★グルタメートの測定分析

☆開始前のチェック
☆分析全般に関わる注意事項
☆分析開始時---HTEC-500の立ち上げ
  1. HTEC-500の電源（裏面）を入れる。
  2. 移動相ボトルに装置からのチューブが届いていることを確認する。
    • 移動相は1週間毎に作り直す。
    • チューブがメタノールに入れてあった場合は、メタノールが移動相に入らないように、よく拭いてから入れる。
    • 移動相が空気に触れないように、ボトルの口をパラフィルムでカバーする。
    • チューブがふらふらしないように、固定する。←ノイズの原因となる！
    1min400μL
    10min4cc
    1h24cc
    3h84cc
    5h120cc
  3. 廃液瓶が空であるか確認する。廃液瓶内のチューブもふらふらしないようにする。ぽたぽた液が落ちることもノイズの原因となるので、チューブは下の方にまで入れる。
  4. 重要ポンプ裏の洗浄（MilliQ水を数cc流す---3cc以上）。
  5. （酵素カラム E-EN2を設置する。）
  6. 分析条件を元に、HTEC-500の設定→PUMPスイッチ、ECDスイッチをONにする。→6
  7. 廃液部から液が流れているかを確認する。
  8. 装置内部に液漏れがないかを確認する。
  9. オートサンプルインジェクターの準備：試料を入れ、打ち込み条件の設定→9
    （マニュアルインジェクターによるスタンダードを打ち込み） PowerChrom EPCの裏面の電源をONにし、パソコンを立ち上げる。---測定準備
    • クロマトデータの記録：シーケンスファイルを元にシーケンスファイルを作成し、測定開始！
    • パソコンがEPCを認識していることを確認し、ベースラインを見る。
      　　↓
    • ベースラインが安定しているかを確認する（30分〜1時間後）。
    • ECDやオートサンプルインジェクターの温度などを確認する。
    • オートサンプルインジェクターからインジェクションの指令を出し、分析開始！
      （時に、オートサンプルインジェクターのドアを開けて、正しく作動しているかを確認する。オートサンプルインジェクターのドアの開閉はノイズの原因にはならない。）
→6.分析条件を元に、HTEC-500の設定
    PUMPPUMP ON
    ECDECD ON
    ZEROオートゼロ
    DISPLAYPUMP表示とECD表示の切り替え
    よくする間違い：ECDの表示を見るために、ECDスィッチを押してしまう。

    PUMP ON 状態
    *PUMP*　Press　圧力のステータス値
    FlowRate　　　■　　　400μL/min
    PulseFreeMode　　　　　　　　ON
    Press Limit　　　　　　　15MPa
    		 Press　圧力のステータス値
    • 何もつけていない時：0.3ぐらい
    • 高いときは、どこかが詰まっている。
    • カラムをつけた状態：8〜9
    ↑↓displayスィッチで、表示が交互に変わる。
    ↑↓よくする間違い：ECDの表示を見るために、ECDスィッチを押してしまう。
    ECD ON 状態
    *ECD*　　　　　　　電流ステータス値
    APP. Poten　　　　　　　　+450mV
    TimeConst.　　　　　　　　　3.0sec
    Temp/Set　　　　　現在の温度/33℃
    		 （Select Key→変更）

    TimeConst.
    • 1.0secが感度が良く、ノイズが現れやすい。
    • 3.0secが最もノイズが抑えられやすい。
→9. オートサンプルインジェクタに試料を入れ、打ち込み条件の設定
注意するポイント
  • 吸入針はサンプルバイアルの底から試料を吸入するので、底に空気がたまっていないかを確認する。
  • 空うちしないように、分析するサンプルバイアルの数を設定する。
  • 針洗浄用の洗浄液瓶と廃液瓶を確認する。
  1. 針洗浄用の洗浄液瓶には、毎回新しいMilliQ水を入れる。キムワイプなどで埃や異物が入らないようにふたをする。完全に密閉すると、液が引き込まれない。チューブが揺れても、ノイズの原因となることはないが、抜けないようにする。
  2. 廃液瓶は必ず付属のものを使用し、シリコン栓で空気が漏れないようにする。廃液がチューブがつかるまでに貯たまると、真空ポンプラインに廃液が入り、故障の原因になるので注意！
  3. 電源を入れる前に、サンプルラック（96穴）にサンプルバイアルをセットする。（電源を入れたままサンプルラックの出し入れを行う場合は、必ず分析を停止するか、一時停止して、吸入針がホームポジションであることを確認する。）
    （3サンプル毎にスタンダードを入れるとわかりやすい！）
    底に空気がないか注意！
  4. 電源を入れる。---JOBモード表示
  5. washキーを10回程度押して、洗浄液ラインを完全に置換する。（洗浄ラインに空気が入り込んだときも、同様にして完全に空気を抜く。）

    JOB設定画面---主に注入量と分析時間の設定（注入は10μl以上）
      ←→キー:横に移動　　↑↓キー:上下に移動
      • V1(μl)列：注入量：20→ENTキー
      • T2(MIN)列：分析時間：10→ENTキー
        （gluのretension timeは8分弱ぐらいなので、10分の繰り返しでも良いだろう。 22分ぐらいに出る尿酸のピークを気にする場合は、24分繰り返しにするのが理想かもしれないが、ほとんど問題にならない。）

    • サンプルラックの96穴にそれぞれの設定をすることもできるが、同じ条件を繰り返す場合は、コピーできる。
      　条件を決めた行にカーソル→繰り返し回数→ENTキー
    • 解析の中断後、再開する場合は、次にどのラックから開始するかを指定する。
      • JOB設定画面：再開する番号にカーソルを移動させる。
      • ファンクション設定画面：残りの本数を設定！
    　FNCキー↓
    ファンクション設定画面---毎回設定が必要なのは、サンプルラック数のの設定
    • 試料の入っているサンプルラック数を設定をする。
      空うちしないために、試料の数を確認！
      解析の中断後、再開する場合は、残り何本のサンプルがあるかを確認する。

      STOP JOB No. サンプル数
      WASH1 TIME (SET) 3
      WASH2 TIME (SER) 1
      PRESET TEMP (℃) 4
      VALVE SEL (1,2)
    • サンプルラック温度、吸入針および注入ポートの洗浄条件なども設定できる。
    　JOBキー↓
    JOB設定画面←→インジェクション指令
    • STARTキーを押すと、インジェクションの準備後、EPCの画面も連動して、分析開始の画面に切り替わる。


    （指令通り動作されるかを確認するために、オートサンプルインジェクターの扉を開けて、指示したサンプルからインジェクトされるかをチェックすれば安心！）
→Calibration用にスタンダードをマニュアルインジェクトする場合
  1. PowerChromーManual Run画面ー「waiting 状態」
  2. マニュアルインジェクター専用シリンジ（Hamilton Microsyringe 702SNR）をMilliQ水で5〜6回洗う。（ゆっくり押すと針の先端に液がつくので、すっと液を押し出す。液は10μl注入するのでその付近を良く洗浄するようにする。）
  3. マニュアルインジェクターのノブをINJCTにセットする。
  4. スタンダードを10μl吸引する。空気が入っていないことを確認し、ニードルをぐっと一番奥まで入れる（抵抗を感じてから3mm奥）。
  5. ノブをLOADに切り替えて、スタンダードをインジェクター内に注入する。すぐにノブをLOADからINJCTに戻す。この時点で電気的信号も送られ、オートゼロやトリガーシグナルが入る。
  6. シリンジをMilliQ水で5〜6回洗う。ニードル部もMilliQ水で良くぬぐっておく、

☆分析終了時
  1. 分析終了時、装置内のサンプルを完全に流しきるため、30分ほど移動相を流し続ける。
  2. ECDは先に止めてもかまわないので、ECDをOFFにする。
  3. （酵素カラムをはずし、移動相に浸し、冷蔵庫保存。）
  4. 装置内の洗浄終了後、ポンプをストップし、ポンプ裏の洗浄を行う。MilliQ水を3cc以上注入する。
  5. オートサンプラー　WASH 3回以上
  6. パソコンのデータを保存し、パソコンを終了する。
  7. Power Chrom EPC　電源OFF
  8. 液漏れしていた部分がなかったかを確認し、装置のメインスィッチ OFF。