■研究法

│組織ー固定│

　　　　　　→Stoc solution-固定液

固定：組織成分をできるだけ生体時の状態に保つように，組織を迅速に殺し，硬化，保存すること

美しい組織切片を作るために、充分な固定が重要である。
　灌流固定
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　後固定

	Félix Vicq d'Azyr（P 1746/4/23〜1794/6/20 フランスの解剖学者）は脳の研究にアルコール固定を導入し、乳頭体視床路、中心溝、中心前回、中心後溝、島を記載
1809年頃	固定剤として、Johann Christian Reil（P 1810〜1879, ドイツ、カッセルの開業医）はアルコールの代わりにクローム酸とその塩類を使用した。
1856年	ミクロトームを考案したBenedict Stilling（P 1759〜1813 ドイツ、デンマーク出身、ハレ大-ベルリン大学病院長）はアルコール固定をほどこした脳から連続切片を製作することに成功した。
1869年	包埋剤として、Klebsがパラフィンを使用した。
1879	包埋剤として、Duvalがセロイジンを使用した。
1893年	Isaac Blum （1833/4/11〜1903/4/13, ドイツの病理学者）と息子のFerdinand Blum（1865/10/3〜1959, ドイツの病理学者）がホルマリン固定法を開発した。

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ラットの灌流固定　　　　迅速に行うことが重要！

1. 過量の麻酔薬で動物を深麻酔する。
   
   
2. 傷つけずに、迅速に心臓を露呈するためには、切開は思い切って、気持ちより広めに！
   　正中切開をする方法をよく見かけるが、私が教えてもらった方法は、まず横隔膜の下、正中部を横切って10cmぐらい、はさみ¹⁾で、胸部を切開して、胸腔に入った後、左右の肋軟骨の部分を、心臓が拍動しているのが、広い視野で見えるように、頭部方向へと切り進み、前胸壁を上方に翻転して、鉗子で固定しておく。
   
   
3. 拍動している心臓の各部位の位置関係をしっかり確認する。心尖部、左心室、右心耳、上大動脈。
   
   
4. 心尖部から左心室に灌流用注射針を挿入し、注射針が抜けないように、無鈎鉗子で固定する。
   　注射針は上行大動脈まで入れても良いが、左心室内でも充分。左心室壁にぶち当たっていない位置でとどめると、心臓を傷つける心配がない。その位置で充分、灌流液は抵抗なく、上大動脈へと流れる。脳だけしっかり固定したい場合は、下大動脈などを縛っても良い。
   
   
5. 送液ポンプ^＊の速度を遅くして、生理食塩水あるいは、PBSを流し始める。
   
   
6. 右心耳に小さな切開を入れ、血液が出てくるのを確認した後、送液ポンプの速度を速める。血流より少し早めがベストらしい。
   
   
7. 体を横位にし、手足を充分伸ばすと、灌流液が脳まで行きやすいとアドバイスを受けたことがある。
   
   
8. PBSを200cc程度、あるいは、血液が洗い流され、灌流されてできた液が透明になってきたら、固定液を灌流する。
   　固定液が入ると、手足が伸展する。伸展していない場合は、液は適切に灌流されていない可能性がある。
   
   
9. 固定液200cc程度、あるいは、体が硬くなったら、ただちに組織を取り出し、固定液に入れて、冷暗所で保存する。
   
   
10. 凍結切片を作成する場合は、sucrose液に置換。

¹⁾肋軟骨は柔らかいので、それほどはさみを痛めないが、料理用はさみを使うと便利。

参考

神戸大　脳科学講座 神経発生学分野 灌流固定

東大　核内情報研究分野灌流固定法　

医科歯科？灌流固定法 -pdf

筑波大　 凍結切片作製法

Pain Relief