★グルタメートの測定

溶液の調整

移動相	MilliQ水	HPLC用超純水（Eicom製など）
	塩化アンモニウム	ナカライテスク 02424-55
	10% アンモニア水	和光純薬工業 013-1705
	臭化ヘキデシルアンモニウム*	ナカライテスク 07906-82
	EDTA・2Na	同人化学 343-01861
標準液	Glu
	2molHCl	Wako 083-0275
	リンゲル液

→洗浄　重要、重要！
→溶液がクロマトに及ぼす影響

□移動相の調整-----1週間使い切り！　←移動相とは

臭化ヘキサデシルトリメチルアンムニウム（250mg/l）を含むNH₄Cl-NH₄OH（50mmol/l）溶液

MilliQ水 1L 塩化アンモニウム 2.67g 10%アンモニア水 80μl 臭化ヘキデシルアンモニウム-* 250mg EDTA・2Na（5mg/ml） 0.125ml

栓付きPILEX等1L透明ガラス瓶 ガラスメスシリンダー ガラスビーカー 薬包紙 スパチュラー ピペットマン

1. 移動相専用ボトルに、塩化アンモニウム2.67gを入れる。MilliQ水専用ガラスメスシリンダーでMilliQ水を1Lを計り、移動相ボトルに1分ぐらいかけてゆっくり注いで、塩化アンモニウムを溶解する。
2. 10% アンモニア水をビーカーに少量入れ、ピペットマンで80μlとり、移動相ボトルに加えて混合する（この時のpHは約7.2）。
3. 臭化ヘキデシルアンモニウムを250mg加える。　→イオンペア試薬
4. すべての試薬を加えた後、栓をして十分攪拌する。血漿が残っていないか、視覚的に確認する。（臭化ヘキデシルアンモニウムは界面活性剤のようでもあるので、攪拌すると泡立つ。）
5. （ガラス瓶からの金属イオンの流出を抑えるために、EDTA・2Naを加えると良いらしい。←→ガラス瓶）

[注意]

• 調整には、特定のガラス容器を使用し、MilliQ水で良くすすぎ、次に水ですすいでから使用する。金属イオンの流出を抑えるために、PILEX等のガラス瓶が推奨される。
• 移動相には緩衝能はほとんどないので、空気中の二酸化炭素を吸収して徐々にpHが低下する。
• 一週間以内に調整した物を使用する。装置内に雑菌が繁殖するのを防ぐため、以前から使用している瓶に継ぎ足さない。
• 移動相汚染の機会を増やすため、濾過する必要はない。
• カラムの平衡化には、この移動相を33℃で、1l以上流す。　→保守
• グルタメートの分析に関しては、カラム平衡化以後のイオンペアー濃度は分析には大きく影響しないので、±10%程度の秤量誤差は問題にはならない。
  
  
• エイコムによると、移動相などの溶液は、濾過しない方がよいことになっている。（HTEC-500にはフィルターが入っている。濾過する過程で、ゴミが入る可能性がある。）
• 濾過すると、肉眼的にフィルター上に黒い点が見えることがあるので、濾過すべきだという研究者もいらっしゃる、（MILLIPORE TYPE G3 0.22µM)

□標準液の調整

　標準液のストック溶液---Glu 1x10^-2mol/0.1N HCL

MilliQ水 47.5ml →0.1NHCl 　10ml↓ 2molHCl 2.5ml Glu 14.7mg →1x10-2mol

ガラスビーカーなど　3 ピペットマン 薬包紙 スパチュラー 10cc用ガラス瓶

1. MilliQ水と2molHClを別々にビーカーに用意する。もう一つのビーカーに、47.5mlのMilliQ水をピペットマンで入れ、続いて2molHClを2.5mlを入れて、20倍に希釈し、0.1NHClを作る。
2. 微量天秤でGluを14.7mg計る。10cc用ガラス瓶で、Gluを14.7mgを0.1NHClを10mlで溶解し、ストック溶液とする。（正確に14.7mg計るのは難しいので、計量したGluに相当量の塩酸で希釈する。）

• ストック溶液（Glu 1x10^-2mol）は、冷蔵庫（4℃）保存で、6ヶ月安定。

　分析用標準液

• 分析直前に、分析に使用する標準液を移動相で希釈する。

  移動相 990μlx2 ストック標準液 10μl

  エッペンチューブ ピペットマン エッペン台

• 皮膚のグルタメートレベルはだいたい、1x10^-5mol
  1x10^-5mol, 2x10^-5mol, 4x10^-5mol等をスタンダードとした。
• 1x10^-6molは、室温保存で1日安定。

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☆洗浄　重要、重要！

• クロマトグラフィー実験のための洗浄は、動物が感染しないように清潔にすると言うことではなく、HPLCは感度が良いので極力コンタミを減らすための機器の洗浄を意味する。
• 水道水で3回洗浄し、MilliQ水で3回洗浄する。
• 容器のふたを閉めて、しっかり縦にじゃぶじゃぶ上下させて洗う。
• 容器を斜め下に向けて、容器の底から水をくるくる回しながら、容器全面を洗う。

[溶液がクロマトに及ぼす影響]

• 陰イオンの溶出によるクロマトグラムパターン
  • 本法の分離モードは、陰イオン交換が主に働いている。
  • 試料中に含まれる陰イオンによってクロマトグラムが変化するので、試料の処理に用いる溶液組成には充分に注意を払う。

    ゴーストピーク オートサンプラーがきたない？ リンゲルがきたない？ サンプルがきたない？

  
  
• 移動相のpHがクロマトグラムに与える影響
  • 塩濃度を一定にしたpH 7-7.5の範囲の移動相では、Gluの保持時間は変化しないが、試料に含まれる他の陰イオンの溶出パターンが変化する。
  • 移動相とリンゲル液の塩素イオンの濃度差によって生じる反転ピークの溶出時間は、移動相のpHの影響を受ける。pH7.17では11-12分ぐらいで出現し、pHが高くなると短くなり、低くなると長くなる。pH7.46では約7分、pH7.00では約17分。
  
  
• 移動相の塩濃度がGluの保持時間に与える影響
  • サンプルに含まれる尿酸は、白金電極によって直接検出される（グルタミン酸オキシダーゼ酵素反応によるものではない。）
  • 50 mmol/Lの塩濃度では、脳ダイリゼート (BMD)の尿酸のretension timeは約22分。塩濃度が下降するとretension timeは延長し、塩濃度が上昇するとretension timeは短縮する。
  
  
• 分析温度の影響
  • Gluのretension timeはあまり温度の影響を受けにくい。
  • 反転ピークのretension timeは温度上昇により延長する。
  • 尿酸のretension timeは温度上昇によりわずかに短縮する。
  
  
• 移動相中のイオンペアー試薬濃度のGluのretension timeに及ぼす影響
  • 移動相を約1l流すとカラムは平衡に達する。その後、イオンペアー剤を含まない移動相を流してもGluのretension timeはほとんど変化しないので、インペアー剤の秤量はそれほど厳密でなくてもよい。
  • ただし、イオンペアー剤はカラムや電極の劣化に影響するので、大過量の添加は避ける。

  *臭化ヘキサトリメチルアンモニウム（HDTMA)はプラスにチャージしているイオンペア剤で、グルタメートの COO-と一時的にイオン結合することによって、カラム内にグルタメートを保持させる役割をしている。 イオンペア試薬とは　参考1 酸や塩基などがイオン的に解離すると、非常に水に溶け易くなるため、逆相系の充填剤にはほとんど保持されなくなってしまう。 イオンペア試薬とは、溶離液中でサンプルとイオン結合させる試薬。 サンプルが酸性であれば塩基性のイオン化合物が、逆にサンプルが塩基性であれば酸性のイオン化合物がそれぞれイオンペアー試薬となる。 イオンペア試薬を溶離液中に添加すると、異符号のイオン同士がお互いに引き合って中性のイオン対を形成し、溶離液中でのサンプルの解離が抑制される。

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