• マイクロダイアリシス法は、微小透析プローブの半透膜を介して、物質を連続的に回収する方法。
• In Vivoの条件下、麻酔下あるいは覚醒下動物の細胞外液、髄液、血液中の物質を連続的に回収し、神経伝達物質放出および代謝物のような 内因性物質などをモニターする。
• 逆に、薬物を溶かした環流液を組織内に送り込めば、局所的な微量薬物注入法としても利用できる。
  
  
• カロリンスカ研究所のUrban Ungerstedtは1974年腎臓透析に用いられる細い人工血管を脳に埋め込んでモノアミンを回収した。彼らが始めて試みた中空糸状の透析チューブによる組織透析を一般にマイクロダイアリシスが呼ばれるようになった。
• 1966年Bitoらは、太い透析チューブを用いて、どのアミノ酸が脳へ移動し易いかを研究し、脳内ｍicrodialysis(微小透析法)の研究が始まった。

原理
　半透膜の性質を利用して、細胞間隙に存在する様々な物質を単純拡散により環流液に回収する。

• 細い透析チューブ（直径0.2-0.5m)を生体に埋め込み、細胞外液と環流液を半透膜で隔てる。
• 微量注入ポンプを用いて環流液（リンゲル液または人工脳脊髄液）を透析チューブの中にゆっくり送り込む。
  　その結果、半透膜の分画分子量より小さい物質は細胞外液あるいは環流液からそれぞれ濃度勾配の低い方向へと拡散していく。

メリット

• 注入される環流液は、膜の内側を環流するので、直接組織と触れることがないので、組織損傷は比較的少ない。それで、長時間にわたって試料の採取が可能である。
  　（プッシュプールカニューレは、環流液の回収率が高く、微量な神経伝達物質の測定に有効であるが、送液速度が速く、組織の剥離によるダメージや感染を起こす欠点がある。）
• 透析膜を介して得た試料は比較的汚れが少なく、予備精製なしで簡便に分析を行うことができる。
• 同一試料から、多くの神経伝達物質を同時に単離、同定できる。
• 透析膜はフィルターの役目をしており、分解酵素などの高分子量の物質を通過させないので、回収した伝達物質が環流液の中で分解されることがない。
• 方法によっては、ある特定の神経活動に伴って放出される神経伝達物質を、free movingの状態で測定できる。

デメリット

• 伝達物質や各種イオン、その他の物質を絶えず排出することになるので、細胞外液のホメオスタシスをこわす危険がある。それを避けるためには、できる限りゆっくり環流したり、グルコースなどの栄養源を環流液に補充する。
• 試料中の物質濃度が細胞間隙の実際の濃度を部分的にしか反映していないため、細胞外濃度が低い神経物質の測定は困難である。
• 時間分解能に劣る。
• 急性実験では、麻酔、手術による影響を考慮する必要がある。

プローブ

• プローブは細胞間隙に存在する分子量5,000〜25,000Daltons以下の物質を回収する。
• プローブは神経伝達物質の放出をモニターするシナプスの大きさに比べて1000倍程も大きい（0.15-0.7 mm）。
• 透析膜上には種々のサイズの穴が空いている。また、膜厚も30-500 umと幅広い。そのため、透過する物質は水､NaClなどの無機物質、アミノ酸といった低分子量から、数千のペプチド、糖、そしてBSAより大きい高分子の蛋白質を透過する膜まで存在する。Microdialysisに多く使用される膜は阻止率(cut off)が90%で､分子量10,000以下の膜が使用されている。
• 神経伝達物質の多くが分子量1,000以下であり、透析膜の回収率も10％以上の膜が使用される。神経ペプチド、神経栄養因子などは1,000-10,000であり、これらの透析には大きな膜穴を持ち､非特異的吸着の少ない膜を選ぶことが必要である。高分子用の膜を使用しても、回収率は10％以下である。
• 灌流液には、リンゲル液､クレブスーリンゲル(Krebs-Ringer)液などが使用され､灌流速度は1-10 ul/minであり、早くなれば回収率は低下する。
• 透析膜の種類によっては、大きさや性質の異なった分子が回収される。
  
  • 再生セルロース(cuprophan) 、セルロースアセテート(cellulose acetate)
    　---低分子の物質の透析
    
  • ポリアクリロニトリル(polyacrylonitrile, PAN)、ポリカーボネート(polycarconate, PC)
    　---神経ペプチド
    　　ポリカーボネート膜はセルロース膜と比べて透析効率が大変優れている。
  • ポリスルフォン(polysulfon, PSF)
  • ポリエーテルスルフォン(polyethersulfon, PES)
  • ポリメチルメタクリレート(polymethyl methacrylate, PMMA)
  
  
• 髄液マイクロダイアリシス　*
  
• 貫通型プローブを用いた脊髄でのマイクロダイアリシス　*
  

クロマトグラフィー chromatography 液体クロマトグラフィー LCは，微粒子等(充填剤)を詰込んだ筒状のカラムに水や有機溶媒などの液体を流しながら、カラムの物理的性質にてサンプルの成分の分離を行う。 移動させる液体（移動相 mobile phase）と充填剤に浸透させる液体（固定相 stationary phase）の間で分配することにより、混合物中の各物質を、電荷や分子の大きさ、その他によって単離する生化学の技術。 移動相 mobile phase：試料を含む緩衝液を添加した後、さらに緩衝液をカラム中に送り込んで試料を移動させる。（グルタメート分析用の移動相には、緩衝液は含まれない。 カラムの充填剤には、分配・吸着・イオン交換・ゲル浸透といった種類がある。 一般に，カラム内部の粒子を小さくすることで実効表面積を増やしたり、カラムの形状をより細長くすることで分離性能を向上させることができるが、送液の圧力が高くなる問題が生じる。 これらの高圧に対応できるポンプや配管などで構成され、微量分析に対応する高感度の検出器をそなえたLCを、HPLCと呼ぶ。 ．

HPLC HPLCは、ステンレス製の密閉カラムを用い、ポンプで高い圧力をかけ、固定相中の微細間隙を高速で通過させ、試料中の各成分の分子のサイズや荷電、移動相（溶媒）への溶解度の差などによって成分を分離する。 HPLCによって得られるクロマトグラム上には、成分に相当するピークが特定の位置に現われ、そのピーク面積は成分の相当量に比例する。 一方、MSはその物質が何であるかを同定する「定性分析」能力に優れている。しかし、MSでは多種の混合物を同時に同定することは困難。 そこで、まず混合物の分離手段としてHPLCを用いて混合物を各成分に単離し、直接MSで検出することにより、各成分の定性分析が容易になる。

検出器 detector タンパク質も核酸も紫外線を吸収するため、紫外線の吸収を測定することにより各分画のタンパク質濃度もしくは核酸濃度を測定するのが一般的である。 通常、HPLCシステムは紫外線吸収を測定する検出器を備えている。また、タンパク質精製においては、各分画の酵素活性を測定したり、特異的抗体を用いたりして目的のタンパク質の検出を行うことも多い。 HPLC用検出器には、主に、紫外線可視分光検出器(UVD)、蛍光分光検出器(FLD)、電気化学検出器(ECD)などがある。 カテコラミン類とセロトニンなどの電気化学活性を有する物質は、電気化学検出器(ECD)をそなえたHPLC法により好感度分析が簡便に行われる。 アセチルコリンやアミノ酸などの電気的に不活性な物質でも、酵素反応や化学反応により電気化学的に活性物質に誘導すれば、HPLC-ECD法で測定できる。 　＝ECDや蛍光検出器を組み合わせたHPLC法　→グルタメートの測定 神経ペプチドの分析は、ラジオイムノアッセイ、エンザイムアッセイを利用する。

• 連続モニタリングには、脳内あるいは血管内にバイオセンサーを直接装着して測定する方法､microdialysisプローブ、push-pullプローブを装着して試料を連続して回収し､バイオセンサーで測定する方法がある。
• バイオセンサーは、In vivoでの脳内や血中などでの使用や、組織培養液中での組織分泌物センサーとしての用途がある。バイオセンサーを組織に差し込んでセンサー内にグルコースオキシダーゼを注入するとセンサー周辺のグルコースが透析膜内に浸潤し、酵素によって分解され電位を生じる。この電位を測定することでセンサー周辺のグルコース濃度が測定できる。
• バイオセンサーを直接装着して測定する方法として､酸素電極､pH電極､あるいは酵素修飾炭素線維電極などが使用されている。酵素修飾炭素電極は直径7 μm程であり､侵襲が少なく、正確に測定できれば大変有用である。しかし、炭素繊維に蛋白質､脂肪などが吸着し､一定したデータが得られない。また、妨害物質も多く､目的の物質のみを測定することは困難である。Nafion膜を被覆し、アスコルビン酸のようなカルボン酸を除いたりしても耐久性、不完全性などが問題となる。
  
  
• エイコム社製のマイクロダイアリシスバイオセンサーシステム(EES-800)は、グルタメート酵素法分析自動システム(HTEC-500GAA)と比較すると、精度は高くないが、グルタミン酸の放出をリアルタイムで測定できる。バイオセンサーは透析膜を用いたダイアリシスプローブの中に参照電極（Ag / AgCl）、対極、および作用電極としての白金電極を封じ込み電気化学セルで構成されている。グルタミン酸オキシターゼを充填した透析膜からプローブ中に拡散してきたグルタミン酸は、グルタミン酸オキシターゼによってH2O2を生成する。このH2O2を白金電極で検出することによって、グルタミン酸の濃度を測定できる。
  
  
• microdialysisプローブ、push-pullプローブを装着して試料を連続して回収し､バイオセンサーで測定する方法の内､push-pull法は回収率がよく、低濃度の物質もモニターできる。しかし、灌流液が直接組織に接触するため､数時間の実験によって組織が著しく破壊される。
• Microdialysis法にバイオセンサーを組合せた方法は、神経組織などから放出された物質が拡散してmicrodialysisのプローブに到達するため、応答速度が遅いこと､膜への透過度に依存すること、などの欠点がある。しかし、数時間から数日の長時間における連続のモニタリングに最適である。例えば、脳スライス、細胞培養液中のグルタミン酸放出の連続測定、グルコース測定、乳酸測定、アスコルビン酸測定、NOx測定(12)などが報告されている。この方法も妨害物質の影響を受けるが､妨害物質を除く色々な工夫が行われている。例えば､バイオセンサーの前に妨害物質を除くための酵素処理や､酸化還元処理なども行うことができる。

• 酵素固定化バイオセンサーの開発と生体への応用加藤　武
  
• 日本生理学雑誌　第61巻10号363-376「マイクロダイアリシスによる細胞外物質濃度の測定」（中山大一郎・加藤　武）
• 麻酔科と基礎研究「疼痛と鎮痛」　（並木昭義　表圭一）　南光堂

  ---

• エイコム
  　●グルタメート酵素法分析自動システム　HTEC-500GAA
  　　グルタメートを分離カラムで分離した後、グルタメートオキシターゼ固定化酵素カラムで過酸化水素を定量的に発生させ、白金電極で検出する方法で、グルタメートを特異的に測定します。
  　●マイクロダイアリシスバイオセンサーシステム（酵素電極法）EES-800
  　　酵素にグルタミン酸オキシターゼを使用すれば透析膜からプローブ中に拡散してきたグルタミン酸は酵素によってH2O2を生成します。このH2O2を白金電極で検出することによりグルタミン酸バイオセンサーとなります。
• ビー・エー・エス
  
• Glutamate Biosensors 　<Pinnacle Technology

  ---

• ELISAとは
  
• 質量分析計の部屋　旭川医科大学医学部附属実験実習機器センター
  

Pain Relief