- 皮膚などの切り出し標本の神経線維からの記録
- 新生ラット脊髄の摘出標本での記録
- 培養細胞のパッチクランプ
- スライス標本パッチクランプ
- 麻酔動物の侵害受容神経の線維からの記録
- 麻酔動物の侵害受容ニューロンの細胞内記録、細胞外記録
- 麻酔動物の侵害受容ニューロンのインビボパッチクランプ
- 「in vivoパッチクランプ法の実際と適用」（吉村 恵）
→日生誌65巻10号 314- (PDF)
- 「マウスおよびラット脊髄後角細胞からのin vivoパッチクランプ記録法」（古江秀昌、園畑素樹、吉村 恵）
→日生誌65巻10号 315-321 (PDF)
- 「ラット大脳皮質体性感覚野からのin vivoパッチクランプ記録法」（土井 篤、水野雅晴、古江秀昌、吉村 恵）
→日生誌65巻10号 322-329 (PDF)
- 「後根神経節細胞からのin vivoパッチクランプ記録法の実際」（八木淳一、小林 靖、平井直樹）
→日生誌65巻11号 358-365 (PDF)
- 「生理学研究所 生理科学実験技術トレーニングコース テキスト
→スライスパッチクランプ法
- 「in vivoパッチクランプ法の実際と適用」（吉村 恵）
微小興奮性シナプス後電流 miniature EPSC：mEPSC
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| 微小抑制性シナプス後電流 miniature IPSC：mIPSC
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電気生理学的手法では、刺激に対する生の反応を見ることができる。
微小電極法
LingとGerardによって、尖端の太さ1ミクロン程度のガラス管を電極として用いる微小電極法が開発されて、単一神経細胞の電気活動を記録することができるようになった。
Ecclesらの細胞内記録法
Mountcasleらの細胞外記録法
Extracellular spike potentials
メリット：電極をニューロン内に刺入せずにスパイクを記録するので、細胞を傷害しない。それで、脳のマッピングには適している。
デメリット：脱分極の程度がわからない。
- 電極近傍の神経細胞の活動
- 目的とする脳部位に測定電極（関電極）を刺入し、十分に離れて電気的変動の少ない部位に基準電極（不関電極）を設けると、神経細胞の集団活動の結果生じる局所フィールド電位 local field potential (LFP）を記録することができる。一般には、低いインピーダンス（数百kΩ程度）の金属電極やガラス電極を使用し、１Hz以下から数百Hzまでの成分を含む、数～数百μV程度の振幅の電位変化を観測の対象とする。機械的変位に強く、行動中の動物から長期間にわたって記録することが可能である。
- 拾っている細胞内イベント：主にシナプス電位
電極抵抗：200k−800kΩ
活動を拾う範囲 (半径)：0.5 − 3mm - 大脳皮質の局所フィールド電位を頭皮上から間接的に測定したものが脳波で、硬膜下から間接的に測定したものが皮質脳波（electrocoticogram, ECoG）である。局所フィールド電位を深部脳波と呼ぶこともある。
- 大脳皮質内のネットワーク活動はLFPに反映される。
- 大脳皮質などで観測される局所フィールド電位は、主に錐体細胞群への集団的なシナプス入力によって発生すると説明される（フィールドfield EPSP）。
- 大脳皮質の錐体細胞の尖端樹状突起の遠位部（皮質浅層に相当）に興奮性のグルタミン酸作動性のシナプス入力が来た場合、グルタミン酸受容体を介して陽イオンが細胞内へ流れ込む（吸い込み、シンクsink）。この電流は樹状突起内を流れて近位部などから細胞外へ流れ出る（湧き出し、ソースsource）。局所フィールド電位は、シンク付近でマイナス、ソース付近でプラスの極性を示し、このシンクとソースの対を双極子dipoleと呼ぶ。双極子の方向に沿って等間隔の部位から得られた局所フィールド電位を使って電流源密度解析 current source density (CSD) analysisをおこなうと、記録部位に沿ったシンクとソースの時間的、空間的分布を調べることができる。
- 標準的な多点電極
- 自由に行動する動物の生きた脳から、一つ一つの神経細胞の活動を記録する方法
- 直径0.02mmのタングステン線４本を束ねた特殊電極
- 絶縁コーティングされた極細の金属線4本を捩ってから、絶縁コーティング剤を熱で溶かしてから冷やして4本を固めることで、一本のtetrodeは作成される。
- 極細の金属線は、H.P.Reid社製のニクロム線やCalifornia Fine Wire社のタングステン線が多く用いられている。
- 4本の電極を束ねたテトロード電極を使用し、各電極から検出される活動電位の差から電極周囲にある複数の神経細胞の活動を同時に記録することができる。
- マウスからのテトロード記録は、Matthew A. Wilsonらが世界で初めて確立した。
- Wilson と McNaughton は、海馬CA1 野にテトロード電極を十数本埋め込み，ランダムに投げ入れられるエサを求めてオープンフィールド内を走り回るラットから，最大148個の錐体細胞の活動を同時計測した(Gray et al., 1995) 。1
| 局所フィールド電位 Local Field Potential：LFP ←→深部脳刺激
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| テトロード記録 tetrode 1
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| ■研究法 | │光遺伝学、オプトジェネティクス Optogenetics│ |
→チャネルロドプシン2/アーキロドプシン3/ハロロドプシン/DREADD
→Tonegawa labo →Kato labo
- Karl Deisseroth（1971年〜 スタンフォード大学の精神科教授）が開発した技術
- 光遺伝学 Optogenetics：光学的手法（opto）と遺伝子操作(genetics）を組み合わせた生命機能解析法
- 光（opto）と遺伝学（genetics）を組み合わせたことから光遺伝学と呼ばれるが、「遺伝学」というわけではない。
- In vivoで 特定の神経細胞を、光照射のオン・オフだけで，ミリ秒単位で精緻に操作できる特徴をもつ技術
- 脳神経系における情報処理を理解するため、哺乳類やその他の動物においてin vivoでのミリ秒単位の時間的精度をもった制御を特徴とする。
- オプトジェネティクスとは、光によって活性化されるタンパク分子を遺伝学的手法を用いて特定の細胞に発現させ、その機能を光で操作する技術である。
- オプトジェネティクスの登場により、生命活動下にある特定細胞がどう働いているのかを調べることが可能になった。
- チャネルロドプシンなどの遺伝子改変動物を使ったオプトジェネティクスでは、特定の神経細胞の興奮・抑制をレーザー光やLEDで任意に捜査できるため、システム脳生理学的なブレークスルーを神経科学にもたらす革新技術である。
- 発色団としてレチナールとよばれる低分子化合物を結合したロドプシンファミリータンパク質により担われている。
- ヒトの眼の中にあるロドプシン（動物型ロドプシン）は光を吸収すると、セカンドメッセンジャーである三量体Gタンパク質を活性化する。
- 一部の微生物がもつ微生物型ロドプシン（バクテリオロドプシンなど）は光を吸収すると、細胞外へプロトンを汲み出しプロトン濃度勾配を形成することで，とくに嫌気性条件でのエネルギーの獲得に重要なはたらきを示す。
- メリット
- 遺伝子導入（ウィルスベクターなどを使って）によって光応答性タンパク（チャネルロドプシンなど）を目的細胞で発現させる
- マウスの頭蓋にLED光源を埋め込んで光で脳機能のON/OFFさせる
- 生命機能との関連を追跡する
- 生きたままの動物に使える
- 細胞（群）レベル・ミリ秒タイムスケールでの解析ができる
- 可逆的・即時的・生体直交的に細胞機能を操作/制御できる
- ChRを特定の細胞に発現させておいて、領域全体に光をあてる。光に応答する細胞はChRを発現する細胞だけで、その他の細胞は光には応答しない。特定の神経細胞だけを操作できる点が優れている。さらに優れている点は、光のオン、オフに素早く反応することである。素早い（ミリセカンド）応答ができることから、1Hzの発火も、40Hzの発火も光で作り出すことができてしまう。
- 遺伝子にコードした蛍光色素を使って神経活動を可視化し、ニューロン同士の接続や特定のニューロン集団の機能を見たり、光のスイッチを切り換えて，ニューロンを遠隔操作することもできる。
- 光遺伝学の対象は急速に拡大している。そのひとつは低分子量G蛋白質である。
- Cre-loxPシステムを用いて特定の脳領域・細胞種(特定のニューロンやグリアなど)にChR2を高発現できるノックインマウスの作製を目指している。そして、これが汎
- 遺伝子導入によって光応答性タンパク（チャネルロドプシン）を目的細胞で発現させる
- 目的細胞に光を当て、細胞応答を変化させる
- 生命機能との関連を追跡する
1971〜1977 自然界のロドプシンたんぱくの発見 1971年 バクテリオロドプシン（BP） 1977年 ハロロドプシン（NpHR） 1995年 ドイツの研究グループが緑藻類の走光性にかかわる新規の微生物型ロドプシンを発見 2001年 かずさDNA研究所と米国デューク大学が公開したクラミドモナスのゲノム配列から、クラミドモナスがもつ光に対する反応性（走光性など）の起源としてChR1とChR2の構造が同定され、光応答性のイオンチャネルとして働くことが示された。 2002年 Peter Hegemann（1954/12/11〜, ドイツフンボルト大学の生物物理学者）が光を受容しNaを通す新しいタイプの分子を発見し、チャネルロドプシン（channelrho-dopsin：ChR）と名付けた。 1 2002年 Miesenbockらがショウジョウバエのロドプシンとその下流のGタンパク質αサブユニット、およびアレスチンを海馬培養神経細胞に発現させ、光照射による活動電位の誘導に成功した。 2003年 チャネルロドプシン2（ChR2） 2005年 チャネルロドプシン2（ChR2）の青色光照射による神経細胞活動の高速制御が発表されて以来神経科学の分野で爆発的な進展と応用が始まっている。 2005年 Miesenbockらが、ショウジョウバエの神経細胞にイオンチャネル型ATP受容体を導入し、光照射によりケージドATPをリリースするという手法を用いて行動を惹起することを報告した。 2005年 Karl Deisseroth（1971年〜 スタンフォード大学の精神科教授）がレンチウイルスベクターを用いてチャネルロドプシン2（ChR2）を海馬の培養神経細胞に発現させ、光によってその神経活動をミリ秒オーダーで活性化することに成功した*。2006年のペーパーの中で、「optpgenetic」という用語を使った。 2006年 東北大学の八尾先生らの研究グループが、シンドビスウイルスベクターを用いて生きたマウスの海馬神経細胞にチャネルロドプシン2を発現させ、光強度依存的に活動電位を誘導することに成功した。 2007年 生きたマウスのニューロンにチャネルロドプシンを発現させ、光ファイバーを脳内に挿入することでこれを興奮させてマウスの行動を制御することに成功した。 1 2009年 Klaus Hahnらがphototropinを使用したPA (photoactivatable)-Racを報告した (Wu et al 2009)。 Neuroscience 2009では、同じグループにより既にPA-RhoA, PA-Cdc42なども作られていることが報告された。 2009年 Neuroscience 2009では、Karl Deisseroth↑により、チャネルロドプシン2にGPCRを融合させた型の光遺伝学ツールが発表された。これにより、光刺激でcAMP、IP3、DAGといったセカンドメッセンジャーの産生を局所で制御できる。
チャネルロドプシン - 緑藻の一種・クラミドモナスに発現している光受容イオンチャネル
チャネルロドプシン1 (ChR1) - 緑藻類クラミドモナスの眼点から同定された、光活性化陽イオンチャネル
- 青〜緑色光に応答する
- 水素イオンを通す
チャネルロドプシン2 Channelrhodopsin-2, ChR2 - 光活性化タンパク質
- 緑藻類クラミドモナスの眼点から同定された、唯一の光活性化非選択的陽イオンチャネル
- 7回膜貫通型Gタンパクの一種
- 陽イオン：水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどを通す。
- 470 nmの青色光照射によって最も強く活性化される。
- これによって電位依存性Na+チャネルが開口して活動電位を発生する。
- ChR2の発色団としてall-trans-retinal (1)がChR2のヘリックス7のリジン残基とプロトン化Schiff塩基を形成していて、青色光を吸収して13-cis体(2)に異性化することでタンパク質部分の構造変化を引き起こし、その結果イオンチャネルの開閉を誘発することができる。
- 青色光を受容すると非選択的陽イオンチャネルが開口し、その結果ChR2発現細胞は脱分極応答を示す。
- 青色光（400〜500nm）を照射する時、最も強く活性化される。青色光を受容すると、チャネルロドプシンが開口して、細胞内にイオンが流入、脱分極が引き起こされる。
- 青色光で活性化されると、細胞外から細胞内へNa+やCa2+などの陽イオンを透過する作用により膜電位が生じて、神経細胞が活性化する。
- 光照射からチャネルが開口するまでの反応時間 τon は非常に早く、30マイクロ秒以内である。
ハロロドプシン Halorhodopsin：NpHR - 抑制に用いられる光活性化タンパク質
- 古細菌高度好塩菌 Natronomas pharaonisから同定された光活性化クロライドイオンポンプ
- 590 nmの黄色光照射によって最も活性化される。
- 黄色光を受容すると内蔵ポンプが駆動し、細胞外から細胞内にクロライドイオンを流入させ、結果として過分極応答を示す。
- 細胞外側から細胞内側へCl-を輸送する "光駆動クロライドポンプ"
- 2007年にハロロドプシンが神経活動抑制分子として最初に光遺伝学に導入された。
- Deisserothのグループと、2005年のChR2論文の筆頭著者でその後Deisseorthラボから独立したBoydenのグループは、2007年にそれぞれ高度好塩古細菌Natronomonas pharaonis由来のハロロドプシン、NpHRを神経細胞に発現させ、黄色光を照射することで細胞を過分極できることを示した。
アーキロドプシン3 archaerhodopsin-3 - 古細菌、真正細菌、植物、菌類のゲノムデータから、微生物型ロドプシンの相同性検索により同定された光活性化プロトンポンプ
- 古細菌高度好塩菌（Natronomas pharaonis）から同定された光活性化クロライドイオンポンプである。
- 古細菌高度好塩菌の一種であるHalorubrum sodomense由来であり、550 nmの緑色光照射によって最も強く活性化される。
- 緑色光を受容するとポンプが駆動し、細胞内から細胞外へプロトンイオンが排出される。その結果、細胞膜電位は過分極し、活動電位が生じにくくなり、神経細胞の活動が抑制される。
- ハロロドプシンと比較して、光感受性が高く、光応答電流が大きい。また脱感作しにくい性質を持つため、長時間刺激や繰り返し刺激に適している。
アーキロドプシンT archaerhodopsin-T：ArchT- 光駆動プロトンポンプ 光刺激に同期して細胞外にプロトンを排出することで膜電位が過分極となり、活動電位の発生を抑制する。
- アーキロドプシン3の配列をもとに、Halorubrum属のゲノムデータから相同性検索によりHalorubrum TP009系統から同定された。アーキロドプシンTもプロトンポンプを形成していて、緑色光を受容するとポンプが駆動し、細胞膜電位は過分極を示す。
- アーキロドプシン3と比較して、20 mW/mm2以下の光強度での光応答電流が大きく、光感受性も3倍程度良い。570 nmの緑色光照射によって最も強く活性化される。
LOV（light oxygen voltage domain）ドメイン 参考 1 GAVPO 参考 1 - LOVドメインの応用型
- 今吉先生
ファイバーフォトメトリー fiber photometry - In vivo蛍光検出法の一つ
- 光を用いて神経活動を測定する技術のひとつであり、光ファイバーを脳に刺入して自由に行動中の動物の脳内の特定神経活動を記録することができる技術
- 臓器に蛍光プローブを導入後、光ファイバーを埋め込み、光ファイバーを介して励起光の照射と蛍光の検出を行う。
- 装置はレーザーあるいはLED光源、ダイクロイックミラー、ファイバーパッチケーブル、光検出器やカメラなどの検出系から成る。Creマウスやウイルスベクターを用いた遺伝学的手法により蛍光プローブを導入する細胞を限定すること で、特定の細胞群における蛍光変化を in vivo 自由行動下でリアルタイムに捉えることができる。
- 神経活動に伴う細胞内カルシウムイオン濃度上昇を蛍光強度の増大に変換することができるGECIと組み合わせることで、脳局所における神経 活動を観察できる。ただし、空間分解能は低いため、個々の細胞から の蛍光を区別したり、細胞内局在を観察したりすることは難しい。そのような場合には、小型顕微鏡 miniscope を使用するなど、目的に応じて使い分けることが必要である。
- 遺伝子工学的に特定の細胞にだけ発現する極めて鋭敏なカルシウムセンサーを、脳内に埋め込んだ400µの光ファイバーを通して励起し、それによって生まれる光を同じファイバーを通して検出することで、標的とする神経細胞の全活動を高感度に持続的に検出できるようにする技術
- 興味のある神経細胞集団の活動を、集合細胞内カルシウム濃度変化として計測する技術
- 動物の自由度はダイアリシスと同等であるが、時間分解能は圧倒的に優れる。
テレオプト Teleopto 参考1/2 - ワイヤレスオプトジェネティクスシステム
- 名古屋大学環境医学研究所の山中章弘教授とバイオリサーチセンターが共同開発した。
- リモコンで光照射することにより、光感受性タンパク質をもつ細胞が活性化される。
Pulseモード：Pモード - トリガーパルス通りに発光し高頻度パルス刺激
Continuousモード：Cモード - トリガーパルスごとに光のOn/Offが切り替わり、継続光照射ができる。
| ■研究法 | │化学遺伝学、ケモジェネティクスChemogenetics│ |
- 高分子を操作して、これまで認識されていなかった小分子と相互作用するプロセス
- 標的タンパク質に小分子結合性ドメインを融合したものを細胞内に発現させ、その融合タンパク質の機能を小分子リガンドの添加によって制御する研究法
- 用語としての化学遺伝学は、もともとナデシコの花の基質特異性に対するカルコンイソメラーゼ活性に対する突然変異の観察された影響を説明するために造られた。
- DREADDに代表されるような受容体の人為的活性制御を用いる研究手法
- オプトジェネティクスとよく似ているが、オプシンとして知られる光および光感受性チャネルの代わりに、化学的に操作された分子およびリガンドを使用する。
- ケモジェネティクスは高価な照明器具を必要としないため、よりアクセスしやすい。
Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs：DREADD 参考1 - 化学遺伝学 Chemogenetics
- ノースカロライナ大学の Bryan L. Roth博士らの研究によって開発された受容体
- DREADDは人工受容体の一種であり、生体内に存在するリガンドには応答することはない。
- DREADDに結合するようにデザインしたリガンドだけがDREADDに結合できるので、特定の部位にDREADDを移植すれば、その部位の機能を解析したり、機能を人工的に操ることができる。
- ムスカリン受容体のアミノ酸配列を一部変更した受容体を用いて、特定の神経細胞の神経活動を増加又は抑制する方法
- 受容体にはいくつかの種類があり、神経活動を高めるためにはhM3Dq受容体を、抑制するためにはhM4Di受容体を主に用いる。
- clozapine-N-oxide：CNOはDREADDの特異的アゴニスト薬剤
- hM3DqとhM4Diは、生体内に存在するアセチルコリンには反応しないが、CNOによって特異的に活性化又は抑制する。
- 全身投与されたCNOはDREADDに選択的に結合し、発現している細胞の活性を高めるので、この原理を利用して移植細胞の遠隔制御が可能になる。
- この受容体を特定の神経細胞に発現させた後、CNOを投与することによって、目的とする神経細胞の活動を変更することが可能。CNOは、飲料水に入れて摂取させる、または注射するによって、脳の中に入り、神経活動を操作できる。
- 遺伝子改変したGタンパク質共役受容体：GPCRと、合成したデザイナーリガンドなども開発されている。
人工受容体 Designer Receptors ←→受容体 - 本来生体内に存在する受容体（内因性受容体）に数塩基の遺伝子変異を入れることにより作られた、本来生体にはない受容体
- 内因性のリガンドは作用せず、合成リガンド選択的に活性化される人工受容体
human Gq-coupled M3 muscarinic receptor：hM3Dq受容体 - 変異型アセチルコリンM3受容体
- 変異によりアセチルコリンの親和性が低下し、本来M3受容体への結合が弱いCNOの親和性が高まっている。
- Deschloroclozapine(DCZ)：新規DREADD特異的リガンド、DCZはclozapineと異なり低濃度ではDREADD以外の受容体に結合・作用しない。
human Gi-coupled M4 muscarinic receptor：hM4Di受容体 - 人工的にデザインされた、変異型アセチルコリンM4受容体
- clozapine-N-oxide：CNOに結合するように人工的にデザインされた受容体
- 抑制性DREADD GPCR
- Gi共役型のGタンパク共役型受容体（GPCR）であり、神経細胞においてこの受容体を活性化させると、下流シグナルによりカリウムチャネルを開口させることで膜電位の過分極を引き起こし、細胞活動を抑制することが可能となる。
- hM4Di受容体は、CNOと結合すると、神経活動を低下させることができる。
- 自発運動によって促進される歯状回の神経新生は恐怖条件付け文脈記憶の忘却を促進させる。 1@Frankland
若泉謙太先生の研究 1/2
Dr Kato's Labo *
Arimura2019/Sugimoto2021/Yajima2022
→広汎性痛覚痛覚過敏モデル/aWSP
Pain Relief 