テクノビット包埋
 
・サンプル中に蛍光が含まれている場合、全体においてなるべく遮光する。
・あらかじめ充分量の浸漬液を作製しておく。

テクノビット8100主液　100ml 　　　　                混和して4℃保存。作製後4weeks有効
硬化剤�T　　　　　　　　0.6g(一包)

固定：4％ﾊﾟﾗﾎﾙﾑｱﾙﾃﾞﾋﾄﾞにて3〜4hours。もしくはover night。

その後 6.8％シュクロース in PBSで4℃、over night。可能な限り氷上にて振とうさせる。

脱水： サンプルをメッシュの袋に入れ替えて、

 100％アセトン �@　5min →アセトンが白濁する

 100％アセトン �A  60min →液を交換した直後更に白濁するようであれば更に液を新調する。

浸漬：浸漬中に入れて4℃、6〜10hours。 もしくはover night。

重合：包埋するサンプル数を鑑みて包埋液を適当量作製する。

浸漬液　　　　　30ml      の割合で4℃で混和する。

硬化剤�U　　　　 1ml

包埋液中にサンプルを入れ、4℃、5min攪拌する。

包埋液を新たにﾋｽﾄﾌｫｰﾑに700μl程度流し込みサンプルをその中に入れる。

包埋液を溢れない程度にたっぷり足してその上にｶﾊﾞｰﾌｫｲﾙを載せて密封する。

ﾋｽﾄﾌｫｰﾑを4℃の冷蔵庫の中で氷上にてover night。

※サンプルを自立させたい場合(ex;血管など)はｴｯﾍﾟﾝﾄﾞﾙﾌﾁｭｰﾌﾞ 等に包埋する。

ヒストブロックの固定：ｶﾊﾞｰﾌｫｲﾙを剥がしキムワイプ等でよく拭き取り、各々のﾋｽﾄﾌｫｰﾑ上にﾋｽﾄﾌﾞﾛｯｸを置く。

ﾃｸﾉﾋﾞｯﾄ3040を 【液体1：粉末2〜3】の割合で混和し素早くﾋｽﾄﾌﾞﾛｯｸ内に流し込む。

完全に固まったら(1hour〜)ﾋｽﾄﾌｫｰﾑから取り外しサンプル名を記入する。

標本ブロックは−20℃で保存する。

※ｴｯﾍﾟﾝﾄﾞﾙﾌﾁｭｰﾌﾞに包埋した場合は強力はさみやプライヤー等を用いて中身を取り出す。

Plastic embedding to detect GFP signal

Four weeks after surgery, mice were sacrificed with overdose of pentobarbital, and perfused at a constant pressure via the left ventricle with 0.9% sodium chloride solution, followed by perfusion fixation with 4% paraformaldehyde in PBS. The injured arteries were further fixed in 4% paraformaldehyde overnight at 4 oC. The arteries were illuminated with a GFP-lighting system (Illumatool Tunable Lighting System, LT-9800, Lightools Research, Encinitas, CA) and observed using a cooled CCD camera (VB-6010, Keyence, Osaka). To preserve GFP signal for histological analyses, the arteries were embedded in plastic resin (Technovit 8100, Heraeus Kulzer, Wehrheim, Germany) according to the manufacturer’s instructions. Briefly, the arteries were washed overnight in PBS containing 6.8% sucrose at 4 ^oC, dehydrated in 100% acetone, and embedded using a polyethylene capsule (Capsule 414-2, Energy Beam Sciences, Inc, Agawam, MA) as a mold. The polymerized block was fixed onto a block (Histobloc, Heraeus Kulzer) with an adhesive agent (EP001, Semedain, Tokyo) and cut using a rotary microtome (HM335E, MICROM International GmbH, Walldorf, Germany) with a disposable knife (Histoknife, Heraeus Kulzer). Thin sections (3-4 μm) were stretched in a water bath, mounted on silanized slides (Matsunami, Tokyo) and dried for 2 hours at 37 ^oC. The sections were washed in PBS and used for immunofluorescence studies.