差分
このページの2つのバージョン間の差分を表示します。
| 両方とも前のリビジョン前のリビジョン次のリビジョン | 前のリビジョン |
| 2025年東京都立青山高等学校実習_形質転換実験 [2025/09/05 02:21] – oshikane | 2025年東京都立青山高等学校実習_形質転換実験 [2025/11/22 02:13] (現在) – oshikane |
|---|
| =====高等学校における形質転換実験プロトコール===== | =====2025年東京都立青山高等学校実習_形質転換実験===== |
| ====無菌操作==== | ====無菌操作==== |
| {{youtube>MNSNLPN7tPU}} | {{youtube>MNSNLPN7tPU}} |
| オペロン説に従えば、lacオペロンではinducerが存在していない時はリプレッサーにより転写が抑制されているはずなので、下流に存在する遺伝子は発現しないはずです。しかし、実験的には"leaky expression"といって、所謂「おもらし発現」をすることも知られています。今回GFPの発現を目的としていますが、ホスト細胞である大腸菌にとっては自分の生育に何も関係ないタンパク質の過剰産生は細胞にとって毒なはずです。したがって、ずーっと"leaky expression"が続いてしまうと大腸菌の生育にとっては不利益になり、細胞の生育不良を起こし、結局目的とするタンパク質の収量が激減するということも考えられます。 | オペロン説に従えば、lacオペロンではinducerが存在していない時はリプレッサーにより転写が抑制されているはずなので、下流に存在する遺伝子は発現しないはずです。しかし、実験的には"leaky expression"といって、所謂「おもらし発現」をすることも知られています。今回GFPの発現を目的としていますが、ホスト細胞である大腸菌にとっては自分の生育に何も関係ないタンパク質の過剰産生は細胞にとって毒なはずです。したがって、ずーっと"leaky expression"が続いてしまうと大腸菌の生育にとっては不利益になり、細胞の生育不良を起こし、結局目的とするタンパク質の収量が激減するということも考えられます。 |
| そこで、実は今回の実験系では2段階の遺伝子発現系を使うことで、"leaky expression"を出来るだけ無くすという工夫をしています（便宜上、lacオペロン→GFP発現という1段階でこれまで説明してしまいましたが）。ホスト細胞である大腸菌と、プラスミドに"leaky expression"を防ぐ仕組みがあります。先ず1段階目としてはlacオペロンにより、大腸菌のゲノムの方に存在する"T7 RNA polymerase"というタンパク質が出来ます。T7 RNA polymeraseはT7ファージというファージ由来のRNAポリメラーゼですので、大腸菌が元々持っているわけがありません。2段階目として、プラスミド上にT7 RNAポリメラーゼが結合できる部位が存在して、lacオペロンによって産生されたT7 RNA polymeraseがプラスミド上で転写を開始することによって、目的となるタンパク質を産生します。この様に目的タンパク質の産生において、面倒そうな2段階式にすることによって"leaky expression"を防いでいます。 | そこで、実は今回の実験系では2段階の遺伝子発現系を使うことで、"leaky expression"を出来るだけ無くすという工夫をしています（便宜上、lacオペロン→GFP発現という1段階でこれまで説明してしまいましたが）。ホスト細胞である大腸菌と、プラスミドに"leaky expression"を防ぐ仕組みがあります。先ず1段階目としてはlacオペロンにより、大腸菌のゲノムの方に存在する"T7 RNA polymerase"というタンパク質が出来ます。T7 RNA polymeraseはT7ファージというファージ由来のRNAポリメラーゼですので、大腸菌が元々持っているわけがありません。2段階目として、プラスミド上にT7 RNAポリメラーゼが結合できる部位が存在して、lacオペロンによって産生されたT7 RNA polymeraseがプラスミド上で転写を開始することによって、目的となるタンパク質を産生します。この様に目的タンパク質の産生において、面倒そうな2段階式にすることによって"leaky expression"を防いでいます。 |
| 今回使用している大腸菌株はRosetta (DE3)というもので、このゲノムDNA内にlacオペロン支配下のT7 RNA polymeraseがコードされています。またプラスミドの方はpETシステムと言われるものを使用しており、上流にT7 RNA polymerase結合部位を有することが特徴です。大腸菌株としてT7を持たない株を利用してしまったり、この組み合わせを間違えると、当然目的タンパク質は産生してくれませんので注意が必要です。 | 今回使用している大腸菌株はBL21(DE3)という株で、このゲノムDNA内にlacオペロン支配下のT7 RNA polymeraseがコードされています。またプラスミドの方はpETシステムと言われるものを使用しており、上流にT7 RNA polymerase結合部位を有することが特徴です。大腸菌株としてT7を持たない株を利用してしまったり、この組み合わせを間違えると、当然目的タンパク質は産生してくれませんので注意が必要です。 |
| |
| **【発展的内容２：codon usage】** | **【発展的内容２：codon usage】** |
