歯および軟骨形成におけるPannexin 3の役割

岩本　勉1、福本　敏2
1東北大学病院　小児歯科、2東北大学大学院歯学研究科　小児発達歯科学分野

　ギャップ結合蛋白は、細胞膜上にチャネル様構造を構築し、シグナル分子やイオン等を通過させることによって、隣接する細胞間で直接的に情報伝達を行っており、発生中の細胞や成熟細胞で広くその発現がみられる。このギャップ結合蛋白の異常、すなわち、細胞間コミュニケーションの異常が， 細胞傷害，発生の障害、循環障害，腫瘍等の病態発生において極めて重要な現象を引き起こすことが明らかにされてきている。
　我々は歯の発生に関わる分子群を同定する為に、バイオインフォマティカル解析手法を用いた網羅的な解析を試みた1), 2)。そこで、新奇ギャップ結合蛋白Pannexin familyのひとつであるPannexin 3（Panx3）が、歯の発生過程で強く発現することを見いだした。さらに、解析を進めていく上で明らかとなった特筆すべき点として、このPanx3が歯にとどまらず軟骨、骨にその発現をみることができるが、その他の組織では発現が観察されないことである。すなわち、硬組織特異的分子であるということである。これまでに硬組織特異的ギャップ結合蛋白の報告はなく、本分子が硬組織形成過程において非常に重要な役割を担っていることが示唆された。本学術集会では、歯および軟骨の発生過程におけるPanx3の役割について議論していきたい。

参考文献
1. Iwamoto T, Nakamura T, Doyle A, Ishikawa M, de Vega S, Fukumoto S, Yamada Y.: Pannexin 3 regulates intracellular ATP/cAMP levels and promotes chondrocyte differentiation. J Biol Chem. 285(24):18948-58. 2010

2. de Vega S, Iwamoto T, Nakamura T, Hozumi K, McKnight DA, Fisher LW, Fukumoto S, Yamada Y. TM14 is a new member of the fibulin family (fibulin-7) that interacts with extracellular matrix molecules and is active for cell binding. J Biol Chem. 19;282(42):30878-88. 2007

I型糖尿病モデルマウスにおけるカテプシンLの特異的阻害を介した治療戦略

山田　安希子
徳島大学大学院　ヘルスバイオサイエンス研究部　口腔分子病態学分野

　I型糖尿病（Insulin-dependent diabetes mellitus）は、膵ラ氏島を標的とする自己免疫疾患であるが、その発症メカニズムは不明であり、根本的な治療法は確立されていない。これまでに我々は、シェーグレン症候群の病態抑制に、カテプシンS阻害剤の投与が有効であることを明らかにした（J. Clin. Invest. 110:361, 2002）。そこで、本研究ではI型糖尿病におけるカテプシン阻害剤の効果を検討するために、I型糖尿病のモデルマウスであるNODマウスを用い、各カテプシン阻害剤（カテプシンL、S、B）を投与し、糖尿病発症への影響について治療学的解析を行った。
　まず、サイクロフォスファマイド(CY)投与を行い、I型糖尿病の発症を誘導したNODマウス（約10週齢）に、各カテプシン阻害剤を投与した結果、カテプシンL阻害剤投与により著明な病態抑制が認められた。また、末梢CD8陽性T細胞の活性化に伴いカテプシンL活性の増強が認められ、細胞障害活性測定の結果、カテプシンL阻害剤はCD8陽性T細胞の細胞障害活性を抑制することが示された。さらに、CY投与NODマウスに対し、small interfering RNAを用いてカテプシンLをノックダウンしたところ、病態抑制が認められた。これらの結果から、カテプシンLを特異的に阻害することがI型糖尿病の有効な治療法となり得る可能性が示された。

参考文献
1. Ishimaru N, Arakaki R, Yoshida S, Yamada A, Noji S, Hayashi Y.: Expression of the retinoblastoma protein RbAp48 in exocrine glands leads to Sjogren's syndrome-like autoimmune exocrinopathy. J Exp Med. 205:2915-27. 2008.

2. Ishimaru N, Yamada A, Kohashi M, Arakaki R, Takahashi T, Izumi K, Hayashi Y.: Development of inflammatory bowel disease in Long-Evans Cinnamon rats based on CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell dysfunction. J Immunol. 180:6997-7008.2008.

3. Yamada A, Yamamoto T, Yamazaki N, Yamashita K, Kataoka M, Nagata T, Terada H, Shinohara Y.: Differential permeabilization effects of Ca2+ and valinomycin on the inner and outer mitochondrial membranes as revealed by proteomics analysis of proteins released from mitochondria. Mol Cell Proteomics. 8:1265-77. 2009.

4. Yamada A, Yamamoto T, Yoshimura Y, Gouda S, Kawashima S, Yamazaki N, Yamashita K, Kataoka M, Nagata T, Terada H, Pfeiffer DR, Shinohara Y.: Ca2+ induced permeability transition can be observed even in yeast mitochondria under optimized experimental conditions. Biochim Biophys Acta. 1787:1486-91. 2009.

5. Yamada A, Ishimaru N, Arakaki R, Katunuma N, Hayashi Y: Cathepsin L inhibition prevents murine autoimmune diabetes via suppression of CD8+ T cell activity. Plos One. 5:e12894, 2010.

歯肉を用いた iPS 細胞の樹立および骨生物学への応用

江草　宏
大阪大学大学院歯学研究科　顎口腔機能再建学講座　歯科補綴学第一教室

　近年，皮膚などの体細胞に数個の遺伝子を導入することで，人工多能性幹細胞（iPS 細胞）を作製する技術が報告された。この技術によって，胚性幹細胞（ES 細胞）のように胚を破壊することなく，個々の患者の細胞から万能細胞が作製可能となるため，その医療への応用が期待されている。iPS 細胞の臨床応用には，採取の容易な組織細胞から iPS 細胞を効率よく作製する技術が重要となる。歯肉は歯科治療の過程で切除される機会の多い組織であり，切除歯肉片は一般的に廃棄されている。我々は，成体マウス，および患者の歯肉由来線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて山中4因子（Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc）あるいは癌遺伝子 c-Myc を除いた3因子を導入することで，薬剤選択法を用いることなく容易に iPS 細胞が樹立可能であることを見出した（Egusa et al., PLoS One, 2010）。採取およびその初期化誘導が容易な歯肉線維芽細胞から作製された iPS 細胞は，将来的にはさまざまな組織の再生医療への応用が期待されるだけでなく，iPS 細胞バンクの整備，病態解明，新薬探索，毒性評価などの技術開発に有用なツールとなる可能性がある。本発表では，歯肉由来 iPS 細胞の樹立およびその骨生物学への応用の可能性について言及しつつ，今後の課題と将来の展望について考察したい。

参考文献
1. Egusa H, Okita K, Kayashima H, Yu G, Fukuyasu S, Saeki M, Matsumoto T, Yamanaka S, Yatani H: Gingival fibroblasts as a promising source of induced pluripotent stem cells. PLoS One, 5: e12743, 2010.

2. Egusa H, Kaneda Y, Akashi Y, Hamada Y, Matsumoto T, Saeki M, Thakor DK, Tabata Y, Matsuura N, Yatani H: Enhanced bone regeneration via multimodal actions of synthetic peptide SVVYGLR on osteoprogenitors and osteoclasts. Biomaterials, 30: 4676-4686, 2009.

3. Egusa H, Iida K, Kobayashi M, Lin TY, Zhu M, Zuk PA, Wang CJ, Thakor DK, Hedrick MH, Nishimura I: Downregulation of extracellular matrix-related gene clusters during osteogenic differentiation of human bone marrow- and adipose tissue-derived stromal cells. Tissue Eng., 13: 2589-2600, 2007.

4. Egusa H, Schweizer FE, Wang CC, Matsuka Y, Nishimura I: Neuronal differentiation of bone marrow-derived stromal stem cells involves suppression of discordant phenotypes through gene silencing. J. Biol. Chem., 280:23691-23697, 2005.

頭蓋冠縫合部の発生におけるHedgehogシグナルの役割

小林　起穂1、森山　啓司1, 2
1  東京医科歯科大学　硬組織疾患ゲノムセンター　未来医療展開部門
2  東京医科歯科大学大学院　医歯学総合研究科　顎顔面矯正学分野

　頭蓋冠縫合部早期癒合症（Craniosynostosis）は、単一あるいは複数の縫合部が胎生期あるいは出生後早期に閉鎖する先天性の骨系統疾患であり、頭蓋顎顔面骨格に重篤な成長阻害が惹起されるが、詳細な病態成立機序の解明や、効果的な治療法の開発には至っていないのが現状である。
　Gli3（Gli-Kruppel family member 3）は、主にHedgehogシグナルに対し抑制的に働く転写因子である。ヒトにおけるGli3変異は、頭蓋の変形や多指症を主症状とするGreig Cephalopolysyndactyly Syndrome（GCPS)の原因となることが知られている。今回我々はGli3遺伝子欠損マウス（Gli3Xt?J/Xt?J）がラムダ状縫合に早期石灰化を呈することに着目し、その縫合部における骨芽細胞分化について検討した。Gli3Xt?J/Xt?J頭蓋冠縫合部ではPatched1, Runx2-II, 及びDlx5の明らかな発現上昇が観察され、縫合部における骨芽細胞分化の亢進が確認された。FGF2除放ビーズをGli3Xt?J/Xt?Jラムダ状縫合に適応したところ、Twist1の発現誘導により、同部位における早期癒合を阻止した。また作出したGli3Xt?J/Xt?J Runx2+/-マウスでは、ラムダ状縫合の開存が全例で認められた。以上の結果は、Craniosynostosisに対する非外科的治療法開発へのヒントとなることが期待される。

参考文献
1. Rice, D. P., Connor, E. C., Veltmaat, J. M., Lana-Elola, E., Veistinen, L., Tanimoto, Y., Bellusci, S., and Rice, R. (2010) Hum Mol Genet 19, 3457-3467

2. Miraoui, H., Oudina, K., Petite, H., Tanimoto, Y., Moriyama, K., and Marie, P. J. (2009) J Biol Chem 284, 4897-4904

3. Kinouchi, N., Ohsawa, Y., Ishimaru, N., Ohuchi, H., Sunada, Y., Hayashi, Y., Tanimoto, Y., Moriyama, K., and Noji, S. (2008) Gene Ther 15, 1126-1130

4. Tanimoto, Y., Yokozeki, M., Hiura, K., Matsumoto, K., Nakanishi, H., Matsumoto, T., Marie, P. J., and Moriyama, K. (2004) J Biol Chem 279, 45926-45934.

がん微小環境内における腫瘍?血管の相互作用

樋田京子
北海道大学大学院歯学研究科口腔病態学講座・血管生物学教室

　腫瘍血管新生は腫瘍の進展と転移に重要な役割を果たし，抗VEGF剤などを用いた血管新生阻害療法は抗癌剤との併用で切除不能な大腸癌をはじめとした癌患者に延命効果をもたらしたが，その一方で抵抗性や副作用の報告もある．
　ごく最近まで「癌の間質に存在する血管内皮細胞は正常で遺伝学的に安定である」と信じられ，多くの薬剤が正常血管内皮細胞を用いて開発されてきた．　一方，近年腫瘍血管は正常血管と比較して，少ない周皮細胞や，基底膜の異常など，形態学的に異なることが知られてきた．しかし，腫瘍血管を構成する内皮細胞の性質は未だ不明な点が多い．
　われわれはこれまでTECを分離培養し，それらがEGF receptorなど，様々な遺伝子発現が正常血管内皮細胞:Normal endothelial cell (NEC)と異なることなどを報告してきた．また，NECに比較してgrowth factorや特定の薬剤に対する感受性が高いことや抗がん剤への抵抗性があることなども報告してきた.   驚くべきことにマウスTECには染色体異常が認められ，ヒトTECにおいても染色体異常を確認している．これらの異常は腫瘍培養上清によってNECにも誘発される．また，転移能の異なるがんではTECの性質も異なることも見出している．
　TECのバイオロジーを解き明かすことはがんの病期によって，または症例毎に異なる腫瘍血管のダイナミクスを詳細に把握することにもつながり，血管新生阻害療法の個別化治療の実現のために大変重要と思われる．
　今回，がん微小環境内に存在するTECの異常性について，さらに異常性獲得のメカニズムについて腫瘍-血管の相互作用の観点からわれわれが得た知見と考察などを発表する予定である．

参考文献　＊corresponding author
1. Hida K., Hida Y., Amin D., Flint A., Panigrahy D., Morton C. and Klagsbrun M.: Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res, 64(22), 8249-8255, 2004 

2. Akino T., Hida K*., Hida Y., Tsuchiya K., Freedman D., Muraki C., Ohga N., Matsuda K.,　Harabayashi T., Shinohara N., Nonomura K., Klagsbrun M. and Shindoh M.: Cytogenetic　Abnormalities of Tumor-Associated Endothelial Cells in Human Malignant Tumor. Am J Pathol, 175(6), 2657-2667, 2009

3. Matsuda K., Ohga N., Hida Y., Muraki C., Kurosu T., Tsuchiya K., Akino T., Shih  SC, Totsuka Y., Klagsbrun M., Shindoh M. and Hida K*.：Isolated tumor endothelial cells maintain specific character during long-term culture, Biochem Biophys Res Commun, 394, 947-954, 2010

4. Muraki C., Ohga N., Hida Y., Nishihara H., Kato Y., Tsuchiya K., Matsuda K., Totsuka Y., Shindoh M. and Hida K*.: Cyclooxygenase-2 inhibition causes antiangiogenic effects on tumor endothelial and vascular progenitor cells, Int J Cancer, in press, 2011

5. Kurosu T., Ohga N., Hida Y., Maishi N., Akiyama K., Kakuguchi W., Kuroshima T., Kondo M., Akino T., Totsuka Y., Shindoh M., Higashino F. and Hida K*.: HuR keeps an angiogenic switch on by stabilizing mRNA of VEGF and COX-2 in tumor endothelium,  Br J Cancer, in press, 2011

メカニカルストレス誘導性グルタミン酸シグナルによる歯根膜細胞の分化制御

山田　聡
大阪大学大学院歯学研究科　口腔分子免疫制御学講座
歯周病分子病態学　歯周病診断制御学

歯根膜は、硬組織である歯槽骨とセメント質との間に存在するコラーゲン線維に富む非石灰化の結合組織である。我々はこれまでに、様々な因子が歯根膜細胞の硬組織形成分化を制御することにより、歯周組織の恒常性維持並びに同組織の再生過程に関与していることを明らかとしている。一方、生体内において歯根膜は咬合力というメカニカルストレスを常に受けており、歯根膜の特性、機能を考える上で、メカニカルストレスの影響を無視することはできない。そこで本研究では、DNAマイクロアレイを用いてメカニカルストレス（伸展刺激）存在下におけるヒト歯根膜細胞の網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、興味深いことにグルタミン酸関連分子の遺伝子発現の上昇が見出された。詳細な解析を行ったところ、ヒト歯根膜細胞は、恒常的にグルタミン酸関連遺伝子を発現しており、メカニカルストレスによりその発現は上昇し、グルタミン酸の放出が誘導された。歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化過程においてもグルタミン酸の産生が上昇し、グルタミン酸あるいは阻害薬の添加実験から、グルタミン酸シグナルは、歯根膜細胞の硬組織形成分化を促進することが明らかとなった。さらに、マウス矯正モデルにおいて伸展側の歯根膜にグルタミン酸関連分子の遺伝子発現が著明に誘導されることが示された。以上の結果から、メカニカルストレスにより誘導されるグルタミン酸シグナルは、歯根膜細胞の硬組織形成分化を正に制御することで、in vivoにおける歯根膜の組織恒常性維持、リモデリング、組織再生に関与している可能性が示唆された。

参考文献
1. Fujihara C, Yamada S, Ozaki N, Takeshita N, Kawaki H, Takano-Yamamoto T, Murakami S. Role of mechanical stress-induced glutamate signaling-associated molecules in cytodifferentiation of periodontal ligament cells. J Biol Chem 285:28286-28297, 2010.

2. Tomoeda M, Yamada S, Shirai S, Ozawa Y, Yanagita M, Murakami S. PLAP-1/asporin inhibits activation of BMP receptor via its leucine rich repeat motif. Biochem. Biophys. Res. Commun. 371(2), 191-6, 2008.

3. Yamada S, Tomoeda M, Ozawa Y, Yoneda S, Terashima Y, Ikezawa K, Ikegawa S, Saito M, Toyosawa S, Murakami S. PLAP-1/asporin, a novel negative regulator of periodontal ligament mineralization. J Biol Chem. 282(32), 23070-80, 2007.

健康指標としての口腔常在フローラの生態系バランスの評価

竹下　徹
九州大学大学院歯学研究院口腔予防医学分野

口腔には膨大な数の細菌が存在し、複雑な相互作用に基づく微生物生態系を構築している。 このような環境を背景として発症する口腔感染症の予防・治療を考えるうえでは病原細菌の排除だけでなく、健康な常在フローラの育成というアプローチも有効な戦略となりうる。しかしながら目指すべき口腔常在フローラ像は未だ明らかであるとは言い難い。そこで本研究では口臭を対象として、その重篤度と口腔フローラとの関連について検討を行った。口臭外来受診者240名から唾液を採取し、含まれる細菌群集を16S rRNA遺伝子を用いた分子生物学的手法によって解析したところ、低口臭型、硫化水素高産生型、メチルメルカプタン高産生型の構成パターンが認められた。どのパターンの細菌群集においても、構成する主な細菌属は共通である一方で比率分布が大きく異なっており、低口臭型ではStreptococcus、Granulicatella、硫化水素型ではNeisseria、 Fusobacterium、Porphyromonas、メチルメルカプタン型ではPrevotella、Veillonellaが他に比べ優勢であった。本研究の結果から、口腔における常在細菌の構成バランスは口腔の状態と関連しており、健康を評価する指標となることが示唆された。

参考文献
1. Takeshita T, Suzuki N, Nakano Y, Shimazaki Y, Yoneda M, Hirofuji T, Yamashita Y.: Relationship between oral malodor and the global composition of indigenous bacterial populations in saliva. Appl Environ Microbiol. 76: 2806-2814 2010.

2. Takeshita T, Tomioka M, Shimazaki Y, Matsuyama M, Koyano K, Yamashita Y. Microfloral characterization of tongue coating and associated risk for pneumonia-related health problems in the institutionalized elderly. J Am Geriatr Soc. 58: 1050-1057 2010. 

3. Nakano Y, Takeshita T, Yasui M, Yamashita Y. Prediction of plausible bacterial composition based on terminal restriction fragment length polymorphism using a Monte Carlo method. Microb Ecol. 60 (2): 364-372 2010.

4. Takeshita T, Nakano Y, Kumagai T, Yasui M, Kamio N, Shibata Y, Shiota S, Yamashita Y. The ecological proportion of indigenous bacterial populations in saliva is correlated with oral health status. ISME J. 3 (1): 65-78 2009..