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日本皮膚病理組織学会事務局

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1. Southwestern histochemistryとHisto-endonuclease-linked detection of methylation sites of DNA (HELMET) 法

鶴田大輔(大阪市大皮膚科)


 古くから免疫組織化学および酵素組織化学などにより、目的タンパク質の組織での局在推定が可能となり、皮膚科学における診断法・研究法が格段に進歩し現在に至ることは論を俟ちません。近年mRNAあるいはDNAの組織での局在もin situ hybridization法により可能となり、広く普及しています。しかしながら、皮膚科領域でまだ余り知られていない、Southwestern histochemistryとHisto endonuclease-linked detection of methylated DNA sites (HELMET) 法という分子組織学的手法が2つ開発されましたので紹介いたします。いずれも長崎大学組織発生解剖学小路武彦教授らのグループにより開発されました。

 Southwestern histochemistryは、組織レベルでDNA結合蛋白あるいは転写因子の局在を示す方法です。DNA結合蛋白の結合部位に相補的あるいは非相補的なプローブをthymine-thymine (T-T) dimerあるいはジゴキシゲニン標識して作成し、組織上で反応させて抗T-T dimer抗体あるいは抗ジゴキシゲニン抗体で免疫組織化学的に検出します。1 この方法により、核における転写因子の局在検出が可能になり、遺伝子発現調節のメカニズムを解明できます。

HELMET法はDNAメチル化部位解析法です。DNAの特定箇所のメチル化は細胞分化の方向性を規定し、ゲノムImprintingやゲノム内ウイルス遺伝子の不活性化に生理的に関与し、さらにDNAの異常メチル化が発癌に関与することはこれまでにも良く知られてきました。この方法は、組織レベルでのDNAメチル化を検出する新しい方法です。DNA3’-OH部位をダイデオキシATPとダイデオキシTTPを基質としてTdTで取り込ませて、ブロック後非メチル化配列のみ切断できる制限酵素で切断し、さらに切断により生じた3’-OH部位をTdT反応にてビオチン-16-dUTPで標識します。ダイデオキシヌクレオチドでブロック後に今度はメチル化部位も切断できる制限酵素で切断後ジゴキシゲニン-11-dUTPで標識して、このビオチンとジゴキシゲニンを別々の色調で(例えばFITCとrhodamineで)免疫組織学的に検出します。2

 いずれの方法も皮膚科学的にはまだ知られていない方法ですが、今後の発展が大いに期待できます。このテクノロジーを利用した仕事が増えることが期待しています。

  1. Koji T, et al. Localization of cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate-responsive element (CRE)-binding proteins by southwestern histochemistry. J Histhochem Cytochem 42;1399-1405:1994.
  2. Koji T, et al. In situ detection of methylated DNA by histo endonuclease-linked detection of methylated DNA sites: a new principle of analysis of DNA methylation. Histochem Cell Biol 130;917-925:2008.

(2012年12月)