マウス筋肉の毛細血管密度の判定(内皮マーカーCD31免疫染色)　　 Vector Red

平成　年　月　日　　 イニシャル　 　　　Red

サンプル

総数　　　

0.切片の脱パラフィン化、re-hydration →　PBS^2- 5分→　PBS²⁺ 5分→　PBS^2- 5分

1.ブロッキングとPAP penで囲い込み。

0.5% rabbit serum　（もしなければgoat serum） RT 10分

PBS 2 ml + goat serum 10 μl

2.一次抗体　(1: 100)　

PBS 200μl x (n+1) = μl

抗マウスCD31(MEC13.3, pharmingen 01951A ビオチン無) 　2μl x (n+1) = μl

ブロッキング液を吸引後、200μlづつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

⇒4 ^oC O/N.（　月　日　時　分　→　月　日　時　分）in moist chamber

3. 洗浄 PBS　5分　２回

4. 二次抗体　(1: 100)

PBS 200μl x (n+1) = μl

ビオチン付抗ラットIg（DAKO） 　 1μl x (n+1) = μl

PBSを吸引後、200μlづつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

⇒RT　1h or 4 ^oC O/N.（　月　日　時　分　→　月　日　時　分）in moist chamber

5. 洗浄 PBS　5分　２回

6. ABC-AP mix　(アルカリフォスファターゼ付ストレプトアビジン)

　PBS 5ml + 試薬Ａ液（キット赤小瓶）１滴　+ 試薬Ｂ液（キット赤小瓶）１滴　→　mix（30分以内に使用する）

→　PBSを吸引後、200μlづつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

⇒RT　30分 or 4 ^oC O/N.（　月　日　時　分　→　月　日　時　分）in moist chamber

7. 洗浄 PBS　5分　２回

8. 発色　(Vector Red ---非水溶性)

100 mM Tris-HCl(pH 8.2) 5mlを混合用ポリ瓶に入れる（コニカルチューブも可）

+ 試薬1　２滴　→　mix

+ 試薬２　２滴　→　mix

+ 試薬３　２滴　→　mix

→　PBSを吸引後、数滴づつ囲いこみの中へ。（乾燥させない）

　　 ⇒RT 90分。

9. ラックにいれて流水（水道水）で5分洗う。

10. Harris　のヘマトキシン一瞬。

11. ラックにいれて流水（水道水）で5分洗う。

12. 脱水⇒マウントクイック