Oshikane Lab Homepage

8/17（水）3～4限で実施する予定でいます。

【自己紹介】押鐘　浩之 都立日比谷高校、京都大学、東京大学大学院、東京工業大学大学院を経て博士（理学）取得後、 英国Medical Research Council分子生物学研究所研究員およびケンブリッジ大学Research Associateとして研鑽を積み、 帰国後、帝京大学医学部助教、同医療技術学部臨床検査学科講師を経て、 現在は大阪大学大学院薬学研究科特任准教授、および神奈川工科大学非常勤講師。 専門は生化学、分子生物学、分析化学、生物物理学、微生物学など。

研究テーマとして、タンパク質関連の研究（パーキンソン病病因タンパク質の動態など）を行ってきたが、 学生発案の研究テーマも積極的に取り入れている（例：カピバラの腸内環境に対する研究）。 最近では、タンパク質の立体構造の研究とともに 帝京大学文化財研究所との共同研究で、考古学分野の研究も行っている。

【ひとこと】 今回ご縁でこの様な機会を頂き、田中恵子先生、田中遼先生に改めて感謝申し上げます。 高校時代、三田高校にはオーケストラ繋がりで何度か足を運ばせて頂いたことがありますが、 再びこの様な形でお邪魔させて頂くとは夢にだに思いませんでした。 高校3年生ということもあり勉強で大変な時期とは思いますが、 皆さんに何か「面白い」と思って頂けるキッカケを作れればと思っております。 どうぞ当日は宜しくお願い申し上げます。

本実習では米粉・小麦粉といった身近な試料からDNAを抽出できるということ、 またアガロース電気泳動を通じてDNAを可視化できる、ということを体験して頂ければと思っております。 近年、高校生物および大学受験生物において、分子生物学的内容が多くなってきています。 また2019年のCOVID-19のアウトブレイクにより、“PCR”という言葉を聞かない日がございません。 実際にDNAを扱った実験を実施することによって、 高校生物の内容の充実は勿論のこと、将来的にこの種の実験・研究にも興味を持って頂ければ嬉しいです。

※当日の班分けについては、現在のところ未定。 また日にちが近くなったらwiki上でも記載したいと思います。

本実習の手技について、実験者視点での動画を作成致しました。 ただ機材の関係上、最長で5分の動画しか作れなかったため 分割してyoutubeにアップロードしてあります。 適宜、予・復習にお役立て頂ければと思います。

以下、高校教科書には中々ない記載かもしれませんが 私が大学で研究室配属になった学生さんに必ず教える事項です。 若し興味がありましたら目を通して頂けると嬉しいです。

細胞からDNAを抽出するには、細胞壁や細胞膜、核膜などを破壊しなければ出来ません。 有機化学っぽい話になりますが、技術的には大きく液液抽出と固液抽出というのがあります。 ざっくりとした身近な例でいうと、 液液抽出は油と水の分離、固液分離とはコーヒーやお茶を入れるような操作を云います。

液液抽出は、一般的に実験操作が簡便というのが利点ですが、 多量の溶媒を使用することが多いこと、また精製度が固液分離に比べて低いことに注意が必要です。 対照的に固液抽出は、実験操作として少し面倒ですが、 溶媒使用量が少なくて済むこと、また精製度が高いということが特徴です。

今回皆さんには固液分離を体験して頂きました。 “固”が白いカラム部位、“液”がカラムに通す液体と考えて頂ければと思います。 実際の研究現場でも、遠心分離機を利用したスピンカラムは核酸抽出・精製に多く使用されていることから 高い精製度のDNAを得る方法として経験して頂きたいという目的がありました。 液液分離のDNA抽出法も簡便で良いのですが、勿論皆さんも想像が付く通り 細胞にはDNA以外にもRNA、タンパク質、糖、脂質…色んな生体分子が含まれています。 これらの物質は、抽出したDNAを基にして行う後の実験に影響するかもしれません。 したがって、キッチリ精製しておきたいということで一般的にはDNAは固液分離で抽出します。

また“固”のカラムの部分の正体はシリカです。 スピンカラムを用いる方法の基礎は、1990年代に登場したBoom法と呼ばれている方法で、 一言でいうと「DNAはカオトロピックな雰囲気ではシリカに結合する」という性質を応用したものです。 カオトロピック剤とは、生体分子の1次構造を保持しながら高次構造（2次構造、3次構造、4次構造）を変化（変性）させうる物質を指し、 溶液全体としての乱雑さ（エントロピー）を増大させるような物質を云います。 身近な例としては、化粧品の成分を見ると“尿素”というのがあります→受験生としてはウェーラーを思い出すでしょうか？ 尿素はカオトロピック剤の代表例で、ざっくり言うとカチカチになった角質タンパク質を変性によって柔らかくする効果があります。

スピンカラムの場合に戻りますが、 核酸は皆さんもご存知の様にリン酸・糖・塩基からできていますが、 このリン酸部位に結合する水和水がカオトロピック剤によって奪われるためにリン酸基がむき出しとなるため、 シリカとリン酸基が疎水結合を形成することで結合します。

したがって、“液”の正体もカオトロピック剤です。 核酸抽出用途で使われるカオトロピック剤としては、グアニジンと呼ばれる物質のことが多いです。 最後、カラムからの溶出のために用いているのは蒸留水（またはバッファーなどが入っていても良い）で、 リン酸基に再び水を与えることで、カオトロピック剤によって形成された疎水結合が解消され 核酸溶液としてカラムから溶出できる、ということです。

※この様に、少し理解が難しいかもしれませんが、原理について説明してみました。 確かに実験所作としては、アレ入れてコレ入れて遠心して…と、 レシピを見ながらお料理する感覚で、実験はできてしまうかもしれません。 もちろんキチンと結果を伴って実験が出来るということは大切です。 しかし、実験原理を知らないで所作だけ覚えても何も意味が無いと私は考えます。

例えばBoom法を思い付いたBoomは、当然のことながら化学的な原理を考えながらBoom法を開発したはずです。 PCRもそうですが、今当たり前となっている技術は、開発当時は当たり前でなかったわけです。 どうやって「当たり前じゃない」を「当たり前」にするか？ それは原理に即した深い考察が重要になってくることは自明です。

当たり前に享受している技術というのも、実は先人たちのそうした知恵が詰まっています。 その知恵、つまり原理を理解することは、次のイノベーションの基礎となります。 当たり前を当たり前とせず、その原理を知っていく姿勢を若い方に伝えることこそが 教育という意味で重要と考え、この様なコラムを書かせて頂いています。

実習書にあるrpmとは、rotation per minuteの略であり、 1分あたりの回転数を示している（例えば3,000 rpmであれば、1分間に3,000回転という意味になる）。 それに対して、gは重力加速度を示しており、例えば3,000 gは地球の重力の3,000倍の力をかけている、という意味になります。

ここで注意したいのは、gは重力という不変的な値であるのに対して、 rpmはローター径によって実際にかかる力が違ってくる、という点です。 したがって、レポート、学会や論文等では、gで記載することがルールとなっています （若しくは、「ｘｘというメーカーのｘｘというローターでxxxx rpmで回転させた」と記載しても、 実験の再現性を担保できているのでOK）。

gとrpmの間の変換は：

を用いて計算することもできます。 ちなみに、今回の遠心機では12,000 rpmで約6,900 gです。

ただ、実験時にいちいちrpmやらgを計算するのも面倒なので 古典的にはノモグラム（gとrpm、ローターの半径の対応表）を使ってきた経緯があります。 現在は、例えばインターネット上のツール（https://www.kubotacorp.co.jp/calc/等）を使用できるほか、 遠心機にrpmとgの両方を表示するものが多くなってきたこともあり、 簡単にrpmとgとの間を変換できるようになっています。

遠心機はDNAなどの実験を行うのに必須となる実験機器です。 今回、例えば米粉・小麦粉についてBuffer A・Bを入れてDNAを溶出し遠心分離することで、 DNAを抽出した残りかす（研究現場ではデブリ：debrisといいます）と分離しました。 何故デブリが沈殿するかというと、DNA溶液に対してデブリの方が密度が大きいからです。 遠心分離は、物質間の密度の差を利用して分離を可能にする、と考えると良いです。

例えば、皆さんも恐らくDNAの半保存的複製というところでメセルソン・スタールの実験について 学習されていることとは思いますが、ここでも実験テクニックとして遠心分離が登場します。 ¹⁴NでできたDNAよりも¹⁵NでできたDNAの方が重い、 もう少し厳密にいうと、単位体積あたりの重さ（＝密度）が違う。 だからこそ、¹⁴Nと¹⁵NのDNAを分離できた、ということになります。

ちなみにメセルソン・スタールの実験では「密度勾配遠心」という特殊な遠心法を用いており、 ちょうど良い濃度の塩化セシウム溶液（水に比べて密度が高い）に対して 超遠心と呼ばれる、通常の遠心機よりも大きいgをかけられる遠心機を用いて ちょうど良い時間遠心をすることによって、教科書や資料集にもある様な例の結果が得られています。 「ちょうど良い」が２回現れましたが、実験結果をキレイに見せる条件を試行錯誤しながら求めるのも 研究という作業の１つになります。

今回PCRで標的とした遺伝子は、皆さんも学習されたと思いますがRuBisCOといって、 光合成の暗反応（カルビン・ベンソン回路）において実質的に炭酸固定を行うkeyとなる酵素です。 RuBisCOは４次構造として、小サブユニットと大サブユニットとが複合体をなす酵素であり、 興味深いことに緑色植物で小サブユニットは核DNA由来、大サブユニットは葉緑体由来です。 核由来の小サブユニットは細胞質のリボソームで翻訳された後、 葉緑体へ移動することで（N末端に葉緑体移行シグナルが存在する）、 葉緑体内で大サブユニットと複合体を形成して初めて、RuBisCOとして機能します。

したがって、今回PCRの標的とした遺伝子は、もう少し厳密に言うと 核にコードされたRuBIsCO小サブユニット遺伝子、ということになります。

今回、コメ由来のRuBisCO小サブユニット遺伝子を増幅するために使用した PCRプライマーの設計について、少し解説したいと思います。 ちなみに、プライマーを設計するのに役に立つ編集ソフトとして Freeソフトとして例えばApeなどがありますので、 興味ある方はダウンロードしてみては、と思います。

今回使用したプライマーの配列は、以下の通りです。 Fw:TGGTGAGCTGCAGAGATGG Rv:TTAGTTGCCACCAGACTCCTC

また、コメおよび小麦のRuBisCO小サブユニット遺伝子の配列は以下の通りです。 （図中、黄色い部分がタンパク質をコードしている配列。 ただし、コメではイントロンが１か所あるので、その部分は小文字にしている。）

Oriza sativa RuBisCO small subunit gene agccagagcccgggtcgagatgccaccacggccacaatccacgagcccggcgcgacaccaccgcgcgcgcgtgagccagccacaaacgcccgcggataggcgcgcgcacgccggccaatcctaccacatccccggcctccgcggctcgcgagcgccgctgccatccgatccgctgagttttggctatttatacgtaccgcgggagcctgtgtgcagagcagtgcatctcaagaagtactcgagcaaagaaggagagagcttggtgagctgcagagATGGCCCCCTCCGTGATGGCGTCGTCGGCCACCACCGTCGCTCCCTTCCAGGGGCTCAAGTCCACCGCCGGCATGCCCGTCGCCCGCCGCTCCGGCAACTCCAGCTTCGGCAACGTCAGCAATGGCGGCAGGATCAGGTGCATGCaggtaataacctactgacccaacacacattattcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcaacattaaccaataattcaattatcgtttatttAGGTGTGGCCGATTGAGGGCATCAAGAAGTTCGAGACCCTCTCCTACCTGCCACCGCTCACCGTGGAGGACCTCCTGAAGCAGATCGAGTACCTGCTCCGTTCCAAGTGGGTGCCCTGCCTCGAGTTCAGCAAGGTCGGATTCGTCTACCGTGAGAACCACAGATCCCCCGGATACTACGATGGCAGGTACTGGACCATGTGGAAGCTGCCCATGTTCGGGTGCACTGACGCCACCCAGGTGCTCAAGGAGCTCGAGGAGGCCAAGAAGGCGTACCCTGATGCATTCGTCCGTATCATCGGCTTCGACAACGTCAGGCAGGTGCAGCTCATCAGCTTCATCGCCTACAAGCCCCCGGGCTGCGAGGAGTCTGGTGGCAACTAAgccgtcatcgtcatatatagccttgtttaattgttcatctctgattcgatgatgtctcccaccttgtttcgtgtgttcccagtttgttcatcgtcttttgattttaccggccgtgctctgcttttgtttttgtttcacctgatctctctctgacttgatgtaagagtggtatctgctacgactatatgttgttgggtgaggcatatgtgaatgaaatatatggaagctccggctatatatatttatacaaagggtacgagatggatgtgaa

Triticum aestivum RuBisCO small subunit gene agagtgcctcctcctagcaagctatatacctacatagtacagccATGGCCCCCACCGTGATGGCCTCGTCGGCCACCTCCGTCGCTCCTTTCCAGGGGCTCAAGTCCACCGCCGGCCTCCCCGTCAGCCGCCGCTCCAACGGCGCTAGCCTCGGCAGCGTCAGCAACGGTGGAAGGATCAGGTGCATGCAGGTGTGGCCCATCGAGGGCATTAAGAAGTTCGAGACCCTGTCCTACCTGCCACCGCTCAGCACAGAGGCCCTCCTCAAGCAGGTCGACTACCTGATCCGCTCCAAGTGGGTGCCTTGCCTCGAGTTCAGCAAGGTTGGGTTTATCTTCCGTGAGCACAACGCATCCCCTGGGTACTACGATGGCCGGTACTGGACAATGTGGAAGCTGCCTATGTTCGGGTGCACCGACGCCACGCAGGTGATCAACGAGGTGGAGGAGGTCAAGAAGGAGTACCCTGACGCGTATGTCCGCATCATCGGATTCGACAACATGCGCCAGGTGCAGTGCGTCAGCTTCATCGCCTTCAAGCCACCGGGCTGCGAGGAGTCCGGCAAGGCCTAAacagctcactcaccacgggccacatataaagtgccattgcggttttgtcaactctgacattgctttgggttttcct

プライマーの設計のルールとしては、以下の通りです。

それぞれの理由について解説します。

①のポイントについて、先ずTmという言葉について解説しないといけません。 Tmというのは融解温度と言われており、定義としては「そのDNAの50%が相補鎖と水素結合をする温度」です。 皆さんも図表などでA:Tペアは水素結合が２本、G:Cペアは３本であることを見たことがあると思いますが、 水素結合は温度依存性があって、温度が高くなるについて切断されます。 したがって、A:TペアはG:Cペアに比べて水素結合が切断されやすいということが分かると思います。 Tm値計算においては経験的にAとTは２℃、GとCは４℃、などと簡易的に計算することがあります。 例えば、ATGGCCATAAGACTGというプライマーのTmは、 2+2+4+4+4+4+2+2+2+2+4+2+4+2+4といった感じで計算できます。

PCRの原理として、プライマーは鋳型DNAに「ちょうどよく」結合することが必要です。 「ちょうどよく」というのは、プライマーが目的とする鋳型配列に対して特異的に結合して、 かつ熱変性ステップではがれてくれる必要があります。 したがって、プライマーのTm値が低すぎると、ひょっとしたら鋳型の他の箇所に結合してしまう可能性もありますし、 また高すぎると熱変性ステップ（95℃）ではがれてくれないかもしれません。

そういった理由から、「ちょうどよい」Tmとして50～60℃になるようにプライマーを設計します。 また、このTm値をアニーリングステップ（熱変性の後のステップ）の温度として採用します。

②のポイントは、特異的結合を担保するための工夫になります。 もちろん3'末端がAやTでもPCRが上手くいくこともありますが、 GやCの方が水素結合が３本ありますので、特異的結合に寄与します。

③のポイントは、①にも関連しています。 GC含量が少なすぎると、特異的結合という意味で信頼性を失います。 逆にGC含量が多すぎると、鋳型DNAに対して結合しすぎる、という可能性があります。 経験的に、GC含量はこのくらいで収まるのが良いとされています。

④のポイントについて、BLASTについて説明しなくてはなりません。 BLASTとは、DNA配列のGoogle検索的なもの、と思って頂ければと思います。 使い方は至って簡単です。 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
HPが英語で取っつきにくいかもしれませんが、 今回はDNA配列について調べたいので“nucleotide BLAST”を選択します。 次に“Enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence(s)“という窓がありますので、 そこに自分が調べたいDNA配列を放り込みます。 最後に、下にある”BLAST”というボタンを押せばOKです。 （ただ、今回はコメ由来DNAが鋳型ですので、“organism”にコメの学名である“Oriza sativa”を入れて コメ遺伝子の中で検索をかけた方が、④の目的に叶うと思います。） すると、自分が調べたいDNA配列に対して、似ている順にDNA配列が表示されます。 （例えば上に貼り付けたコメ由来RuBIsCO遺伝子とか貼り付けてみて、遊んでみて頂ければと思います。）

自分が設計したプライマー配列が、目的遺伝子以外の配列と似ているとしたら もう少しプライマー配列を考え直した方が良いかもしれません。

以上、①～④の吟味をして、今回使用するプライマー配列を考え出しています。 最初に紹介しているApeなどのソフトを使用すれば、 簡単にプライマーを設計することが可能です（私もApeを使用しています）。 また今回設計したプライマーはコメのRuBisCO遺伝子配列には結合するが、 小麦には結合しないことも分かると思います。 だからこそ、今回のプライマーを用いてコメのRuBisCO遺伝子だけを「特異的に」増幅できる ということが配列から既に予想できると思います。