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演題
第１回口腔医科学フロンティア研究会開催
演題1
骨髄腫の腫瘍進展と骨破壊病変形成におけるTAK-1の枢軸的な役割
寺町順平
徳島大学大学院 医歯薬学研究部 口腔組織学分野
多発性骨髄腫(MM)は、骨髄微小環境に依存した進展を示し、広範な骨破壊病変を形成する。我々はこれまでに骨髄腫細胞と骨髄微小環境との相互作用により両者にPim-2キナーゼが発現誘導され、腫瘍進展と骨病変の形成に重要なシグナルを媒介していることを報告したが、最近Pim-2の発現誘導に関わる上流因子としてセリンスレオニンキナーゼであるTGF- -activated kinase 1 (TAK-1)を見出した。そこで、今回MM腫瘍進展や骨破壊におけるTAK-1の役割を検討した。MM細胞株およびMM患者より単離したCD138陽性細胞においてTAK-1の発現およびそのリン酸化が亢進していた。また、TAK-1阻害薬LLZ1640-2はTNF- によるNF-κB、p38MAPK、ERKの活性化やIL-6によるSTAT3の活性化を抑制し、MM細胞に細胞死を誘導した。また、LLZ1640-2は骨髄間質細胞のVCAM-1の発現を抑制し、MM細胞との接着と骨髄間質細胞によるMM増殖促進活性を抑制した。MM細胞培養上清(MMCM)やMMにおける骨芽細胞分化抑制因子として報告されているIL-3、IL-7、TNF-α、TGF- やactivin Aはいずれも単離骨髄間質細胞および前骨芽細胞株MC3T3-E1にTAK-1のリン酸化を誘導した。LLZ1640-2は、MC3T3-E1においてTNF-αおよびTGF- シグナルを抑制する一方、BMP-2シグナルを活性化し、MMCMの添加下で抑制された石灰化結節の形成を回復した。MMにおける破骨細胞分化活性化因子であるRANKLやTNF-αは破骨前駆細胞株RAW264.7細胞においてTAK-1およびそのリン酸化を誘導した。さらに、LLZ1640-2およびTAK-1特異的siRNAによりMMCMおよびRANKLによるRAW264.7の NFATc1やc-fosの発現誘導と破骨細胞形成亢進を抑制した。LLZ1640-2は脛骨内移植によるマウス骨髄腫モデルにおいて腫瘍の著明な縮小と骨破壊病変形成を抑制した。以上の結果から、TAK-1はMMの腫瘍進展と骨破壊病変形成を促進する枢軸的な制御因子であり、TAK-1阻害薬は腫瘍抑制とともに骨病変の進行抑制と骨再生をもたらす新規治療薬の候補と考えられる。
参考文献
1. Teramachi J, Silbermann R, Yang P, Zhao W, Mohammad KS, Guo J, Anderson JL, Zhou D, Feng R, Myint KZ, Maertz N, Beumer JH, Eiseman JL, Windle JJ, Xie XQ, Roodman GD, Kurihara N. Blocking the ZZ domain of sequestosome 1/p62 suppresses myeloma growth and osteoclast formation in vitro and induces dramatic bone formation in myeloma-bearing bones in vivo. Leukemia. in press
2. Hiasa M, Teramachi J, Oda A, Amachi R, Harada T, Nakamura S, Miki H, Fujii S, Kagawa K, Watanabe K, Endo I, Kuroda Y, Yoneda T, Tsuji D, Nakao M, Tanaka E, Hamada K, Sano S, Itoh K, Matsumoto T, Abe M. Pim-2 kinase is an important target of treatment for tumor progression and bone loss in myeloma. Leukemia. 29: 207-217. 2015
演題2
鎖骨頭蓋骨異形成症および母斑基底細胞癌症候群の複数患者から作製したiPS細胞の解析
−骨組織分化との関連の検討
齋藤暁子
東京歯科大学 生化学講座
【目的】鎖骨頭蓋骨異形成症 (CCD）、母斑基底細胞癌症候群 (Gorlin症候群)の患者細胞からiPS細胞を樹立し、疾患モデルとしての応用、情報伝達系異常と機能異常の関係解明、次世代シークエンサー (NGS)解析による変異と疾患の関係解明を目的とする。
【方法】本研究は東京歯科大学倫理委員会より承認された。CCD : 5症例、Gorlin : 6症例患者から口腔組織を治療目的あるいは歯科外来で採取し、常法に基づき線維芽細胞を得た。細胞からゲノムDNAを抽出し、通常法または次世代シークエンサー（NGS)により遺伝子変異を同定した。 CCD-iPSのうち１例は遺伝子編集で変異塩基を正常化したRevertant (Rev-iPS)を作製し、未分化性、多能性を確認した。骨分化誘導は当講座の報告した方法（参考文献２）を用いた。骨分化誘導前後におけるHedgehog関連遺伝子群の変化はQiagen社製RT-PCRアレイを用いた。ヌードラットに作製したcalvarial bone defectに、iPSから骨芽細胞へ分化誘導後移植しμCT、組織学的方法で評価した。
【結果】CCD症例で確定された変異にはexon8の核局在シグナル(NMTS)直前のナンセンス変異とexon2の始めにナンセンス変異があった。CCD-iPSはRev-iPSともに未分化マーカー発現、totipotency, pluripotency をin vivo、 in vitro で確認できた。骨分化誘導で骨分化遅延を認めた。 ヌードラットに患者iPS細胞、Rev-iPS細胞から作製した骨芽細胞移植を行うと、コントロールiPS、Rev-iPS細胞で骨閉鎖が速かった。Gorlin症候群ゲノムのNGS解析により、膜貫通部領域近傍に変異が多く存在した。Gorlin症候群iPS細胞は未分化マーカー発現、totipotency、pluripotencyを in vivo、in vitroで確認した。Gorlin症候群iPS細胞はコントロールに比べ、Hedgehog情報伝達系の恒常的亢進とそれに伴うフィードバック抑制、基底状態におけるWnt、BMPの抑制および骨分化誘導による著しいWnt、BMP-Runx2 経路の亢進をみとめた。
【結論】 CCD-iPS、Gorlin-iPSはいずれも骨分化誘導において正常と異なる動態を示した。今後 遺伝子変異との関連性の未解明である症状の再現、機序の解明、あるいはGorlin症候群における癌化メカニズム、その治療法開発に有用と思われる。
参考文献
(1) Saito A, Ochiai H et al FASEB J, 12, 221432, 2013.
(2)Ochiai-Shino H, Kato H et al. PLoS One. 2014;9(6):e99534. doi: 10.1371/journal.pone.0099534.
演題3
細胞系譜解析による生体内における骨髄間葉系幹細胞の同定と機能解明
溝口利英
松本歯科大学 総合歯科医学研究所
骨髄間葉系幹細胞(BM-MSCs)は、生涯にわたり骨髄の間葉系細胞の供給源として機能する。これまでBM-MSCsは、in vitro培養系もしくは生体への移植実験により、その自己複製および多分化能が評価されてきた。したがって、BM-MSCsの骨髄内における局在や挙動については十分な理解が得られていなかった。そこで我々は、マウスの発生過程におけるBM-MSCsの起源となる細胞を同定し、その系譜をイメージング技術により捕らえることを試みた。その結果、新生仔期におけるOsterix(Osx)陽性細胞の一部が、成体のBM-MSCsに寄与することが明らかになった。Osx陽性細胞から供給されたBM-MSCsは、レプチン受容体陽性細胞として血管に近接した場所に局在し、骨髄組織全体に認められた。細胞系譜解析の結果、これらの細胞は成長にともない骨芽細胞および脂肪細胞に分化することが生体内で示された。一方、BM-MSCsの軟骨細胞への寄与は、発生段階には認められないものの、骨折治癒過程においては確認された。以上の所見に加え、本発表ではBM-MSCsの生体内における分化調節機構についても議論したい。
参考文献
Mizoguchi T, Pinho S, Ahmed J, etal. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development. Dev Cell. 2014; 29:340-349.
演題4
Nestin陽性血管周皮細胞の運命決定機構の解明
岩山智明
大阪大学大学院歯学研究科 第一解剖学教室・口腔治療学教室
組織線維症は正常組織が破壊され、細胞外基質タンパクによって置き換わることにより、非可逆的な機能障害に至る疾患である。近年のヒトおよびマウスでの研究により、肥満に伴う白色脂肪組織の肥大化において、同組織の線維化が代謝異常のhallmarkであり、柔軟性の低い細胞外基質に囲まれた脂肪細胞が"病的な肥満"を引き起こすことが分かっている。しかしながら、組織線維化のメカニズムについては不明であった。我々はマウスモデルを用いて、Nestin陽性血管周皮細胞内のPDGFRαシグナルを亢進させると、脂肪組織を含む多くの組織に重篤な線維化を起こし、死に至ることを明らかにした。さらにNestin陽性血管周皮細胞の詳細な解析により、同細胞は脂肪前駆細胞であり、高脂肪食投与により脂肪細胞への分化が亢進する一方で、PDGFRαシグナルにより細胞外基質を分泌する線維芽細胞へと直接分化することを見出した。これらの知見から、白色脂肪中のNestin陽性細胞はfibro/adipo progenitorsであり、PDGFRαシグナルによりその運命決定がなされていることが示唆された。現在は成体組織中に存在する間葉系幹細胞/前駆細胞がどのように組織の恒常性維持および組織損傷時の修復再生を担っているかに興味を持ち、歯周組織中の同細胞群の同定およびlineage hierarchyの解明に向けて研究を進めている。
参考文献
1. Iwayama T, Steele C, Yao L, Dozmorov MG, Karamichos D, Wren JD, Olson LE. PDGFRα signaling drives adipose tissue fibrosis by targeting progenitor cell plasticity. Genes Dev. 2015 Jun 1;29(11):1106-19.
2. Iwayama T, Olson LE. Involvement of PDGF in fibrosis and scleroderma: recent insights from animal models and potential therapeutic opportunities. Curr Rheumatol Rep. 2013 Feb;15(2):304.
演題5
歯胚分割技術を用いた歯の再生治療法の開発
山本 直
東京医科歯科大学 顎顔面矯正学分野
歯の欠損に対する治療として、義歯やブリッジ、インプラントといった人工物による代替治療や自己の歯を移植する自家歯牙移植治療が行われている。また、歯の発生を再現しうる自家歯胚移植は、より生物学的な機能回復が可能な歯科再生治療として期待される。しかしながら、歯胚の個数や発生時期から移植可能な歯胚は制限されるため、移植材料そのものの数を増やす必要があると考えられる。そこで我々は、発生期歯胚から複数の歯を創り出すための歯胚分割技術を構築し、新たな歯科再生治療の開発を行った。
発生期の歯胚を摘出し、結紮による分割操作を加え、器官培養および腎皮膜下移植したところ、正常な組織構造を有する2つの歯が発生した。この分割歯胚は、結紮直後から2つの歯に発生していくことがライブイメージにより認められたと共に、歯胚発生関連遺伝子が各々の分割歯に発現していることがin situ hybridizationにより明らかとなった。さらに、分割歯胚を口腔内に移植したところ、2本の歯の萌出し、対合歯と咬合していることが認められた。これら分割歯は骨リモデリングによる矯正学的な歯の移動が可能であることが示され、さらに、分割歯の歯髄・歯根膜には神経線維が侵入し、侵害刺激の伝達が可能であることから、分割歯は天然歯と同様に周囲組織および中枢と連携した生理機能を有することが明らかとなった。以上の結果より、ひとつの歯胚から複数の歯胚を発生可能な分割操作技術が確立されたと共に、分割歯の移植によって天然歯と同等の生理機能を再現しうることが実証された。これらの成果から、智歯歯胚などの現実的に利用可能な移植材料を用いた新たな歯科再生医療の実現の可能性が示唆された。
参考文献
１．Yamamoto N, Oshima M, Tanaka C, Ogawa M, Nakajima K, Ishida K, Moriyama K, Tsuji T. Functional tooth restoration utilising split germs through re-regionalisation of the tooth-forming field. Sci. Rep. 5, 18393
演題6
WntとKITｼｸﾞﾅﾙの協調による唾液腺の形作りと機能獲得過程の巧妙な制御
松本真司
大阪大学大学院 医学系研究科 分子病態生化学
発生過程において、肺や腎臓、腸管から唾液腺といった外分泌腺を含めて、私たちの体を構成している多くの臓器は、上皮細胞が集団として活発に増殖しながら立体的な管状の構造(上皮管腔構造)を形成し、その後臓器固有の細胞へと分化することによって機能を獲得する。発表者はこれまでに培養上皮細胞や腎臓などの管腔臓器原基の多次元的な培養法を駆使して、液性因子シグナルにより制御される上皮管腔構造の形成機構（"形作り"）を明らかにしてきた。しかし、器官形成の前期にみられる"形作り"だけでなく、後期にみられる"分化(機能獲得)"へと経時的に進行していく一連の発生過程を適切に調節する機構についてはいまだ明らかにされていない。そこで本研究では、唾液腺の発生をモデルとして"形作り"から"分化"へと移行する過程を制御するシグナル機構について検討した。
唾液腺は発生過程において、未分化な終末部上皮（end bud）が活発に分岐をしながら管腔(導管)構造を形成し、その後唾液を産生する腺房へと急速に分化する。発表者は発生過程において重要な液性因子シグナルのひとつであるWntシグナルを恒常的に活性化したマウス（安定型β-カテニン発現マウス）の唾液腺において、胎生17日目における腺房分化が著しく抑制されていることを見出した。胎生13日目の唾液腺原基を摘出して器官培養すると、非極性化上皮からなるend budは培養4日目から6日目にかけて急速に極性化し、多房性の腺房構造を形成するとともに腺房分化マーカーの発現が強く上昇した。一方、Wntシグナルの標的遺伝子であるAxin2の発現は腺房分化にともなって経時的に減少した。器官培養において、Wntシグナルを恒常的に活性化させると、培養6日における腺房構造の形成が強く抑制され、end budは未分化な非極性化状態に維持されるとともに、導管の形成が促進していた。一方でWntシグナルを阻害すると、end budはコントロールと比較して早期に極性化して腺房構造を形成するとともに、導管の形成が抑制されていた。唾液腺発生の前期において、Wntシグナルの活性化は導管部ではなく、end budにおける細胞増殖を促進し、前駆細胞（Sox10+/KRT14+）数を増加させた。そこで、end bud細胞を特異的に蛍光標識して追跡したところ、end bud由来の細胞が導管を形成する様子が観察され、さらにWntシグナルの活性化はend budから導管への細胞移行を促進した。発生後期ではend budにおいてSCF受容体であるKITの発現が局所的に上昇し、腺房分化が誘導されたが、Wntシグナルは発生前期において、KITの発現を抑制することによって腺房分化の進行を抑えていた。
本研究から、WntとKITシグナルの活性化バランスが器官形成過程における"形作り"から"分化(機能獲得)"へのスイッチングを調節する新たな機構が明らかになった。
参考文献
1. Fujii, S., Matsumoto, S., Nojima, S., Morii, E. and Kikuchi, A. Arl4c expression in colorectal and lung cancers promotes tumorigenesis and may represent a novel therapeutic target. Oncogene 34, 4834-44 (2015).
2. Ibuka, S., Matsumoto, S., Fujii, S. and Kikuchi, A. The P2Y? receptor promotes Wnt3a- and EGF-induced epithelial tubular formation by IEC6 cells by binding to integrins. J. Cell Sci. 128, 2156-68 (2015).
3. Yamamoto, H., Awada, C., Matsumoto, S., Kaneiwa, T., Sugimoto, T., Takao, T. and Kikuchi, A. Basolateral secretion of Wnt5a in polarized epithelial cells is required for apical lumen formation. J. Cell Sci. 128, 1051-63 (2015).
4. Matsumoto, S., Fujii, S., Sato, A., Ibuka, S., Kagawa, Y., Ishii, M. and Kikuchi, A. A combination of Wnt and growth factor signaling induces Arl4c expression to form epithelial tubular structures. EMBO J. 33, 702-18 (2014).
5. Gon, H., Fumoto, K., Ku, Y., Matsumoto, S. and Kikuchi, A. Wnt5a signaling promotes apical and basolateral polarization of single epithelial cells. Mol. Biol. Cell 24, 3764-74 (2013).
6. Kagawa, Y., Matsumoto, S., Kamioka, Y., Mimori, K., Naito, Y., Ishii, T., Okuzaki, D., Nishida, N., Maeda, S., Naito, A., et al. Cell cycle-dependent Rho GTPase activity dynamically regulates cancer cell motility and invasion in vivo. PLoS One 8, e83629 (2013).
7. Ishida-Takagishi, M., Enomoto, A., Asai, N., Ushida, K., Watanabe, T., Hashimoto, T., Kato, T., Weng, L., Matsumoto, S., Asai, M., et al. The Dishevelled-associating protein Daple controls the non-canonical Wnt/Rac pathway and cell motility. Nat Commun. 3, 859 (2012).
8. Matsumoto, S., and Kikuchi, A. Regulation of focal adhesion dynamics by Wnt5a signaling. Methods Mol. Biol. 839, 215-227 (2012).
9. Hanaki, H., Yamamoto, H., Sakane, H., Matsumoto, S., Ohdan, H., Sato, A., and Kikuchi, A. An anti-Wnt5a antibody suppresses metastasis of gastric cancer cells in vivo by inhibiting receptor-mediated endocytosis. Mol. Cancer Ther. 11, 298-307 (2012).
10. Sakane, H., Yamamoto, H., Matsumoto, S., Sato, A., and Kikuchi, A. Localization of glypican-4 in different membrane microdomains is involved in the regulation of Wnt signaling. J. Cell Sci. 125, 449-460 (2012).
11. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A., and Matsumoto, S. New insights into the mechanism of Wnt signaling pathway activation. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 291, 21-71 (2011).
12. Matsumoto, S., Fumoto, K., Okamoto, T., Kaibuchi, K., and Kikuchi, A. Binding of APC and dishevelled mediates Wnt5a-regulated focal adhesion dynamics in migrating cells. EMBO J. 29, 1192-1204 (2010).
演題7
ギャップジャンクション蛋白Panx3による骨形成機構の解明
石河真幸
東北大学大学院 歯学研究科口腔修復学講座 歯科保存学分野
Cell-cell and cell-matrix communication regulate the activation of signaling pathways involved in cell functioning, proliferation, differentiation and death. Gap junction proteins play important roles in such cellular communication. In vertebrate, there are two gap junction protein families such as pannexin (Panx) and connexin (Cx). Panx is recently identified as new gap junction protein family and its functions, especially in vivo are not well understood compared with Cx. Previously, we found Panx3, a member of Panx family is expressed in hard tissues including cartilage, bone and tooth. And Panx3 is induced during chondrocyte and osteoblast differentiation and inhibits osteoprogenitor cell proliferation2 and promotes osteoblast and chondrocyte differentiation3. However, the in vivo functions of Panx3 in hard tissue development are not fully elucidated. Here, we elucidated Panx3 in vivo functions and studied the functional relationships between Panx3 and Cx43 in skeletal formation by generating Panx3-/- and Panx3-/-;Cx43-/- mice and comparing their skeletal phonotypes with Cx43-/- mice. In this presentation, I like to share the new findings of Panx3 in vivo functions and the distinct roles between Panx3 and Cx43 in skeletal formation.
参考文献
1. Masaki Ishikawa, Geneva L Williams, Tomoko Ikeuchi, Kiyoshi Sakai, Satoshi Fukumoto, and Yoshihiko Yamada., Pannexin 3 and Connexin43 Modulate Skeletal Development via Distinct Functions and Expression Patterns, J Cell Sci. 2016 Jan 12.
2. Ishikawa M, Iwamoto T, Fukumoto S, Yamada Y., Pannexin 3 inhibits proliferation of osteoprogenitor cells by regulating Wnt and p21 signaling, J Biol Chem. 2014 Jan 31;289(5):2839-51.
3. Ishikawa M, Iwamoto T, Nakamura T, Doyle A, Fukumoto S, Yamada Y, Pannexin 3 functions as an ER Ca2+ channel, hemichannel, and gap junction to promote osteoblast differentiation, J Cell Biol. 2011 Jun 27;193(7):1257-74.
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