マウス (CD31、ＭΦ､Ｔ細胞、アクチン　免疫染色)　　

Vector Red

　　　

平成　年　月　日　　 イニシャル　 Red

サンプル

総数　　　

0. 切片の脱パラフィン化、re-hydration →　PBS^2- 5分→　PBS²⁺ 5分→　PBS^2- 5分

1. ブロッキングとPAP penで囲い込み。

0.5% rabbit serum RT 10分

PBS 2 ml + rabbit serum 10 μl

2. 一次抗体

一次抗体

A B C D

Ａ　(1: 100) PBS 100μl x (n+1) = μl

抗マウスCD31(MEC13.3, pharmingen 01951A ビオチン無) 　 1μl x (n+1) = μl

B　(1: 100) PBS 100μl x (n+1) = μl

抗マウス単球F4/80 (MCA 497) 　 1μl x (n+1) = μl

C　(1: 500) PBS 500μl x (n+1) = μl

抗マウスT CD3ε(48-2B, SC-1174) 1μl x (n+1) = μl

D　(1: 200) PBS 100μl x (n+1) = μl

抗SM アクチン(sigma) 0.5　μl x (n+1) = μl

ブロッキング液を吸引後、100μlづつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

⇒ RT　2h or 4 ^oC O/N.（　月　日　時　分　→　月　日　時　分）in moist chamber

3. 洗浄 PBS　5分　３回

4. 二次抗体　

A&B PBS 100μl x (n+1)x2 = μl

ビオチン付抗ラットIg（DAKO） 0.5μl x (n+1)x2 = μl

C PBS 200μl x (n+1) = μl

ビオチン付抗ハムスターIg 0.5μl x (n+1) = μl

Ｄ PBSにつけたまま　（∵一次抗体にAP付いている）

PBSを吸引後、100μlづつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

⇒　RT　1h or 4 ^oC O/N.（　月　日　時　分　→　月　日　時　分）in moist chamber

5. 洗浄 PBS　5分　３回

6. ABC-AP mix　(アルカリフォスファターゼ付ストレプトアビジン)

　PBS 5ml + 試薬Ａ液（キット赤小瓶）１滴　+ 試薬Ｂ液（キット赤小瓶）１滴　→　mix（30分以内に使用する）

→　PBSを吸引後、200μlづつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

⇒RT　30分 or 4 ^oC O/N.（　月　日　時　分　→　月　日　時　分）in moist chamber

7. 洗浄 PBS　5分　３回

8. 発色　(Vector Red ---非水溶性)

100 mM Tris-HCl(pH 8.2) 5mlを混合用ポリ瓶に入れる（コニカルチューブも可）

+ 試薬1　２滴　→　mix

+ 試薬２　２滴　→　mix

+ 試薬３　２滴　→　mix

→　PBSを吸引後、数滴づつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

　　 ⇒RT 30-60分。

9. ラックにいれて流水（水道水）で5分洗う。

10. Harris　のヘマトキシン１０秒。

11. ラックにいれて流水（水道水）で5分洗う。

12. 脱水⇒マウントクイック