C.elegansのprimary culture

(遺伝研　石原健博士より提供：9/26/02）

Christensen M, Estevez A, Yin X, Fox R, Morrison R, McDonnell M, Gleason C, Miller DM 3rd, Strange K.
A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.
Neuron. 2002 Feb 14;33(4):503-14.

このプロトコールでは、この論文の方法をほぼそのまま行っています。

試薬など

• Chitinase sigma C6137
  • 1u/ml になるようにEgg bufferに溶かし-20℃保存
• Peanut lectin sigma L0881
  • 0.5mg/mlになるように水に溶かし-20℃保存
  • Lectin溶液をスライドグラスチャンバー(Iwaki, Nuncなど。滅菌したカバーグラスや普通のプラスチックシャーレも同様の操作をすれば培養可能。)に入れ20分処理後、液を除いてUV照射下風乾する。Lectin 溶液は、再使用可能。
• Egg buffer (118mM NaCl, 48mM KCl, 2mM MgCl^₂, 2mM CaCl₂ 25mM Hepes pH7.3)
• L15 medium（Invitrogen） + 15mM sucrose+10%FCS+antibiotics
  • FCSのロットはあまり気にしなくて良いようです。
• 36% sucrose
• 0.5M NaOH+1%NaClO
• S-basal

線虫の培養

1. 6cm　rich plate (x4 pepton)　約５枚を100mlのS-basal/OP50(or NA22)で培養（20℃、約３日）。餌がほぼなくなった状態で、親虫を集める。(ステージは特にそろえなくても良い。)
2. 50mlPP tubeにいれて、室温で５分ほど放置。上清を捨てて、一度S-basalで同様にして洗う。

卵の調製

1. S-basalにサスペンドした虫を1.5mlチューブに移す。しばらく放置して、上清を捨てる。
   • 虫の体積が約250μlくらいになるようにする。
2. 0.5M NaOH/1% NaClOを等量加え、時々Vortexしながら4-6分程度処理する。顕微鏡で見て、虫が全てこわれはじめ、親のからだの形が少し残っているくらいで良い。
3. 0.8mlのEgg bufferを加え、3000rpm30sec遠心し、上清を捨てる。Egg buffer 0.5mlを加え、18Gの針を付けた注射器を出し入れして、親の体をこわす。
4. 3000rpm 30sec遠心し、上清を捨てる。もう一度洗う。
5. 遠心したペレットに4倍容の36% sucroseを加えよく混ぜる。そこにEgg bufferを300μl上層する。
6. 3000rpm　3min遠心し、界面に集まった卵を別のtubeに移し、Egg bufferで２回洗う。

Chitinase処理と得られた細胞の培養

1. 得られた卵に1u/ml chitinaseを加え（約5-10vol）、時々混ぜながら室温で約40-60分処理する。
2. 40分後くらいからは200μlチップでピペッティングして、細胞をバラバラにする。
3. 大部分の卵の殻がはずれたら、1mlの培地を加え3000rpm　3min遠心する。
4. 沈殿した細胞に1mlの培地を加え、5μm PVDF filter(Millipore)でろ過して細胞以外のものを除く。filterは3mlの培地で洗い、洗液をろ液と混ぜる。
5. 細胞数をカウントして、2x10⁵/cm₂程度になるようにしてlectin coatしたスライドグラスチャンバーにまき、翌日まで20℃で培養する。大部分の細胞は、ガラス表面に接着し、一部の細胞は突起を伸張しはじめている。
6. 翌日に接着しなかった細胞を除くために、培地を交換する。
   • この状態で、１週間以上生きています。

• Poly lysineコートしたスライドグラスより、lectinコートしたスライドグラスを利用した方が、突起を伸張する細胞の割合が高い。
• 親虫約1mlからスタートして、3-6x10⁶cellsくらい得られる。