Oshikane Lab Homepage

みなさま、本日は改めてどうぞ宜しくお願い致します。 私は押鐘浩之と申しまして、大学教員をしている者です。 音楽の桑野先生のご紹介から、今年度で青山高校で実施するのが３年目となります。

++++講師プロフィール| 都立日比谷高校、京都大学、東京大学大学院、東京工業大学大学院を経て博士（理学）取得後、 英国Medical Research Council分子生物学研究所研究員およびケンブリッジ大学Research Associateとして研鑽を積み、帰国後、帝京大学医学部助教、同医療技術学部臨床検査学科講師を経て、現在大阪大学大学院薬学研究科特任准教授。

専門は生化学、特にタンパク質の物性や構造・機能。 最近では考古学や文化財に対する分子生物学の応用など、専門以外の研究も積極的に行っている。

【ひとこと】 今回は、高校時代のオーケストラで同期だった桑野先生のご紹介で この様な素晴らしい機会を持つことができました。有難うございます。 高校の友達は、かけがいのない一生モノであると私は感じています。 皆さんにおかれましても、是非いまいる友達を大切にして頂ければと願っております。 ++++

今年度は２種類の実験を行います。 ①PCR⇒アガロースゲル電気泳動 ②無菌操作

①PCRは、皆さんが持ってきた身の回りのものを鋳型としてPCRで生物種を検出するという実験をします（DNAバーコードと言われています）。１日目１時限目にPCRを仕掛けます。２日目にPCR増幅をアガロースゲル電気泳動で確認する予定です。 ②無菌操作は、先ず寒天培地にエタノール消毒前後の指をくっ付けて頂き、自分の指に付着しているバクテリア・カビを視覚的に検出してもらいます。次にGFPなど蛍光タンパク質（緑・黄・青・赤）を発現した大腸菌を使って各自「お絵かき」をして頂きます。２日目にそれぞれの結果を見てもらい、考察をしてもらいます。

PCRを用いてDNAに基づいた特定の生物種の検出ができるということ、および アガロース電気泳動を通じてDNAを可視化できる、ということを体験して頂ければと思っております。 近年、高校生物および大学受験生物において、分子生物学的内容が多くなってきています。 また2019年のCOVID-19のアウトブレイクにより、“PCR”という言葉を聞かない日がございません。 実際にDNAを扱った実験を実施することによって、 高校生物の内容の充実は勿論のこと、将来的にこの種の実験・研究にも興味を持って頂ければ嬉しいです。

皆さんには蛍光タンパク質を発現する大腸菌株を使ってお絵描きをして頂き、無菌操作を練習して頂きますが、 下記に大腸菌株から蛍光タンパク質を実際に得る・確認するについてプロトコールを例示することで、 どうやって遺伝子組換えタンパク質が作成できるかを補足説明させて頂ければと思います。

①大腸菌に蛍光タンパク質をコードしたプラスミドを導入（形質転換）し、コロニーを得る ②コロニーを液体培地に移し、誘導物質を添加することで蛍光タンパク質遺伝子の発現を誘導させる（図１）。

図１：蛍光タンパク質を発現させた大腸菌。UVを照射すると蛍光が観察できる。左よりGFP, YFP, CFP, DsRed。

③遠心分離機にかけ菌体を集め、菌体を緩衝液を含む生理食塩水で懸濁し超音波で破砕（細胞破砕方法も圧力を加える、グラスビーズで擦りつぶすなど色々ありますが、大腸菌は超音波で潰れます）することで、細胞懸濁液を得る。 ④細胞懸濁液を遠心分離機にかけ、上清を得る（図２・３）。

図２：可視光での観察：左よりGFP、YFP、CFP、DsRed

図３：UV光での観察：左よりGFP、YFP、CFP、DsRed

⑤タンパク質の電気泳動であるSDS-PAGEで蛍光タンパク質が存在することを確認する（図４）。
図４：左がCBB染色という方法で染色した泳動像、右が泳動直後にUVで撮影した泳動像。なお“Boilアリ／ナシ”は電気泳動の前にタンパク質を95℃で煮たか／煮ていないかを示している。

【問題】大学受験問題としてはかなり発展問題であり、もう少しリード文が必要とは思います。解答を見ながらで構いません。なるほどと理解して頂ければ嬉しいです。 問１：大腸菌の細胞は超音波で破砕できると述べたが、カビなどは一般的に超音波での破砕は難しい。大腸菌（グラム陰性細菌）とカビの細胞構造の相違点を考えながら理由を述べよ。※グラム陽性・陰性とはグラム染色によって染色されるか・されないかを示しており、グラム陽性となるのは細胞壁の厚さと関係がある。 問２：大腸菌細胞を超音波で破砕後、遠心分離で上清と沈殿に分かれるが、沈殿にはどんな成分が含まれるかを考察せよ。 問３：SDS-PAGEでは泳動前にサンプルを煮たか煮ていないかで、煮た方は蛍光が観察できなかったのに対し、煮ていない方は蛍光が観察できたが、これは何故か？理由を述べよ。 問４：SDS-PAGEのCBB染色像ではサンプルを煮たか煮ていないかで泳動像が異なるのは何故か？理由を述べよ。

++++解答例| 問１：大腸菌もカビも細胞壁を有しているが、大腸菌はグラム陰性細菌であり細胞壁が薄いため、物理的に壊れやすい。それに対しカビは細胞壁が厚いために超音波では細胞は物理的に破壊されにくいため。 問２：沈殿成分は「緩衝液を含む生理食塩水に対して不溶性である」物質が含まれると考えられるので、例えば細胞膜や細胞壁、また膜タンパク質成分が含まれると考えられる。逆に上清は「緩衝液を含む生理食塩水に対して可溶性である」物質が含まれると考えられるので、細胞質に存在するタンパク質（目的の強制発現させた蛍光タンパク質も含む）などを含むものと考えられる。 問３：☞「熱変性」に気付くかがポイント。サンプルを煮ると蛍光タンパク質の熱変性が起きると考えられるため、蛍光を示すのに必要な３次構造が崩れることによって蛍光を示さなくなると考えられる。一方、煮ていない群では蛍光を示しているので蛍光を示すのに必要な３次構造が泳動後においても保たれていたと考えられる。SDSというタンパク質変性作用のある界面活性剤を泳動バッファーおよびゲルに含むため一般的にはタンパク質は変性するが、今回使用した蛍光タンパク質の場合はSDSによっても変性を受けなかったと考えられる。 問４：☞問３同様「熱変性」がヒント。サンプルを煮た場合は原理的に蛍光タンパク質は変性し「ヒモ状」になっていると考えられ、予想される位置まで泳動したものと考えられるのに対し、煮ていない場合は蛍光を示していることから蛍光タンパク質は変性しておらず球状を保っていると考えられることから、タンパク質の表面の電荷（換言すればそれぞれのタンパク質の等電点）に従ってゲル内を移動したと考えられるため。 ++++