動物を対象とした痛みの研究、特に覚醒動物を対象とする行動学的テストは、ヒトを対象とする検査と同様に、動物に与える苦痛が最小になるようなテストでなければいけない。　←→3R 足が麻痺しているなど、動物が痛みを回避できない動物で、痛みのテストをしてはいけない。 痛覚鈍磨になっている場合は、逃避反射の潜時などが延長し、組織を損傷する可能性があるので、刺激の最大強度(cut-off値）などを設定する必要がある。 SCAWのカテゴリー：Ｃ＝苦痛を伴うが，それから逃れられる刺激 　以下である必要がある。


→痛み関連行動 pain-related behavioursを指標とした動物の痛みのテスト法

→（行動学的実験のための）薬液注入法

→評価法

┏熱刺激
┣機械刺激
┣化学刺激
┣電気刺激
┗情動刺激
→Grimace scale/痛みのオペラント条件付け実験



熱 刺 激	テイルフリック試験 Tail flick test　　　(7360>Ugo Basile) D'Amour and Smithが1941年に開発した。 覚醒動物、麻酔動物、除脳動物が対象となる侵害性熱刺激による逃避反射を指標とした評価法。通常は動物を拘束する。 侵害性熱刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 ラットやマウスの尾に投射熱刺激（スライドプロジェクターのランプのような装置）を加え、掉尾反射（尾を振り動かす反射）を指標として、逃避反射の潜時 withdrawal latencyを測定する。 掉尾反射は脳から切り離されたラットでも観察されるので、脊髄反射である。 この反射はヒトが痛みを感じる程度まで照射部位の皮膚温が上がると現れる。 延長を指標倒して、鎮痛効果を検証する。（モルヒネをはじめとする多くの鎮痛薬を投与すると、この反射が現れるまでの潜時が延長する。） [注意するポイント] 室温や体温を一定にして解析することが望ましい。 刺激部位の組織損傷を防ぐため、cut-off timeを設ける必要がある。cut-off timeは、正常動物の潜時の２倍程度とする。
	Tail dip test Tail immersion test 覚醒動物、麻酔動物、除脳動物が対象となる侵害性熱刺激による逃避反射を指標とした評価法。通常は動物を拘束する。 熱刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 尾を44oC〜60oCの温水、あるいは4oC〜10oCの冷水につけて、尾が反応するまでの潜時を測定する。 覚醒動物、麻酔動物、除脳動物が対象となる。通常は動物を拘束する。 痛みによる脊髄反射が評価の対象となる。
	ホットプレート試験 Hot plate test　(7280>Ugo Basile/Muromachi) Woolfe and MacDonaldが1944年に開発した。* 熱刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 一定の温度に保たれたプレート上に覚醒動物を置き、疼痛関連行動：　1）足をなめるlicking　2）立ち上がる　3）ジャンプするjumpingまでの潜時を測定しする。測定後、動物を熱板から取り上げる。 hot plate testは、脊髄反射ではなく、上位中枢を介した逃避行動が評価の対象となる。 [注意するポイント] 48oC〜58o程度に設定し、cut off timeは、低い場合でも60秒程度。 ラットでは、52.5oに設定すると、通常10〜20secで陽性反応が出ることが多い。マウスでは、54.5o程度が妥当。 プレートの温度を下げれば潜時が長くなり、温度を上げると潜時は短くなる。 弱い鎮痛薬の効果を観察する場合は低温を選択する。高温を選択すると、潜時は投与量を上げても充分に延長しないため、鎮痛効果を確認するのが難しくなる。 強い鎮痛薬の効果を観察するためには、高温を選択する。低温を選択すると、低用量でも潜時が延長してしまい、投与量依存性が醜くなる。低温ではデータのばらつきが大きくなり安い経口がある。 強い鎮痛薬の効果を判定する場合は 尿や便は速やかに拭き取り、接地面は清潔にする。 室温や体温を一定にして解析することが望ましい。 In the Hotplate test by (Woolfe and MacDonald, 1944)、 mice were placed in a 20 cm high plexiglas cylinder on a 55oC or 55.5oC hot plate and latency for the animal to lick its hindpaw (or jump) was measured. Cut off time for the Hotplate test was set at 30sec. （Woolfe and McDonald, 1944. The evaluation of the analgesic action of pethidine hydrochloride (Demerol). J. Pharmacol. Exp. Ther. 80 (1944), pp. 300–307.）
	Thermal paw-withdrwal test Paw flick test -Plantar test Hargreaves test　　　(7370 >Ugo Basile/Muromachi)　→人での利用PubMed 熱刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 脊髄反射ではなく、上位中枢を介した逃避行動が評価の対象となる。 Hargreaves法により、拘束しない覚醒ラットやマウスの後肢足底に熱刺激を与え、足をなめる(licking)、あるいは足を振り回す(flinching)までを起こすまでのwithdrawal latencyを測定する。 ガラスなどで作られたチャンバーの下から、赤外線などの熱刺激を与える。経時的に、刺激となる温度が上昇する。 Hargreaves法の最大の特徴は、ラットを拘束せずに、侵害性熱刺激に対する逃避反応の潜時を左右の後枝を別々に測定できる点である。 カラゲニンのような起炎物質を一側のラット後枝に投与し、炎症が発症した後枝の熱刺激に対する逃避反応の潜時を測定したり、一側の坐骨神経を損傷し、ニューロパッシクペインモデルラットを作成した際に、損傷側と非損傷側の熱刺激に対する逃避反応の潜時を比較検討したりすることができる。 安定したデータをとるのは容易ではないが、Thermal hyperalgesiaやThermal allodynia [注意するポイント] 刺激部位の組織損傷を防ぐため、cut-off timeを設ける必要がある。 熱刺激を与えるときのタイミングが難しい。動物が熱源の下に来て、足底がしっかり接地面に接しているときに刺激を与える。動物の覚醒レベルが一定である必要がある。 尿や便は速やかに拭き取り、接地面は清潔にする。 室温や体温を一定にして解析することが望ましい。 The Hargreaves assay (Hargreaves et al., 1988) measures nociceptive sensitivity in a freely moving animal by focusing a radiant heat source on the plantar surface of an animal’s hindpaw as it stands in a plexiglass chamber (20 x 20 x 20cm). Latency to withdraw its paw from the heat is recorded. Cut off time for this test was set at 10sec.
	Aceton test cold allodyniaを評価するテスト。 Choi et al.、 1994　[PubMed][Science Direct] かかと、あるいは足蹠にアセトン（0.5 ml ）をスプレーし、一定時間（１分間）に、足を浮かせている時間の合計、あるいは頻度をカウントする。 正常な動物にとっては、侵害刺激にはならないので、侵害行動は見られない。持続時間が長い、あるいは頻繁に足を浮かせた場合、allodyniaと評価する。 [注意するポイント] 数回繰り返してすとする場合は、２分程度の間隔で行う。
機 械 刺 激	von Frey test　(37400 - Dynamic Plantar Aesthesiometer>Ugo Basile Plantar Test/SWテスト Semmes - Weinstein Monofilaments 動物では機械刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 網の下からラットやマウスの足底に対して垂直にvon Frey Hairが曲がるまで押しつけ、動物が足をあげる機械刺激の閾値を測定する。 覚醒動物が対象となる。 オリジナルは馬尾毛であったが、最近は太さの異なるプラスチックやナイロンなどのフィラメントをあてて、閾値を測定する。 動物を対象とした実験では、逃避反射の閾値を指標とするtactile allodyniaなどを調べる検査である。 本来ヒトを対象としては、Aβ低閾値機械受容器の機能を調べ、感覚鈍麻なども調べる。 　 up - down 刺激法　up-and-down method　Chaplan SR. J Neurosci Methods. 1994;53:55-56.＠Yaksh W. J. Dixonが感度試験のための、少数例でも推計学的処理が可能なUpandDown法を提案した。サンプルサイズN≦6のすべてのLD 50の最尤推定値のシーケンスは、より大きなサンプルサイズの近似推定値を示す。（Dixon W. The up-and-down method for small samples. J Am Stat Assoc. 1965;60:967–978） 閾値は、それを超えると被験者の50%が反応し、それを下回ると被験者の50%が反応しない点として定義されます。アップダウン試験では、いくつかの刺激レベルごとに事前に設定されたテスト数を使用する従来のデザインに比べて、わずか5分の1の被験者数で所定の標準誤差の中央値（ED50）の推定値を得ることができる。 DixonとMoodによって提案されたup-and down methodは、確率変数Vが平均μ、標準偏差σの正規分布N(μ,σ2)に従う場合、観測される確率変数が直接にはVではなく、間接的に成功・失敗の2値の確率変数Yであるときに、μとσとを効率的に推定する方法として、工学分野だけでなく、医学薬学分野でも広く用いられている。 ChaplanらはDixonのup-and down methodを使って、50%逃避反射の閾値を決める方法を提案した。 8種類の von Frey hair（0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.50 and 15.1 g） 中程度（2.00g）のフィラメントから刺激を始める。 そのフィラメントによる刺激で逃避反応が認められたら、一つ下の太さのフィラメントを用いて同様に刺激し、反応が認められない時は一つ上の太さのフィラメントの刺激を行う。 最初に閾値の越えた時：刺激に対して陽性から陰性、あるいは陰性から陽性へと変化した前後の2反応を最初の反応とし、その後4回（6回）連続して同様にup - down刺激を行い、そこから得られた結果から50%閾値を求める。 percentage maximal possible effect (%MPE)＝ ((postdrug threshold−baseline threshold)/(cutoff threshold (15 g)−baseline threshold)) × 100. 倉石研　Takasaki I, et al. Pain. 2000;86:95-101. Frey hairs：0.03, 0.17, 0.41, 0.69, 1.20 and 1.48 g 少なくとも15分間順応させた後、Frey hairを足底皮膚に垂直に押し付け、わずかに座屈させた状態で3～5秒間保持させる。 0.03gのフィラメントから開始し、同じ強度の刺激を数秒間隔で、6回加える。 刺激に対する反応のランク付け 　0：無反応 　1：足を上げる（触圧部位から逃れる） 　2：足を舐める、噛む、激しく振る ←→精密触覚機能検査@日本口腔顔面痛学会 Semmes Weinstein Monofilaments; 　 Normal 1.65, 2.36, 2.44, 2.83 (68 mg), 3.22 (166 mg), 3.61 (407 mg) Dimished light touch 3.84 (692 mg), 4.08 (1202 mg), 4.17 (1479 mg) , 4.31 (2,041 mg) Dimished PS 4.56 (3,630 mg), 4.74 (5,495 mg), 4.93 (8,511 mg), 5.07 (11,749 mg), 5.18 (15,136 mg), 5.46 (28,840 mg), 5.88, 6.10, 6.45 Deep pressure sensation 6.65 太さは同じで長さを変えたフィラメントを自作している研究者も少なくない。 [注意するポイント] 安定した結果を得るためには熟練が必要。フィラメントが曲がるまで押しつけるなど、刺激の与え型を均一にする必要がある。 Maximilian Ruppert Franz von Frey （P 1852/11/16〜1932/1/25, ビュルツブルグ, Carl Ludwig's physiological Institute in Leipzig）が1895年にvon Frey Hairを使って、皮膚の感覚点の温点、冷点、圧点、痛点を研究した。 Florence Semmes とSidney Weinstein（P 1922〜2010, 米国の神経心理学者）が1958年に、馬の毛でできたvon Frey hair の代わりにナイロン製のモノフィラメントを開発し、脳損傷患者の感覚の定量化と分類を行った。
	自動デジタル式von Frey test 原理はvon Frey testに類似しているが、ミクロピペット状の機器の先に、細いチップを装着し、後肢足底に対して垂直に押しつけ、後肢の逃避行動を示したとき、自動的に押し当てた強さが計測される機器を用いる。 マウス用のチップ；直径0.8-0.9mm 圧刺激の強さは0.1〜50g迄、加圧スピードは１〜20秒迄任意に設定
	Randall Selitto test --- paw pressure test　(37215 - Analgesy-Meter>Ugo Basile Plantar Test/Muromashi) （Randall et al., 1957 L.O. Randall and J.J. Selitto, A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue, Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 111 (1957), pp. 409–419.） 加圧式鎮痛効果測定装置で機械刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 Randall Selitto法により、ラットの後肢に一定の速度で連続的に増加する圧を与え、逃避閾値を測定する。 覚醒動物が対象となる。 水村研での筋痛モデルでは、円錐形の圧子の先端を太くして、筋に対する機械刺激の閾値を評価できるようにしている。 [注意するポイント] 安定した結果を得るためには、動物をテストにならすことが必要である。 　水村研では、幼若期から良くハンドリングし、ラットの体幹部をタオルで巻き、テープやマジックテープで留めて、安全にテストをされている。これはラットを拘束して不快感を与えているのではなく、安心感（？）を与えているようだ。
	はけや電動歯ブラシを使った疼痛テスト 機械刺激を加え、急性痛を評価するテスト。慢性疼痛モデル動物では、アロディニアの評価にもなる。 触刺激を与え、逃避反射時間を評価する。 触刺激は順応が起こるので、tactile allodyniaのためのテストとしては、圧刺激より電動歯ブラシのような触刺激が適当である。 覚醒動物が対象となる。
化 学 刺 激	ホルマリンテスト　formalin test　参考1 1977年David Dubuisson & Stephen G. Dennis [PubMed] 急性持続性疼痛のモデルとして確立されている。慢性疼痛モデル動物では、慢性疼痛の評価にもなる。 1.5-5%のホルマリン溶液0.05-0.1mlをラットやマウスの前肢あるいは後肢足背/足蹠にホルマリンを皮下注入し、自発痛によって生じる行動を解析する。 ハロタンなどによる深麻酔下、あるいは動物をを梗塞して皮下注射する。 licking)、flinching、lifting、biting、guarding、shakingなどの行動回数や持続時間を評価する。 注射された動物は、直ちにその足を繰り返しなめる---Pain score 3 　↓ 数分すると、足を床に着けないよう空中に保持する--Pain score 2 　↓ やがてその足を使って用心深く歩く--Pain score 1 　↓ そして注射後約90分たつと正常に歩行するようになる--Pain score 0 　↓ 最初の反応が中等度の痛みを反応し、以後痛みが弱まると解釈される。 （ヒトにホルマリン溶液を注射すると、直ちに強い、鋭い、ハチに刺されたような、あるいは焼けつくような痛みが現れる。約5分たつと定常な拍動痛に変わり、30-60分で消失する。最初の痛みを相性疼痛phasic pain、5分後の痛みを持続性疼痛tonic painと呼ぶ。） 　ラットでは２相性の反応がみられる。 第1相 0-5分 ホルマリン自身による直接の化学刺激による反応？ 第1相と第2相の間に、疼痛関連行動が全く認められない時期がある。内因性の疼痛抑制系が活性化されている時期 第2相 5-40分 プロスタグランジンなどの炎症性メディエーターが関与した局所の炎症反応による侵害受容性興奮と脊髄後角に誘発される過敏化の相乗効果 　 第1相 第2相 NSAIDs 抑制効果弱い 強い鎮痛 モルヒネ 強い鎮痛 強い鎮痛 MK801 抑制効果弱い 強い鎮痛
	bee venom test/melittin test ハチ毒やハチ毒に含まれるメリチンをラットやマウスの後肢足蹠に皮下注入し、自発痛によって生じる行動や痛覚過敏/アロディニアを解析する。
	カラゲニンテスト　→刺激/モデル カラゲニンは、アイルランド産の紅藻類から得られた多糖類の植物性ゴムで、起炎物質。 　難水溶性で、生食に溶解させるためには、超音波洗浄機などを使用する。 カラゲニン物質を後肢足底に皮下注入し、炎症に伴うアロディニアや痛覚過敏を評価する。 カラゲニンは、末梢神経には作用しない。注入後約30分〜1時間経過して、炎症反応による浮腫と痛覚過敏が生じる。その後、数日間炎症反応が持続する。
	Algogenic-induced nociceptive flexion (ANF) test: Algogenic-induced paw-flexor response (APF) test [PubMed] 植田弘師先生による考案：後肢足蹠への発痛物質投与に対する侵害性応答を侵害性屈曲反射を指標として評価する方法 からだを浮かせて水平に保持した状態で、屈曲反応をトランスデューサーと、それに連結したレコーダーを介して解析する。 四肢を出すための穴の開いた柔らかい布製の筒に入れ、布を金属製の棒につるし、右後肢以外は足蹠背側に取り付けたごく細い糸で、実験台に結んで固定する。 右後肢に取り付けたいとは、床に取り付けた輪に通した後、アイソニックトランスデューサーに接続する。 Algogenic-induced biting and licking (ABL) testの100倍の感度で、発痛物質の効果を検知できる。
	酢酸ライジングテスト acetic acid writhing test 覚醒動物において痛みや鎮痛の程度を評価する行動テストであるが、動物が痛みから逃れられないテストのため、動物倫理の観点から行うべきではないテスト法であると考えられる。 マウスに酢酸を投与すると、痛みにより特有の「身もだえるような症状（ライジング）」が現れる。 マウスの腹腔に0.5〜0.6%の酢酸を注射する。 鎮痛薬の投与前と投与後で、ライジングの回数を比較し、痛みに対する抑制効果を試験する。
浮腫の測定　　(7140 - Plethysmometer>Ugo Basile Plantar Test）
電 気 刺 激	フリンチジャンプ試検　flinch/jump test←→Foot shock induced analgesia Evans, W. D.が1961年に開発した。(Evans, W. O. A new technique for the investigation of some analgesic drugs as a reflexive behavior in the rat. Psychopharmacologia, 2: 318-324, 1961. ) フットショックに対する痛みの感受性を測定する。 ラットを床が電気格子になっている箱に入れ、この格子に10秒間隔で0.3秒間電気を流す。初めのショックの強度はふつう0.1μAである。その後、30回ジャンプするまで0.05μAずつ増加し続ける研究者もいれば（MayerとLiebeskind；1974）、ショックの回数を例えば10回に制限し、各連続試行における増加幅をより大きくする研究者もいる（Evans；1961）。10回の完全試行の間ずっとジャンプがみられると，再び0.1μAから始める研究者もいる（Bodmerら；1978）。
情 動	場所嗜好性試験 conditioned place preference (CPP)法によるモルヒネの報酬効果（精神依存）の評価 薬物の効果と場所（ボックスの２つのコンパートメント）とを動物に条件付けした後に、動物に自由に場所を選択させて、薬物の効果を評価する。 　コンパートメント1：白ー凹凸　　コンパートメント2：黒ー平面 　→薬物処置側のコンパートメントを動物が選択---報酬効果 　→溶媒処置側のコンパートメントを動物が選択---嫌悪効果 第１日目　溶媒（or 薬物）を処置して、コンパートメント1に１時間動物を閉じこめる。 第２日目　薬物（or 溶媒）を投与して、コンパートメント2に閉じこめる。 　　↓この操作をラットは４日間、マウスは６日間繰り返す。 第５日目　ボックスの中央のしきりを取り外した後に、各コンパートメントでの15分間の滞在時間を測定する。 恐怖条件付け文脈学習 contextual fear conditioning test　←→恐怖条件付けテスト/PTSD/記憶 恐怖の古典的条件付けは、音や光など、それ自体では恐怖の指標となる反応を喚起しない条件刺激：CSと、電気ショックなどの恐怖反応を喚起する非条件刺激：USを対象とするパブロフ型の条件付けである。 動物に音を聞かせると同時に電気ショックを与えて聴覚による条件付けを行なうと、条件刺激（音）を提示しただけで血圧上昇やフリージング反応（すくみ反応）が起こるようになる。扁桃体が破壊されると、この恐怖聴覚条件づけ学習は障害される。 この恐怖条件づけによって成立する情動反応の発現は、動物一般にみられるもので、その成立の機制はヒトと動物で基本的に違いはなく、自律神経反応（心拍数の増加、過呼吸、血圧上昇、発汗、立毛、緊張感、不安感など）、および副腎皮質ホルモンの上昇などを伴う「恐怖症状」や「パニック発作」が観察される。 □条件付けセッション Conditioning session 　電気ショック用のグリッドがある、明るく、四角いボックス（条件刺激、文脈）に動物を入れて一定時間経過後に、聴覚刺激（条件刺激、手がかり刺激 cue）の終了時にフットショック（非条件刺激、嫌悪刺激）を与える。これを2〜3回繰り返し、情動反応はフリージング時間で評価する。 □文脈テスト contextual test 　翌日、条件付けテストと同じ、明るく、四角いボックスに動物を入れるが、聴覚刺激もフットショックも与えない。嫌悪刺激と文脈刺激による連合学習が成立していれば、動物は嫌悪刺激がなくても情動反応を引き起こす。 □手がかりテスト cued test 　文脈テストの１時間後に、暗い、三角形のボックスに動物を入れて一定時間経過した後に、聴覚刺激を与える。手がかり刺激と嫌悪刺激による連合学習が成立していれば、嫌悪刺激が与えられたボックスでなくても、情動反応を引き起こす。 □消去学習 extinction　←→薬剤/記憶の消去 恐怖条件付けで形成された中立的な刺激と恐怖の連合は、その後、中立的な刺激のみを提示（恐怖なしで）し続けることで「消失」する 一度形成された恐怖記憶は、「消去学習」によって抑制することができる。条件付けしたケージで音刺激は与えるが、フットショックを与えない。これを繰り返すと、フリージングしなくなる。 恐怖記憶が消失する再固定化の阻害とは異なるメカニズムである。「消去学習による記憶の（見かけ上の）減弱・消失」と「再固定化阻害による記憶の（完全な）減弱・消失」は、よく類似した現象であるが、分子・細胞機構は大きく異なると想定されている。　参考1 痛みのオペラント条件付け実験　←→オペラント課題/オペラント条件づけ　参考1/2 マウスに報酬であるミルクと、罰である侵害刺激を加えられる装置 マウスが報酬であるミルクを飲むためにウィンドウを鼻でタッチすると、弱い侵害刺激も加えられる。 弱い侵害刺激によって、痛みを感じない時には、報酬が得られるタッチ行動の頻度が高ます。 タッチ行動によって痛みを感じれば、タッチ行動の頻度が減る。 神経障害性疼痛モデルでは、コントロール群よりも、侵害刺激によってタッチ行動の頻度が減る。 Grimace scaleしかめっ面スコア Grimace scale　←→表情/フェイス・スケール　参考1/Jeffrey Mogil/2/3/4/4/ げっ歯類の表情を用いた痛みの評価　参考1/ no pain (0)、moderate (1)、severe (2)の３段階のスコア化 Orbital Tightening 眼窩の締め付け Nose Bulge 鼻の膨らみ Cheek Bulge 頬の膨らみ Ear position 耳の位置 Whisker Change ひげの変化



　→恐怖条件付けが関連する神経回路

引っ掻き行動の回数などで評価 前肢で患部を引っ掻く ケージでで患部を引っ掻く 後肢で患部を引っ掻く

• 吸入麻酔薬で麻酔した後、頭頚部を前屈した状態でラットを脳固定器を用いて固定する。
• 環椎後頭骨間に皮膚切開を加え、硬膜を切開し、ポリエチレンカテーテル(PE-10)を尾側に向かって挿入する。
• 先端を腰髄膨大部に位置させ、くも膜下にカテーテルを固定し、創部を閉じる。

1. ガイドカニューレの作製
   • 側脳室の場合は 21G、第三脳室の場合は 23Gのステンレスチューブを、先端を少し斜めに削って一定の長さにそろえる。
   • 長さは、ラットの障害にならないためにも、あるいは回復中に外れるなどのトラブルを避けるためにも、できるだけ短いにこしたことはないが、刺入用のマニプレータに取り付ける余裕が必要なので、通常側脳室の場合は12mm、第三脳室の場合は16mm程度にする。
   • 留置した時に、頭蓋骨の直上にあたると思われる部分に、小さなハンダの球を付けておく （チューブがステンレスなのでフラックスが必要）。これがないと、デンタルセメントで固めてもカニューレが容易に脳の中に入ってしまうことがしばしばある。
   
   
2. 植え込み：
   • 先端がガイドカニューレからほんの少し出る長さのスタイレットを用意する。ステンレスチューブで作るときは、21G に対しては 26G、23G に対しては30Gがよい。脳定位固定装置のマニプレータに電極固定ネジで固定するが、われわれはガイドカニューレを短くするためと、後述するように脳室へ入ったことを確認するためのスタイレットの上下を容易にするるため、留め金を四角に切り込む。
   • ラットを脳定位固定装置につけ、頭蓋骨を露出する。骨表面を綿花などでしっかりとこすり、結合組織などを残さないようにする。以下に述べる coordinates に従い、刺入位置の骨表面に印をつけ、骨に歯科用ドリルで穴を開ける。第三脳室の場合は、正中（L ： 0mm）なので骨片を取り除く際には、上矢状静脈洞（superior sagittalsinus）に注意する。硬膜はとっておく必要はない。
   • ガイドカニューレ先端の coordinates（Paxinos & Watson）は、

     	A	L	H
     側脳室	ブレグマより 0.8mm 後ろ	1.6mm	脳表面より 4.3〜 4.5mm
     第三脳室	ブレグマより1.8mm 後ろ	0mm	脳表面より 7.8 〜8.0mm

     
     
   • 植え込みで最も重要なことは、脳室内に確実に入ったことを確認することである。そのために、はじめに 0.3 〜 0.5mm 深いところまで入れ、少しずつ上に上げながらスタイレットを数 mm 上下させる。
   • 脳室に入っているとスタイレットを完全に抜いたときに髄液がガイドニューレからあふれ出てくる。この時の H は、ほとんど上記の値になっている。側脳室の場合は、出ないときに対側を試みることもできる。
   • しかし、第三脳室の場合は、上矢状静脈洞を貫いているので（L ： 0mm）、一旦、刺入した後抜いてしまうと出血がひどい。小さな鈎を作り、静脈洞をどちらかに引っ張って刺入すると出血しないが、正中を貫いてもその直後から血液を綿花などで吸い取っていると案外早く止血するし、その後の脳浮腫もほとんどない。
   • アンカーは、4 〜 5mm の長さでねじ山が荒い方がよく、先端にタップを切っているものを用いている。ドリルで骨を少し削った後、たたいても全く動かないほど、しっかりと骨にくい込ませる。デンタルセメントをはけでのせていく前に、骨表面をしっかり乾燥させておくことが重要である。スタイレットを挿入し、その末端をセメントで固定しておく。
   
   
3. 注入：
   • 術後少なくとも1週間は回復期にあてる。
   • 注入カニューレは、スタイレットと同じ大きさの26 または 30G のステンレスチューブで作製する。ガイドカニューレと同じチューブを短く切ったストッパーをハンダで固定する。ストッパーから先端までの距離は、ガイドカニューレより 0.5mm 長くする。
   • ガイドカニューレの長さを一定にしているので、同じカニューレを複数のラットで使用できる。
   • 無麻酔のラットを取り扱うときに共通するが、イスに座ってひざの上にタオルを載せ、軽く包み込むようにする。
   • 同様のハンドリングを回復期に十分しておくとラットはおとなしい。スタイレットをニッパーで切って引き抜き、薬物が先端から出てくるのを確認した注入カニューレをガイドカニューレに差し込み、ひざの上またはホームケージの戻して薬物を注入する。
   • ラットの髄液の量は約 300μl といわれているが、注入量は多くても 10μl ぐらいまでで、通常30 秒〜 1 分間に 1μl の割合でゆっくり注入する。最後の注入後に、Pontamine Skyblueなどの色素を注入しておくと、後で注入がうまくいったか確認できる。
   • 脳室注入の変法であるが、ガイドカニューレを使わずに29Gのステンレスチューブを直接第三脳室に刺入し固定した。
   • その時は、同時に視床下部に慢性記録電極を留置するため、前方から斜めにカニューレを刺入する必要があった。この場合、カニューレの先端の位置を予め 0 座標から計算して決めておく必要がある。しかし、ハンダやスタイレット（径 100μm のステンレスワイヤー）を使用するなど、基本的には、同じ操作を行う。
   
   
4. 大槽への注入および髄液の採取：　←→DICT
   • 大槽（Cisterna Magna）へは、脳定位固定装置を使わずに到達できる。すなわち、先のとがったカニューレを後頭骨にそって下ろしていくと、大槽に到達し髄液が出てくる。大槽は、第四脳室とつながってはいるが、空間として大きいので、薬物の注入より髄液の採取のためにカニューレを入れることも多い。

1. スタイレットはガイドカニューレと同じ長さにするが、ガイドカニューレの先端は、目的とする部位の 1mm 上に留置する。従って、注入カニューレはガイドカニューレの先端より 1mm 突出するようにする。ガイドカニューレによる脳組織の破壊を防ぐためである。
2. 注入量は、よほど広い範囲を目的にしないかぎり、0.1μl ぐらいまでにする。薬物が脂溶性か水溶性かによるが、0.1μl でおよそ直径 1mm は広がると考えられる。0.1μl を少なくとも 1 分間はかけてゆっくりと注入し、注入後も数分そのままにしておく。
3. 薬物の注入を何回も繰り返すのはよくない。血圧や自律神経活動を指標に視床下部内にグルタミン酸を注入した場合、2 回目までは同じ反応が出るが、3 回目は出ない場合も多い。組織のダメージが大きいと考えられる。最後は、色素を薬物と同量注入して後で注入部位を確認する。

┏痛み関連行動のスコア化
┣痛み関連行動の閾値の変化
┗痛み関連行動の潜時の変化

逃避反応時間

閾値

痛みのスコア 逃避行動をスコア化して解析する。

percent maximum possible effect (%MPE) %MPE =（処置後測定値 − 処置前測定値）÷（cutt-off値 − 処置前測定値） ×100％

area under the curve (AUC) X軸：経過時間　　Y軸：鎮痛効果の程度(=%MPE) 　時間反応曲線と基線で囲まれる面積を計測する。

differnce score differnce score =（患側スコア）−（健側スコア）

アイソボログラムisobologram ２つのの相乗効果の有無を解析する。

Pain Relief