第12回演題

演題

第12回口腔医科学フロンティア開催

演題1

GSK-3と創薬 ―がん、心不全、骨疾患の新規治療法を探る―

高橋富美

九州大学大学院医学研究院国際医科学教育ユニット

　グリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）-3は、糖代謝に関連するセリン/スレオニンリン酸化酵素として見出されたが、現在では種々の細胞機能調節に関与することが知られている。GSK-3の基質は多岐にわたっているため、この酵素に作用する薬物は様々な疾患の治療に使える可能性がある。我々は、GSK-3活性を亢進する薬物をがんや心不全の治療に、抑制する薬物を骨疾患の治療に応用できるのではないかと考えている。
　GSK-3は恒常的活性化が発がんの引き金となるWnt/β-カテニン経路を負に調節する。我々は、細胞性粘菌由来分化誘導因子DIFのがん細胞増殖抑制作用機序について検討を行い、GSK-3の活性化がこの物質の作用基盤であることを見出した。がんモデルマウスへの経口投与により、GSK-3の活性化を介して抗がん作用を示すことを確認しており、この物質の新規経口抗腫瘍薬としての可能性を検討中である。GSK-3は心肥大シグナルを抑制する中心分子でもある。そこで、GSK-3を活性化するセレコキシブとジメチルセレコキシブを拡張型心筋症モデルマウスに投与したところ、両薬物とも心肥大を抑制し生命予後を改善した。また、前述のWnt/β-カテニン経路は、骨芽細胞の分化を促進させるため、GSK-3阻害剤には骨形成促進作用が期待できる。そこで、骨欠損部の再生をみる動物実験を行ったところ、GSK-3阻害剤である炭酸リチウムの局所投与は骨再生を有意に促した。この結果に基づき、歯科インプラントに関連した臨床試験を行っている。

参考文献

1. Takahashi-Yanaga F . Activator or inhibitor? GSK-3 as a new drug target. Biochem Pharmacol. 86(2): 191-199, 2013
2. Fan X, Takahashi-Yanaga F, Morimoto S, et al.Celecoxib and 2,5-dimethyl- celecoxib prevent cardiac remodeling inhibiting Akt-mediated signal transduction in an inherited DCM mouse model. J Pharmacol Exp Ther. 338(1):2-11, 2011
3. Arioka M, Takahashi-Yanaga F, Sasaki M, et al. Acceleration of bone development and regeneration through the Wnt/β-catenin signaling pathway in GSK-3β^+/- mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 440(4), 677-682, 2013

演題2

DNA再複製抑制因子Gemininの細胞周期依存的なユビキチン分解制御機構

常松貴明

徳島大学大学院HBS研究部口腔分子病態学分野

　染色体を正確かつ、一度だけ複製することは生命の恒常性を維持するための基本的な現象である。DNAの過剰な複製(再複製)が生じると、DNA損傷や染色体異常を誘導し、細胞の癌化をもたらす要因となると考えられている。再複製抑制機構において、細胞周期依存的な複製起点のライセンス化(複製前複合体形成)と呼ばれる現象が中心的な役割を果たし、ライセンス化因子CDT1(Chromatin licensing and DNA replication factor1)とその抑制分子であるGemininのユビキチン化を介したタンパク分解(ユビキチン分解)によるタンパク量のコントロールによって厳密に制御されているが、その詳細は未だ不明な点が多い。最近、我々は分裂期におけるGemininのユビキチン分解制御がCDT1のタンパク安定化を介して複製前複合体(pre-RC)形成に重要であることを見出し、DNA複製に必須の機構であることを明らかにした。現在はCDT1のユビキチン分解制御機構に関して、さらなる検討を行っている。

参考文献

1. Nguyen PT, Tsunematsu T, Yanagisawa S, Kudo Y, Miyauchi M, Kamata N, Takata T. The FGFR-1 inhibitor PD173074 induces mesenchymal-epithelial transition through the transcription factor AP-1. Br J Cancer, 2013.
2. Tsunematsu T, Takihara Y, Ishimaru N, Pagano M, Takata T, Kudo Y. Aurora-A controls pre-replicative complex assembly and DNA replication by stabilizing geminin in mitosis. Nat Commun 4:1885, 2013.
3. Shimizu N, Nakajima N, Tsunematsu T, Ogawa I, Kawai H, Hirayama R, Fujimori A, Yamada A, Okayasu R, Ishimaru N, Takata T, Kudo Y. Selective enhancing effect of Early mitotic inhibitor 1 depletion on the sensitivity of doxorubicin or X-ray treatment in human cancer cells. J Biol Chem 288:17238-52, 2013.
4. Kudo Y, Tsunematsu T, Takata T. Deregulation of anaphase promoting complex/cyclosome dependent proteolysis in cancer. J Oral Biosci 52:388-401, 2010.
5. Tsunematsu T, Kudo Y, Iizuka S, Ogawa I, Fujita T, Kurihara H, Abiko Y, Takata T. RUNX3 has an oncogenic role in head and neck cancer. PLoS One 4:e5892, 2009.

演題3

GABA受容体を介した気管支喘息制御機構

水田健太郎

東北大学大学院歯学研究科歯科口腔麻酔学分野

　吸入麻酔薬及び静脈麻酔薬は、主に中枢神経系のGABA_A受容体を介して中枢抑制作用を及ぼすとされる。これらの全身麻酔薬は、用量依存性に気管拡張作用をもたらすことが臨床的に知られており、周術期の気管支喘息発作や重度の気管支喘息発作時の治療に利用されてきたが、その作用は神経系を介した反応であると推測されてきた。
　近年、GABA_A受容体が、中枢神経系のみならず末梢組織にも存在することが、次第に明らかとなってきた。そこで我々は、GABA_A受容体の気管平滑筋自体における発現、及びGABA_A受容体を介した気管平滑筋収縮抑制機構について検討した。その結果、気管平滑筋におけるGABA_A受容体の存在が確認された。また、GABA_A受容体作動薬投与により、各種神経伝達物質誘発性の気管平滑筋収縮作用が抑制されること、またGABA_A受容体作動薬は、アドレナリンβ受容体作動薬投与より生じる気管平滑筋弛緩作用を増強することを見いだした。以上より、気管平滑筋に存在するGABA_A受容体は、気管平滑筋収縮作用の抑制に有効な標的となりうることが明らかとなった。
一方、選択的GABA_B受容体作動薬の投与は、気管支喘息患者の症状を悪化させるとされてきた。この機序についても検討を加えた結果、GABA_B受容体も気管平滑筋及び気道上皮に発現すること、またこれらの領域に発現するGABA_B受容体は、気管平滑筋及び気道上皮におけるERKリン酸化や気管平滑筋収縮作用など、気道に対し負の作用をもたらすことが明らかとなった。

参考文献

1. Mizuta K, Zhang Y, Xu D, Mizuta F, D'Ovidio F, Masaki E, and Emala CW. The dopamine D1 receptor is expressed and facilitates relaxation in airway smooth muscle. Respir. Res., 14: 89, 2013.
2. Mizuta K, Zhang Y, Xu D, Masaki E, Panettieri RA Jr, and Emala CW. The dopamine D2 receptor is expressed and sensitizes adenylyl cyclase activity in airway smooth muscle. Am J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 302: L316-324, 2012.
3. Mizuta K, Mizuta F, Xu D, Masaki E, Panettieri RA Jr, and Emala CW. Gi-coupled γ-aminobutyric acid-B receptors cross-regulate phospholipase C and calcium in airway smooth muscle. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 45:1232-1238, 2011.
4. Mizuta K, Xu D, Pan Y, Comas G, Sonett JR, Zhang Y, Panettieri RA Jr, Yang J, and Emala CW Sr. GABAA receptors are expressed and facilitate relaxation in airway smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 294: L1206-1216, 2008.
5. Mizuta K, Osawa Y, Mizuta F, Xu D, and Emala CW. Functional expression of GABA_B receptors in airway epithelium. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 39: 296-304, 2008.

演題4

間葉系幹細胞の骨組織分化過程における造血幹細胞の作用について

菊入崇

北海道大学大学院歯学研究科・歯学部・小児障害者歯科学教室

幹細胞を用いた再生医療はゲノム治療と共に今後もっとも期待される医療技術であり、歯科医療においても劇的に治療を変える可能性を秘めています。骨髄中に存在している間葉系幹細胞は、多分化能を有する可塑性の高い体性幹細胞であり、骨芽細胞への高い分化能力を有しているため、骨組織再生における幹細胞ソースとして極めて有用であることが知られています。しかし、移植した間葉系幹細胞がどのような制御を受け骨芽細胞へ分化するのか、その機構は明らかになっていません。この骨芽細胞への分化制御を明らかにすることが出来れば、効率よく骨組織を再生することが可能となります。そこで演者らは、「間葉系幹細胞における骨芽細胞への分化が、造血幹細胞によって制御されている」という仮説のもとで、間葉系幹細胞の分化過程における造血幹細胞の影響について検討しました。その結果、マウスにおける細胞移植実験において、間葉系幹細胞のみを移植した場合と比べて、間葉系幹細胞と造血幹細胞を同時に移植した場合では、多くの新生骨が形成されることが判明しました。一方、間葉系幹細胞は造血幹細胞のニッチを構成する一員であることが報告されています。今回の実験結果は、造血幹細胞からニッチへの逆行性のシグナルが存在することを示唆したものと思われます。本発表では、造血幹細胞を併用した骨組織の再生法の可能性についてお話させていただきます。

参考文献

1. Yi L, Lei W, Kikuiri T, Akiyama K, Chider C, Xingtian X, Ruili Y, WanJun C, Songtao S. Mesenchymal stem cell-based tissue regeneration is governed by Recipient T lymphocyte via IFN-gamma and TNF-alpha. Nature Medicine 17:1594-1600,2011.
2. Kikuiri T, Kim I, Yamaza T, Akiyama K, Qunzhou Z, Yunsheng L, WanJun C, Songlin W, Anh-D L, Songtao S. Cell-based Immunotherapy with Mesenchymal Stem Cells Cures Bisphosphonate-Related Osteonecrosis of the Jaw-like Disease in Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 25:1668-1679,2010.
3. Seo B M, Sonoyama W, Yamaza T, Coppe C, Kikuiri T, Akiyama K, Lee J S, Songtao S. SHED repair critical-size calvarial defects in mice. Oral Diseases. 14:428-434,2008.

演題5

Ex vivoライブイメージングからアプローチする骨細胞の細胞応答

石原嘉人¹, 上岡寛¹, 山城隆²

¹岡山大学大学院医歯薬学総合研究科歯科矯正学分野
²大阪大学大学院歯学研究科顎顔面口腔矯正学教室

　骨細胞は、力学的負荷を感受し、応答することで組織としての恒常性を規定するメカノセンサーとしての役割が古くから提唱されている。そして、骨細胞と骨表面上の骨芽細胞や破骨細胞との3次元的な細胞間コミュニケーションを介した情報伝達が、その調節機構に中心的役割を担うと想定されてきた。しかしながら、骨細胞の細胞応答に関する骨組織中での動態は細胞周囲の骨基質が障壁となるため解明されておらず、過去の研究の多くは、2次元的な培養細胞上での帰結であった。そこで我々は、蛍光イメージングを用い、生きた骨組織中で営まれる骨細胞の細胞応答をリアルタイムに検討する実験系を構築し、その動態および調節機構についてアプローチを行なった。その結果、細胞間情報伝達系の一つであるギャップ結合(GJ)を介した骨細胞間コミュニケーションの可視化に成功し、それが細胞外pHおよび細胞外Ca²⁺という骨リモデリング時の変動因子、およびPTHによって調節を受ける事を解明した。次に、細胞内Ca²⁺を指標とする細胞応答について時空間的解析を試み、骨組織中の骨細胞および骨芽細胞に自律性のCa²⁺オシレーションが存在する事を見出した。力学的負荷は、その応答率と反応頻度を上昇させた。GJ阻害剤を前投与した場合のCa²⁺オシレーションは、骨細胞では応答率および反応頻度において顕著な減少を来したのに対し、骨芽細胞では反応頻度においてのみ減少を認めた。これらの結果より、骨組織への力学的負荷に対する細胞応答には, 細胞種による差異があることが示された。また、骨細胞でのCa²⁺応答にGJが深く関与している可能性が示唆された。本研究で示した実験系は、3次元的な生体システムおよび微小環境を維持しており、得られた結果は生体をより反映したでものであると考えられる。

参考文献

1. Ishihara Y, Sugawara Y, Kamioka H, Kawanabe N, Hayano S, Balam TA, Naruse K, Yamashiro T. Ex vivo real-time observation of Ca²⁺ signaling in living bone in response to shear stress applied on the bone surface. Bone. 53:204-15, 2013
2. Ishihara Y, Sugawara Y, Kamioka H, Kawanabe N, Kurosaka H, Naruse K, Yamashiro T. In situ imaging of the autonomous intracellular Ca²⁺ oscillations of osteoblasts and osteocytes in bone. Bone. 50:842-52, 2012
3. Ishihara Y, Kamioka H, Honjo T, Ueda H, Takano-Yamamoto T, Yamashiro T. Hormonal, pH, and calcium regulation of Connexin 43 mediated dye transfer in osteocytes in chick calvaria. J Bone Miner Res. 23:350-60, 2008
4. Kamioka H, Ishihara Y, Ris H, Murshid SA, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T, Lim SS. Primary cultures of chick osteocytes retain functional gap junctions between osteocytes, and between osteocytes and osteoblasts. Microscop Microanal. 12:108-17, 2007
5. Kamioka H, Sugawara Y, Murshid SA, Ishihara Y, Honjo T, Takano-Yamamoto T. Fluid shear stress induces less calcium response in a single primary osteocyte than in a single osteoblast: Implication of different focal adhesion formation. J Bone Miner Res. 21:1012-21, 2006

演題6

乳酸トランスポーターMCT-1による軟骨細胞死の制御

吉村健太郎，宮本洋一，上條竜太郎

昭和大学歯学部口腔生化学講座

　変形性関節症などの軟骨変性疾患において、炎症性サイトカインが活性酸素種（ROS）の産生を誘導し、軟骨細胞死に関与することが指摘されている。我々は、IL-1βによって刺激されたマウスおよびラットの軟骨細胞において、ROS産生に依存した細胞死が起こることを観察した。さらに、マクロファージや好中球などの食細胞におけるROS産生に特化した酵素と考えられて来た食細胞型NADPH-oxidase (NOX-2)が、IL-1βで刺激したマウス軟骨細胞で発現することを見出した。NOX-2の発現をsiRNAにより抑制したところ、IL-1β誘導性軟骨細胞死が著明に抑制されたことから、IL-1βで刺激した軟骨細胞におけるROSの産生源はNOX-2であり、NOX-2由来のROSが細胞死に重要な役割を果たすことが明らかとなった。そこで、軟骨細胞におけるIL-1βによるNOX-2発現誘導のメカニズムを解析した。まず、IL-1β刺激したマウス軟骨細胞様ATDC5細胞で、NOX-2発現に先立ち、乳酸産生の亢進とミトコンドリアにおけるエネルギー代謝の上昇が示唆された。そこで、ミトコンドリア内膜に存在し、乳酸・ピルビン酸の取り込みを担うmonocarboxylate transporter-1 (MCT-1)のsiRNAを導入したところ、IL-1βによるNOX-2発現誘導が消失した。また、IL-1β刺激したATDC5細胞では、刺激直後のNF-κB活性化に加え、刺激後36時間以降に再びNF-κBの活性化が観察され、MCT-1 siRNAはこの後期NF-κB活性化を抑制した。また、IL-1β刺激16時間以内にROS産生のわずかな上昇が認められたが、MCT-1 siRNAはこれも抑制した。また、IκK阻害剤およびIκBα super repressorの導入によってNOX-2発現は抑制された。以上より、IL-1βで産生が亢進した乳酸がMCT-1を介してミトコンドリアに取り込まれ、電子伝達系由来のROS産生を高めることで後期NF-κB活性化を起こし、その結果、NOX-2の発現とそれに依存した細胞死を誘導したと考えられる。今回の結果は、MCT-1による遺伝子発現調節に関する初めての知見であるばかりでなく、MCT-1が軟骨変性抑制の新たな標的となる可能性を示唆するものである。

参考文献

1. Yoshimura K, Miyamoto Y, Yasuhara R, Maruyama T, Akiyama T, Yamada A, Takami M, Suzawa T, Tsunawaki S, Tachikawa T, Baba K, Kamijo R.Monocarboxylate transporter-1 is required for cell death in mouse chondrocytic ATDC5 cells exposed to interleukin-1beta via late phase activation of nuclear factor kappaB and expression of phagocyte-type NADPH oxidase. J Biol Chem. 2011 Apr 29;286(17):14744-52.

演題7

骨が指揮する多臓器間協奏曲

佐藤　真理

北海道大学大学院歯学研究科口腔先端融合科学

　骨と造血は切っても切れない関係である。しかしながら骨細胞による造血への影響はいまだ明らかではない。我々はDMP-1遺伝子プロモーター下でジフテリア毒受容体を発現させたマウスにジフテリア毒を投与することで、骨細胞だけにダメージを与えたマウス(Osteocyte-less mouse = OLマウス)を得て全身造血への影響を解析した。OLマウスの骨髄では、骨髄微小環境異常によりBリンパ球分化が著しく障害されていた。さらにTリンパ球分化の場である胸腺が激しく萎縮しており、Tリンパ球分化が障害されていた。野生型マウスとOLマウスを結合させ、野生型マウスから血中液性因子を持続的に供給させてもOLマウスの胸腺萎縮ならびにTリンパ球分化異常は防げないことから、骨細胞は遠隔臓器である胸腺の微小環境を、液性因子を介さずに制御していることが示唆された。そればかりではなく、OLマウスでは脂質代謝異常も観察される。OLマウスの白色脂肪は全身で消失しており、脂質代謝制御に関連する部位である視床下部腹内側核(VMH)および弓状核(Arc)を破壊したところ、OLマウスの白色脂肪消失は防げなかったが、肝臓だけには著しく脂肪が蓄積して激烈な脂肪肝を呈した。これは、肝臓における脂肪排出に関連する遺伝子発現の低下によるものであり、骨細胞は脳と協調して肝臓からの脂肪排出を制御していることが示唆された。本研究から、骨細胞は一次リンパ組織である骨髄と胸腺の造血微小環境を制御し、全身の脂質代謝に関しては、一部、脳と協調して制御することが明らかとなった。

参考文献

1. Sato M, Asada N, Kawano Y, Wakahashi K, Minagawa K, Kawano H, Sada A, Ikeda K, Matsui T, Katayama Y. Osteocytes regulate primary lymphoid organs and fat metabolism. Cell Metabolism, 18(5): 749-58, 2013
2. Asada N, Katayama Y, Sato M, Minagawa K, Wakahashi K, Kawano H, Kawano Y, Sada A, Ikeda K, Matsui T, Tanimoto M.Matrix-embedded osteocytes regulate mobilization of hematopoietic stem/progenitor cells. Cell Stem Cell, 12(6): 737-47, 2013