ヒストンの発現時期は主にG2期とM期に限局している。
  細胞分裂 Cell division	M期：Mitosis：分裂期 有糸分裂と細胞質分裂 細胞の成長は停止し、活動エネルギーは分裂に集中される。 有糸分裂の途中M期チェックポイントで完全な分裂への準備ができているかが確認される。 リン酸化ヒストンの発現時期は主にG2期とM期に限局している。 ビンカアルカロイド系など微小管機能阻害薬はM期に働く。 前期　prophase 染色体が凝縮される。 前中期　prometaphase 核膜の崩壊が起こり、中心体から伸びた紡錘体により姉妹染色体が捕捉される。 中期　metaphase すべての姉妹染色体が赤道面に配置される。 　→成熟促進因子：MPF 後期　anaphase 姉妹染色体がそれぞれ両極に分配される。 　→後期促進複合体：APC/C 終期　telophase 染色体の脱凝縮と核膜の再形成の後、細胞質分裂が完了し、2つの細胞が形成される。

  
  
• 細胞周期はサイクリンとサイクリン依存性キナーゼとの相互作用により調節されている。
• 胎生期の神経幹細胞の細胞周期はどんどん伸びていき、成人の脳では遂に非常にゆっくりとしか分裂しなくなると考えられる。この「非常にゆっくりとしか分裂しない」という性質は、さまざまなタイプの幹細胞において、遺伝子変異のリスクを減らすという意義があるのだろうと推測されている。
• 胎生期では、限られた時間の中で複雑かつ巨大な脳を構築する必要があるため、神経幹細胞は素早く分裂を重ねる。
• 神経幹細胞には分裂回数に限界があり、稀にしか分裂しないことで幹細胞を長期にわたって維持していると考えられている。　参考1
• 胎生期の神経幹細胞で人為的にBre1aの発現を低下させると、神経幹細胞の分化が抑制される。分化の抑制にはHes5の活性化も関与している。
• Bre1aの発現が低下した神経幹細胞では細胞周期が延長して、分裂頻度が低下している。
• 分裂を止めていた細胞が休止期から増殖を開始すると、まずサイクリンDが発現する。サイクリンDとCDK4/6複合体がRbタンパクをリン酸化して不活化して、E2F転写因子をRbタンパクから解放する。解放されたE2FがS期サイクリンであるサイクリンEなどの転写を促進して、S期への進行をすすめる。増殖シグナルがなくなると、サイクリンがユビキチン・プロテアソーム系で分解され、細胞周期が停止する。
  
  
• ラットとマウスの細胞周期（adult SGZ precursors）はかなり違う　参考 (Adult neurogenesis1 P.236, L.10）1

  	rats	mice
  細胞周期	24.7時間	12–14時間
  S期	9.5時間	6–7.6時間
  S期　％	38%	54–63%
  G2/M　％	18%	32–38%

• 神経幹細胞の細胞周期は約12日？
  
  

  細胞周期チェックポイント　Cell cycle checkpoint　←→免疫チェックポイント阻害薬とは無関係 細胞が正しく細胞周期を進行させているかどうかを監視（チェック）し、異常や不具合がある場合には細胞周期進行を停止（もしくは減速）させる制御機構のことである。細胞自体がこの制御機構を備えている。 一回の細胞分裂の周期の中に、複数のチェックポイントが存在することが知られており、これまでにG1/Sチェックポイント、S期チェックポイント、G2/Mチェックポイント、M期チェックポイントの4つが比較的よく解析されている。 この機構は正確な遺伝情報を娘細胞、ひいては子孫に伝達するための、生命にとって根源的な役割を果たしていると考えられており、この機構の異常はヒトなどのがん発生の主要な原因のひとつといわれる。 基本概念は、1988年、リーランド・ハートウェルらにより提出された。 G1からS期への移行の制御 （G1チェックポイントの分子機構）　参考1 G1期の通過とS期への移行はサイクリンD-CDK4とサイクリンE-CDK2複合体が制御している。 増殖刺激によりサイクリンDが合成され，CDK4と結合する。複合体はCAKによりリン酸化され活性化され，次いでRbタンパク質をリン酸化する。Rbがリン酸化されると結合している転写因子E2Fが離れ，サイクリンEなどのS期進行やDNA複製に必要な遺伝子群の発現が誘導される。サイクリンEはCDK2に結合してRbをさらに活性化して自らの発現を亢進するとともに，p27Kip1（CKIの1つ）をリン酸化してその分解を促進する。これらにより，S期への進行が実現する。幾つかの段階で，CKIはS期への移行を抑制する。S期に入るとサイクリンEはユビキチン-プロテアソームで分解される。

  
  

  DNA複製ライセンス化　DNA replication licensing １回の細胞周期で１度だけ染色体DNAが複製される事を保証する機構 ゲノムの安定性を維持するために、DNA複製は1回の細胞周期につき1度だけ起こるように厳密に制御されている。 DNA複製がS期に一度だけ起こるための機構 S期に、クロマチン上からライセンス化タンパク質が除去されることにより、複製起点が1回の細胞周期につき1度だけしか発動しないことが保証されている。 主にライセンス化因子Cdt1の機能解析を行っている。 1998年、BlowとRaskeyは、染色体複製のライセンス化因子を提唱した。 MCM2も複製ライセンス因子である。 M期の後期からG1期に複製開始点にCdc6を介してMcmを含むタンパク質複合体が形成される。その後S期になるとタンパク質をリン酸化するCdc28/Clbキナーゼが活性化される。

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